Tóm tắt Luận án Nghiên cứu vai trõ điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua

gồm sự photphoryl hóa IκB-α, STAT1 và STAT3. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Protein A20 Protein A20 (hay còn được gọi là TNFAIP3 - tumor necrosis factor a-induced protein 3 - protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3) là protein ức chế phản ứng viêm chống lại các tác nhân gây viêm. Protien A20 có chiều dài 790 acid amin và khối lượng phân tử 89,6 kDa. Protein A20 đóng vai trò là chất điều hoà của phản ứng miễn dịch trung gian thông qua kích hoạt yếu tố phiên mã kappa B (nuclear factor kappa B - NF-κB). Protein A20 được mã hóa bởi gen A20, gen này được đặt tên theo số bản sao cDNA, được xác định là gen cảm ứng với TNF trong các tế bào nội mô. Gen A20 chứa 15.869 bp bao gồm 9 exon và 8 intron. Trong đó, exon 1, đầu 5’ của exon 2 và đầu 3’ của exon 9 không mã hoá protein. Độ dài của mRNA là 4.446 bp, trình tự mã hóa (coding sequence - CDS) từ vị trí 67 đến 2439. Các nghiên cứu trước đây về chức năng protein A20 đã chỉ ra rằng A20 ngăn chặn phản ứng viêm thông qua ức chế tín hiệu phân 4 tử NF-κB. Nghiên cứu in vivo về vai trò của protein A20 cho thấy chuột bị knock-out A20 quá mẫn cảm với TNF, chết sớm do viêm đa cơ quan nghiêm trọng và chứng suy nhược do tín hiệu thụ thể TLR phản ứng với vi khuẩn cộng sinh. Protein A20 có vai trò rất quan trọng trong điều hoà hệ thống miễn dịch thông qua tác động đến các tế bào miễn dịch khác nhau như TBT, tế bào B, tế bào T và các đại thực bào. Vì vậy, bất hoạt gen A20 có thể là một chiến lược để nâng cao hiệu quả phòng và điều trị bệnh dựa trên TBT đối với bệnh ung thư và các bệnh truyền nhiễm. Trên thực tế, TBT thiếu hụt protein A20 tạo ra đáp ứng miễn dịch kháng thể đặc biệt tốt hơn so với các TBT kiểu hoang dại. Gen A20 như là một locus nhạy cảm đối với các bệnh lý tự miễn, bao gồm: viêm khớp dạng thấp, viêm khớp tự phát, ban đỏ lupus, viêm đại tràng, bệnh vẩy nến, bệnh tiểu đường tuýp I, và bệnh đa xơ cứng. Hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động và quy định của gen A20 có thể tạo cơ sở cho sự phát triển của phương pháp trị liệu kháng viêm mới. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra A20 là protein điều hòa ngược hoạt động và sự biệt hóa của tế TBT thông qua các tín hiệu phân tử như NF-кB, STATs. Sự gắn kết giữa thụ thể toll-like receptors TLRs trên bề mặt tế bào với các phối tử đặc hiệu của chúng bao gồm các kháng nguyên xuất phát từ vi khuẩn, các cytokine gây viêm, các yếu tố phóng xạ kích hoạt tín hiệu phân tử này. Bất thường về di truyền của gen A20 xảy ra trong những bệnh nhân ung thư máu như đột biến gen hoặc mất đoạn gen hoặc bất hoạt gen. 1.2. Tế bào tua (TBT) Tế bào tua (Dendritic cells - TBT) là các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp (antigen-presenting cells - APCs) để 5 tạo ra các phản ứng miễn dịch. Các TBT kết hợp và truyền thông tin từ môi trường bên ngoài đến các tế bào của hệ thống miễn dịch. TBT không chỉ quan trọng trong việc tạo ra các phản ứng miễn dịch bẩm sinh, miễn dịch