Tóm tắt Luận án Nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử SSRs liên kết với locus kiểm soát chất lượng xơ ở cây bông

ào chỉ thị phân tử. Những chỉ thị phân tử liên ết chặt với những QTL liên quan đến những tính trạng chính cấu thành năng suất và chất lƣợng xơ (chiều dài xơ, độ đều xơ, độ bền xơ, độ giãn xơ, độ mịn xơ...) đã đƣợc áp dụng thành công trong những chƣơng trình chọn giống bông chất lƣợng xơ tốt trên thế giới [Lacape, 2010; Ra shit, 2010...]. Một số công trình tiêu biểu về nghiên cứu QTL chất lƣợng xơ trên cây bông đã đƣợc công bố trên thế giới nhƣ công trình của Wang & cs. (2013) đã phát hiện 24 QTL chất lƣợng xơ và tỷ lệ xơ hi nghiên cứu trên quần thể giữa hai giống bông G. barbadense Luyuan 343 và G. 6 hirsutum Lumianyan 22 năng suất cao. Yang & cs. (2014) đã xây dựng bản đồ liên ết di truyền với 579 chỉ thị phân bố trên 56 nhóm liên ết, bao phủ 4.168,72cM từ quần thể BC1 giữa hai giống bông G. hirsutum và G. barbadense (CCRI8 x Pima 90-53). Tổng số 44 QTL đã đƣợc phát hiện trên 17 NST, quy định từ 7,72- 23,73% biến dị iểu hình. Những QTL này là những gen tiềm năng có giá trị cho lập bản đồ chi tiết, tách dòng và các dự án quy tụ gen chất lƣợng xơ. 1.6. Tình hình nghiên cứu và chọn tạo giống bông tại Việt Nam Cho đến nay, công tác chọn tạo giống bông ở nƣớc ta đã gặt hái đƣợc nhiều ết quả hả quan, nhiều giống đƣợc công nhận là giống quốc gia và đƣa vào phổ biến trong sản xuất. Tuy nhiên, nguồn gen bông trong nƣớc v n còn thiếu những giống bông năng suất cao, chất lƣợng xơ tốt, mang lại giá trị inh tế cho ngƣời trồng bông để có thể huyến hích nông dân quan tâm và phát triển nghề trồng bông nội địa. Trong những năm gần đây, một số công trình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trên cây bông tại Việt Nam đã đƣợc tiến hành và mang lại những thành công bƣớc đầu. Những công trình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trên đối tƣợng cây bông trong nƣớc gồm một số nghiên cứu theo hƣớng tiếp cận công nghệ chuyển gen, công nghệ chỉ thị phân tử trong phân tích di truyền tính háng bệnh và đã mang lại những ết quả rất có triển vọng. Tuy nhiên, so với những cây trồng chính hác, những nghiên cứu trên đối tƣợng cây bông tại Việt Nam v n còn rất ít, chính vì vậy đã làm hạn chế việc ứng dụng rộng rãi những thành tựu công nghệ sinh học trên đối tƣợng cây trồng này. Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm phát triển những giống bông có năng suất, chất lƣợng cao sẽ góp phần mở rộng diện tích trồng bông trong nƣớc, đặc biệt ở những vùng chịu ảnh hƣởng của hạn hán éo dài nhƣ các tỉnh duyên hải Nam Trung Bộ, giúp tăng thu nhập nông dân và đặc biệt là cung cấp một phần nguyên liệu cho ngành dệt may trong nƣớc đang phụ thuộc hoàn toàn vào nguồn nguyên liệu từ nƣớc ngoài. CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - 38 giống bông (bao gồm 17 giống bông Cỏ Gossypium arboreum, 11 giống Luồi G. hirsutum và 10 giống Hải đảo G. barbadense) chọn lọc từ tập đoàn giống của Viện NC Bông & PTNN Nha Hố. - 746 cặp mồi SSR thuộc 11 nhóm mồi BNL, CIR, CMS, DPL, JESPR, MGHES, MUCS, MUSS, NAU, STV, TM đƣợc chọn lọc từ các cơ sở dữ liệu hệ gen cây bông và các bản đồ liên ết hệ gen cây bông đã công bố. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Các bƣớc thực hiện đề tài đƣợc sơ đồ hóa ở hình 1. 7 Hình 1. Sơ đồ các bƣớc triển khai thực hiện đề tài 2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm đánh giá con lai F1, F2 đƣợc bố trí tuần tự hông nhắc lại có èm đối chứng. Các biện pháp ỹ thuật canh tác đƣợc thực hiện theo tiêu chu n 10TCN 910:2006 và 10TCN 911: 2006 của bộ NN & PTNT. Chất lƣợng xơ bông đƣợc đánh giá theo Tiêu chu n phân cấp xơ bông Việt Nam (TCCS- 2006). 2.2.2. Phương pháp lai tạo quần thể: Quần thể F1 đƣợc lai tạo bằng phƣơng pháp lai truyền thống và tự thụ các cá thể F1 để tạo quần thể F2. 2.2.3. Phương pháp phân tích di truyền bằng chỉ thị SSR * Tách chiết ADN: Theo phƣơng pháp CTAB của Doyle (1987). * PCR: Điều iện phản ứng: 950C - 7 phút; 40 chu ỳ (940C - 15 giây, 550C - 30 giây, 720C - 2 phút); giữ m u ở 40C. Sản ph m PCR đƣợc iểm tra trên gel agarose SFR 3,5%. * Phương pháp lập bản đồ liên kết di truyền và xác định locus kiểm soát chất lượng xơ ở cây bông: - Khảo sát đa hình giữa hai giống bông bố mẹ để xác định những chỉ thị SSR cho đa hình. - Phân tích iểu gen của quần thể con lai F2 với các chỉ thị SSR. - Phân tích chất lƣợng xơ của quần thể con lai F2. - Sử dụng các phần mềm chuyên dụng để xây dựng bản đồ liên ết di truyền và bản đồ 8 QTL chất lƣợng xơ. * Các phương pháp xử lý số liệu: - Xử lý thống ê bằng phần mềm IRRISTAT v. 4.0 [IRRI, 1998]. - Phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYS pc 2.1 [Rohlf, 2000]. - Xây dựng bản đồ liên ết di truyền bằng phần mềm Mapma er/Exp version 3.0b [Whitehead Institute, 1992]. - Xây dựng bản đồ QTL chất lƣợng xơ bằng phần mềm Windows QTL