tập nhiễm mà còn điều chỉnh các loại đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào T. Gần đây, y học hiện đại đã áp dụng các phương pháp trị liệu miễn dịch dựa trên TBT để chống lại ung thư và các bệnh truyền nhiễm. Các TBT dễ dàng tiếp xúc với nhiều loại kháng nguyên ngoại sinh do TBT có mặt trong các cơ quan lympho như: lách và hạch bạch huyết, biểu mô da, các ống tiêu hóa, hô hấp và trong dịch kẽ của hầu hết các cơ quan nhu mô. Đặc điểm hình thái quan trọng của TBT là sự hiện diện của lớp màng được trải ra từ thân tế bào chính, tương tự như các tua (dendrites) trên nơ-ron nên được đặt tên là dendritic cells, bắt nguồn từ chữ “Dendron” trong tiếng Hy Lạp, nghĩa là cây. TBT được chia làm hai nhóm bao gồm: TBT dòng lympho có nguồn gốc từ cơ quan lympho (DC plasmacytoid - pDC) và TBT dòng tuỷ (classical DC - cDC). Tế bào dòng tủy cDC được phân chia thành hai tập hợp con là CD8+DC và CD11b+DC có mức độ biểu hiện các loại thụ thể TLR khác nhau, do đó đóng vai trò khác nhau trong khả năng tương tác với mầm bệnh. TBT có hai chức năng chính là trình diện kháng nguyên và điều hoà miễn dịch. Các quá trình sinh lý TBT đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thống miễn dịch, bao gồm biệt hoá, trưởng thành, di cư, thực bào, tiết cytokine và apoptosis. Có rất nhiều loại tín hiệu phân tử tham gia kích hoạt TBT như: PI3K, MAPK, NF-кB và STAT. Trong đó, NF-кB và STAT có liên quan chặt chẽ đến hoạt động viêm trong bệnh tự miễn và ung thư. Hiện nay, trong y học người ta đã nghiên cứu và ứng dụng các loại 6 thuốc ức chế NF-кB và STAT để phục vụ điều trị các loại bệnh mãn tính và ác tính, vì gen A20 tham gia điều hòa hoạt động, mức độ thuần thục và sự biệt hóa của tế bào thông qua hoạt động của các tín hiệu phân tử như NF-кB và STAT. Trên thế giới, liệu pháp vắc xin TBT đã được thử nghiệm điều trị cho nhiều bệnh nhân ung thư hắc tố, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thận... Ở Việt Nam, phòng thí nghiệm tế bào gốc Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc Gia HCM đã và đang triển khai nghiên cứu sử dụng liệu pháp TBT trong điều trị ung thư vú. Tuy nhiên, đây chỉ là bước thử nghiệm trong PTN, chưa thể áp dụng vào thực tế chữa bệnh trên bệnh nhân. Những tiến bộ đáng kể trong sự hiểu biết về sinh học TBT đã mở ra con đường cho sự phát triển của các phác đồ điều trị bệnh trong y học. Vì vậy, có thể hy vọng rằng đây sẽ là liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả. CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Tế bào tua được phân lập và nuôi cấy từ tế bào tủy xương ở chuột BALB/c. Chuột BALB/c được cung cấp bởi công ty Taconic Farms (Hudson, New York, USA). Chuột được nuôi theo đúng quy trình thí nghiệm, thực hiện theo luật pháp Việt Nam về động vật và được phê duyệt bởi Hội đồng đạo đức của Viện nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tế bào tủy xương ở chuột BALB/c được sử dụng hóc môn sinh trưởng GM-CSF để biệt hóa thành tế bào CD11b+DC hoặc FLT3 để biệt hóa thành 3 quần thể tế bào tua là CD8+DC, CD11b+DC và pDC tùy thuộc mục đích của thí nghiệm. Các TBT được nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm tiêu chuẩn tại Viện nghiên cứu hệ gen. 7 2.2. Các hoá chất Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm TRIzol™ Plus RNA Purification Kit; Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent; IL-6, IL-10, IL-12p70, TNF-α, INF- γ Mouse ELISA Kit; kháng thể mouse IgG isotype control, anti-mouse CD11c, anti-mouse CD86, anti-mouse CD40 và anti-mouse I-A/I-E.. đều là các hóa chất đạt tiêu chuẩn quốc tế được cung cấp bởi các hãng có uy tín như: Thermo, Sigma, Invitrogen, Gibco, 2.3. Thiết bị nghiên cứu Các thiết bị được sử dụng cho nghiên cứu bao gồm tủ an toàn sinh học cấp 2, kính hiển vi huỳnh quang, máy phân tích tế bào học dòng chảy Flow cytometry, bộ dụng cụ Western blot, máy đọc ELISA và các thiết bị chuyên dụng khác tại Viện nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam và Học viện Quân Y. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu  Nuôi cấy và biệt hoá TBT: Tế bào tủy xương được phân lập từ xương khớp đùi của chuột BALB/c. Sử dụng hóc môn GM-CSF (35 ng/ml) vào ngày thứ 3 và thứ 6 để biệt hoá thành CD11b+DC (hoặc ngày thứ 8 bổ sung FLT3 (200 ng/ml) để biệt hoá thành 3 loại TBT.  Phương pháp đưa phân tử siRNA đặc hiệu gen đích A20 vào trong các TBT nhằm bất hoạt gen A20.  Kỹ thuật Western blot đánh giá sự phosphoryl hoá phân tử tín hiệu κBα, STAT-1 (727), và p-STAT-3 dựa vào việc phát hiện phức hợp kháng thể đặc hiệu - protein được gắng trên màng.  Kỹ thuật ELISA đo nồng độ các cytokine IL-6, IL-10, IL-12p40, TNF-α và IFN-γ tiết ra bởi TBT của nhóm chứng và nhóm bất hoạt A20 và so sánh sự khác biệt giữa 2 nhóm này. 8  Phương pháp đếm tế bào theo dòng chảy (Flow cytometry) đo biểu hiện các marker trưởng thành MHC II, CD86 và CD40 và phân tích quá trình apoptosis thông qua Annexin V, 7-AAD và Caspase-3.  Phương pháp xác định sự di cư tế bào để xác định tỉ lệ TBT di cư và so sánh giữa nhóm bất hoạt A20 và nhóm chứng.  Phân tích số liệu CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. Nghiên cứu vai trò của gen A20 trong việc điều hoà các chức năng sinh lý TBT 3.1.1. Kết quả bất hoạt gen A20 trong TBT Sau khi bất hoạt gen A20 trong TBT, tiến hành kiểm tra và so sánh mức độ biểu hiện của protein A20 trong tế bào bất hoạt và tế bào nhóm chứng bằng Western blot, kết quả như hình 3.1. Hình 3.1. Kết quả biểu hiện protein A20 sau khi đưa A20-siRNA vào tế bào tua Kết quả trên hình ảnh Western blot cho thấy sau khi đưa phân tử A20-siRNA vào TBT, biểu hiện protein A20 đã bị bất hoạt gần như hoàn toàn so với nhóm chứng (control siRNA). Các băng chứng (GAPDH) đều bắt màu đậm rõ nét, có kích thước tương đồng nhau ở các giếng. Kết quả này đã khẳng định rằng sau khi đưa A20-siRNA vào TBT, biểu hiện protein A20 đã bị bất hoạt. 3.1.2. Vai trò của protein A20 đối với sự trƣởng thành TBT 9 Từ TBT tuỷ xương chuột, sau khi nuôi cấy và biệt hoá bởi FLT3 tạo thành 3 tập hợp là CD8+DC, CD11b+DC và pDC. Mỗi tập hợp này được thiết kế thành nhóm bất hoạt A20 bằng siRNA-A20 và nhóm chứng không bất hoạt. Kết quả so sánh biểu hiện các marker bề mặt MHC II, CD86 và CD40 giữa nhóm bất hoạt gen A20 và nhóm chứng của CD8+DC và CD11b+DC đều không có sự khác biệt. Như vậy, A20 không ảnh hưởng đến sự trưởng thành của CD8+DC và CD11b + DC, tuy nhiên, protein A20 ức chế sự trưởng thành của pDC. Hình 3.2. Ảnh hưởng của A20 đối với sự trưởng thành của pDC Khi tế bào thiếu hụt protein A20, biểu hiện của MHC II và CD40 trên các tế bào pDC trưởng thành được xử lý với TgPRF tăng hơn nữa, nhưng biểu hiện của CD86 thì không tăng. Biểu đồ FACS chỉ ra rằng gen A20 chống lại biểu hiện của marker bề mặt MHC II và CD40 trên tế bào pDC. Như vậy, protein A20 đã ức chế nột phần sự trưởng thành của pDC thông qua ức chế biểu hiện của MHC II và CD40. Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu của Pepper và cộng sự chỉ ra rằng pDC là một tập hợp TBT nổi bật, liên quan đến giai đoạn đầu của nhiễm trùng T. gondii, khả năng trình diện các kháng nguyên ký sinh trùng và sản xuất các cytokine đóng vai trò rất quan trọng để kiểm soát nhiễm trùng. 10 Trong nghiên cứu về vai trò của protein A20 đối với sự trưởng thành của TBT, nhóm của tác giả Nguyễn Thị Xuân và cộng sự đã tiến hành biệt hoá với GM-CSF để thu được TBT là CD11b+DC. Sau khi phơi nhiễm với LPS và so sánh kết quả giữa nhóm TBT bất hoạt A20 và nhóm chứng, biểu hiện của các marker MHC II, CD86 và CD40 đều tăng cường rõ rệt ở nhóm bất hoạt gen A20. Như vậy, thí nghiệm này đã chỉ ra rằng protein A20 đóng vai trò ức chế sự trưởng thành ở nhóm tế bào tua CD11b+DC. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của luận án này, sau khi biệt hoá TBT với FLT3 để thu được CD8 + DC, CD11b +DC và pDC rồi phơi nhiễm 3 nhóm TBT với profilin thì protein A20 chỉ ức chế sự trưởng thành của pDC nhưng không ảnh hưởng đến sự trưởng thành của nhóm tế bào CD8+DC và CD11b +DC. Như vậy, khi phơi nhiễm TBT với các kháng nguyên khác nhau thì vai trò điều hoà của protein A20 đối với sự biểu hiện các marker trưởng thành là khác nhau. 3.1.3. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của TBT 3.1.3.1. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của TBT khi biệt hóa TBT bằng FLT3 và kích hoạt bằng profilin Bất hoạt gen A20 ảnh hưởng đến sự tiết cytokine của nhóm CD11b +DC và pDC nhưng không ảnh hưởng đến nhóm CD8+DC. Hình 3.3. Ảnh hưởng của A20 lên sự tiết cytokine của CD11b+DC khi phơi nhiễm với profilin 11 Kết quả trên cho thấy protein A20 có vai trò ức chế sự sản xuất cytokine IL-6 và TNF-α của nhóm tế bào CD11b+DC. Hình 3.4. Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của pDC khi phơi nhiễm profilin Protein A20 ức chế sự tiết các cytokine IL-6, IL-12p40, TNF-α và IFN-γ khi xử lý với profilin. Bằng chứng này đã chỉ ra rằng A20 ức chế phản ứng viêm ở pDC và một phần phản ứng viêm của CD11b + DC. Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu gần đây của nhóm Cohen và cộng sự đã công bố rằng cytokine IL-12p40 và IFN-γ không được sản xuất bởi CD11b+DC khi nhiễm T. gondii. 3.1.3.2. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của TBT khi biệt hóa TBT bằng GM-CSF và kích hoạt bằng LPS Hình 3.5. Ảnh hưởng của A20 lên sự tiết cytokine của CD11b+DC khi phơi nhiễm LPS 12 Bất hoạt A20 trong CD11b+DC dẫn đến việc sản xuất IL-10 và TNF-α được tăng cường so với nhóm chứng không bất hoạt, nhưng không ảnh hưởng tới sự tiết IL-6. Kết quả này cũng nhất quán với những nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng IL-6 không liên quan đến vai trò điều hoà của gen A20 ở TBT và mức độ của nó trong huyết thanh chuột thậm chí còn thấp hơn ở những con chuột thiếu A20 ở TBT so với chuột nhóm chứng. Ở nhóm thí nghiệm thứ hai này, bất hoạt A20 trong TBT dẫn đến việc sản xuất IL-10 và TNF-α được tăng cường so với nhóm chứng không bất hoạt, nhưng không ảnh hưởng tới sự tiết IL-6. Tuy nhiên, ở nhóm thí nghiệm thứ nhất, khi phơi nhiễm với profilin thì ở nhóm CD11b+DC bất hoạt gen A20 làm tăng tiết IL-6 và TNF-α. Như vậy, sử dụng các kháng nguyên khác nhau để kích thích sự trưởng thành dẫn đến khả năng tiết cytokine khác nhau hay có thể nói là dẫn đến những biểu hiện trưởng thành khác nhau. 3.1.4. Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của TBT 3.1.4.1. Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế TBT khi biệt hóa TBT bằng FLT3 và xử lý bằng profilin Hình 3.6. Ảnh hưởng của protein A20 lên sự di chuyển của các nhóm TBT khi biệt hoá bởi FLT3 và phơi nhiễm profilin Khi thiếu hụt gen A20, việc di chuyển các tế bào pDC được tăng cường hơn so với không bất hoạt, cho thấy việc di chuyển các tế 13 bào pDC bị ức chế bởi sự hiện diện của gen A20. Trong khi đó, hoạt động di chuyển của CD8+DC và CD11+DC không bị ức chế bởi A20. Kết quả này phù hợp với báo cáo trước đây rằng protein A20 tham gia điều hòa việc di chuyển của các tế bào. Khi nghiên cứu biểu hiện của A20 trên ung thư biểu mô tế bào gan HCC, nhóm của Chen H. và cộng sự đã chỉ ra rằng biểu hiện của protein A20 đã tăng lên trong các mô và dòng tế bào HCC. Tăng biểu hiện của protein A20 có tương quan nghịch với kích thước khối u, giai đoạn phát triển, sự hình thành huyết khối khối u, sự xâm lấn và di căn ung thư. 3.1.4.2. Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của TBT khi biệt hóa bằng GM-CSF và kích hoạt bằng LPS Hình 3.7. Ảnh hưởng của protein A20 lên sự di chuyển của các nhóm CD11b + DC khi biệt hoá bởi GM-CSF và phơi nhiễm LPS Ở nhóm CD11b+DC, bất hoạt A20 làm tăng cường khả năng di chuyển khi xử lý với LPS. Tuy nhiên, kết quả này không hoàn toàn khớp với thí nghiệm trước đó khi tiến hành phơi nhiễm với profilin. Điều này lần nữa khẳng định là khi kích thích sự trưởng thành bởi các kháng nguyên khác nhau thì dẫn đến những biểu hiện trưởng thành khác nhau. 3.1.5. Vai trò của protein A20 đối quá trình apoptosis của TBT 14 Hình 3.8. Ảnh hưởng của protein A20 đối với apoptosis thông qua số lượng tế bào phản ứng dương tính với marker Annexin V Sau khi phơi nhiễm với LPS và 1 số cytokine như IL-10, IL-2, TNF-α và INF-γ, so với nhóm tế bào đối chứng, thì nhóm bất hoạt A20 không thể hiện sự khác biệt về phần trăm số tế bào phản ứng dương tính với kháng thể Annexin V và âm tính với 7-AAD. Tương tự như vậy, khi phân tích apoptosis bằng tỉ lệ tế bào dương tính với Caspase-3, kết quả là không có sự khác biệt giữa nhóm bất hoạt A20 và nhóm chứng. Như vậy, trong 2 thí nghiệm này protein A20 không tác động đến quá trình apoptosis của TBT. Tuy nhiên trong một số nghiên cứu khác, nhóm của T. Das và nhóm của Z. Jin, đều chỉ ra rằng A20 đóng vai trò ức chế qua trình apoptosis ở nhiều loại tế bào miễn dịch. Về vai trò của một số cytokine đối với quá trình apoptosis, thông qua cả hai phương pháp khảo sát là phần trăm tế bào dương tính với Annexin V, âm tính với 7-AAD và phần trăm tế bào dương tính với Caspase-3, kết quả đều cho thấy rằng so với nhóm tế bào đối chứng thì nhóm tế bào được xử lý bằng TNF- (10 ng/ml), INF- (10 ng/ml) và IL-2 (30 ng/ml) không thể hiện khác biệt rõ ràng về phần trăm tế bào chết do apoptosis. Trong khi đó IL-10 ở nồng độ 20 ng/ml và 200 ng/ml làm tăng cường quá trình apoptosis. Điều này chỉ ra rằng IL-10 thúc đẩy quá trình apoptosis của TBT, còn các cytokine khác như TNF-, INF-, 15 IL-2 thì không làm tăng cường quá trình này. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng cytokine kháng viêm IL-10 tham gia cảm ứng quá trình apoptosis ở một số loại tế bào khác nhau bao gồm TBT và đại thực bào. Khi sử dụng LPS làm đối chứng, kết quả cũng đều cho thấy rằng A20 không ảnh hưởng đến apoptosis của CD11b+DC. Chính vì thế, chúng tôi không nghiên cứu về ảnh hưởng của protein A20 đến apoptosis của các loại TBT khi phơi nhiễm với profilin. 3.2. Nghiên cứu một số tín hiệu phân tử liên quan đến quá trình sinh lý TBT dƣới vai trò điều hòa của protein A20 3.2.1. Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa IκB-α, STAT1 và STAT3 trong TBT nhóm CD11b+DC khi phơi nhiễm với profilin Hình 3.9. Ảnh hưởng của protein A20 lên con đường tín hiệu IκB-α, STAT1 và STAT3 ở tế bào CD11b+DC khi phơi nhiễm profilin (n=5) Sau khi bị xử lý với TgPRF trong các thời điểm 30, 60, 120 phút, nhóm tế bào CD11b+DC đã bất hoạt gen A20 có sự tăng cường phosphoryl hóa IκB-α so với các nhóm chứng (không bất hoạt A20), nhưng không đạt được ý nghĩa thống kê. 16 Đối với tín hiệu STAT1, bất hoạt gen A20 có sự tăng cường phosphoryl hóa STAT1 so với các nhóm chứng không bất hoạt. Ngoài ra có thể quan sát thấy mức độ tăng cường phosphoryl hoá càng tăng theo thời gian xử lý từ 30, 60 phút nhưng giảm ở thời điểm 120 phút. Như vậy là protein A20 ức chế sự phosphoryl hoá cả phân tử tín hiệu STAT1. Tuy nhiên, biểu hiện của phân tử tín hiệu STAT3 không khác biệt đáng kể giữa nhóm tế bào được xử lý bằng A20-siRNA và nhóm chứng không bất hoạt. Điều này nghĩa là protein A20 không có vai trò điều hoà quá trình phosphoryl hoá phân tử protein STAT3. 3.2.2. Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa IκB-α, STAT1 và STAT3 trong TBT nhóm pDC khi phơi nhiễm với profilin Hình 3.10. Ảnh hưởng của protein A20 lên con đường tín hiệu IκB-α, STAT1 và STAT3 ở tế bào pDC khi phơi nhiễm profilin (n=5) Kết quả trên hình ảnh Western blot cho thấy sau khi xử lý với TgPRF, nhóm pDC bất hoạt A20 có sự tăng cường phosphoryl hóa 17 IκB-α so với các pDC nhóm chứng. Kết quả này đã khẳng định rằng A20 ức chế biểu hiện tín hiệu IκB-α trong tế bào pDC. Tương tự như vậy, khi bất hoạt gen A20, biểu hiện của phân tử p-STAT1 cao hơn so với nhóm chứng control siRNA. Kết quả này đã khẳng định rằng A20 ức chế biểu hiện các tín hiệu STAT1 trong tế bào pDC. Các băng đối chứng (GAPDH) đều bắt màu đậm rõ nét, có kích thước tương đồng nhau ở các giếng. Tuy nhiên, biểu hiện phân tử tín hiệu STAT3 sau khi tế bào pDC xử lý với TgPRF không thay đổi khi các tế bào được xử lý bằng A20-siRNA so với nhóm chứng không bất hoạt A20. Như vậy, A20 không ức chế biểu hiện tín hiệu STAT3 trong tế bào pDC khi phơi nhiễm trưởng thành bởi profilin. 3.2.3. Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa STAT1 và STAT3 trong TBT nhóm CD11b+DC khi xử lý với LPS Hình 3.11. Ảnh hưởng của protein A20 lên con đường tín hiệu IκB-α, STAT1 và STAT3 ở tế bào CD11b+DC khi phơi nhiễm LPS (n=5) 18 Kích thích LPS dẫn đến việc tạo ra các STAT1 bị phosphoryl hóa. So với các tế bào nhóm chứng, bất hoạt gen A20 rõ ràng đã tăng cường biểu hiện của STAT1 bị phosphoryl hóa. Các băng chứng (GAPDH) đều bắt màu đậm rõ nét, có kích thước tương đồng nhau ở các giếng. Kết quả này chỉ ra rằng protein A20 điều hòa âm con đường STAT1 trong các TBT. Tuy nhiên, sau khi kích hoạt LPS, biểu hiện STAT3 tương tự nhau ở cả hai kiểu gen bất hoạt A20 và không bất hoạt. Kết quả này chỉ ra rằng protein A20 không ảnh hưởng đến con đường tín hiệu STAT3 trong các TBT nhóm CD11b+DC khi được xử lý với LPS. Cho đến nay, đã có những công bố về vai trò điều hòa âm của protein A20 đối với tín hiệu NF-κB, tuy nhiên có rất ít nhóm nghiên cứu tập trung đánh giá vai trò của protein A20 trong việc điều chỉnh các chức năng của TBT thông qua các dòng tín hiệu STATs. STATs là họ các protein phiên mã nội bào điều hoà nhiều chức năng khác nhau của tế bào như: sự tăng sinh, sự chết theo chương trình và sự biệt hoá. Sự mất kiểm soát của nhân tố này thường gặp ở các khối u nguyên phát làm tăng cường khả năng sống sót của khối u và ức chế miễn dịch. Các nghiên cứu bất hoạt gen STAT đã cho thấy các protein STAT có liên quan đến chức năng của hệ miễn dịch và đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì khả năng miễn dịch và giám sát khối u. Chuột thiếu hụt gen STAT1 xuất hiện các khối u tự phát nhanh hơn so với nhóm đối chứng. Đột biến gen STAT1 ở người dẫn tới giảm khả năng chống chịu với các bệnh nhiễm trùng. Kết quả nghiên cứu này chỉ ra protein A20 ức chế sự phosphoryl hoá STAT1 ở cả tế bào pDC khi xử lý phơi nhiễm với profilin và tế bào CD11b+DC khi phơi nhiễm LPS/profilin. Tuy nhiên, không ảnh hưởng đến sự phosphoryl hoá STAT3. Kết quả này 19 trùng khớp với một số nghiên cứu gần đây, protein A20 được chứng minh là điều hoà con đường STAT1 trong một số loại tế bào bao gồm tế bào tuỷ xương myeloid hay tế bào ung thư biểu mô gan HCC. Có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra mối tương quan giữa protein A20 và tín hiệu STAT1. Từ năm 1998, Manthey và cộng sự đã chỉ rằng trong bạch cầu đơn nhân, biểu hiện của gen A20 được quy định bởi dòng tín hiệu STAT1 và sau đó nhóm nghiên cứu của De Wilde cũng báo cáo tác dụng ức chế tín hiệu STAT1 của gen A20 trên các tế bào myeloid. 3.2.4. Vai trò của protein A20 đối với một số chức năng sinh lý của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 3.2.4.1. Vai trò của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 Hình 3.12. Ảnh hưởng của A20 lên biểu hiện của marker trưởng thành của pDC thông qua con đường tín hiệu IκB-α và STAT1 20 Vai trò ức chế của protein A20 đối với sự trưởng thành tế bào thông qua biểu hiện của MHC II trên tế bào pDC đều bị giảm khi có fludarabine hoặc chất ức chế IKK. Trong khi đó, biểu hiện của CD40 trên tế bào pDC chỉ bị giảm đáng kể khi chỉ có chất ức chế IKK. 3.2.4.2. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 Hình 3.13. Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 Chất ức chế IKK có vai trò ức chế hoàn toàn sự tăng cường giải phóng của các cytokine IL-6, IL-12p40, TNF-α và IFN-γ trong các tế bào pDC bị bất hoạt A20. Trong khi đó fludarabine chỉ ức chế sự tiết TNF-α của tế bào pDC bị bất hoạt A20. 3.2.4.3. Vai trò của protein A20 đối với sự di chuyển của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 21 Hình 3.14. Ảnh hưởng của protein A20 lên sự di chuyển tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 Sự tăng cường di chuyển của các tế bào pDC bị bất hoạt A20 bị loại bỏ khi môi trường nuôi cấy tế bào được thêm chất ức chế IKK và không thay đổi khi có fludarabine. Vai trò của tín hiệu NF-κB đặc biệt quan trọng điều hòa hoạt động của tế bào pDC bị bất hoạt gen A20 khi phơi nhiễm với TgPRF trong nghiên cứu này vì chất ức chế IKK đã đảo ngược hoàn toàn những thay đổi trong biểu hiện của dấu hiệu trưởng thành, sản phẩm cytokine và khả năng di chuyển, trong khi fludarabine chỉ loại bỏ một phần biểu hiện tăng cường của MHC II và sự tiết cytokine TNF-α. Protein A20 đã được chứng minh là chất ức chế hoạt động tế bào qua trung gian tín hiệu NF-κB khi tiếp xúc với các kháng nguyên khác. Gần đây trong một số loại tế bào, gen A20 cũng được biết là có tác dụng ức chế kích hoạt STAT1, giúp ngăn ngừa tử vong do nhiễm T. gondii ở chuột. Dựa trên các kết quả đạt được, chúng tôi đã kết luận rằng protein A20 ức chế sự trưởng thành của tế bào pDC thông qua tín hiệu NF-κB và ức chế một phần phản ứng viêm thông qua tín hiệu STAT1. Tác dụng của A20 đối với tế bào pDC có thể sẽ ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch trong nhiễm T. gondii. 3.2.5. Vai trò của protein A20 đối với chức năng của tế bào CD11b + DC thông qua tín hiệu STAT1 22 3.2.5.1. Vai trò của protein A20 đối với quá trình sản xuất cytokine của tế bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1 Hình 3.15. Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của CD11b + DC thông qua con đường tín hiệu STAT1 Sau khi kích thích bởi LPS, sự tiết cytokine ở nhóm bất hoạt gen A20 tăng cường so với nhóm chứng không bất hoạt. Đáng chú ý là, tác dụng ức chế của gen A20 đối với TNF-α và IL-10 đã bị giảm đáng kể khi fludarabine được thêm vào môi trường nuôi cấy. Bằng chứng này đã chỉ ra rằng tác dụng của prote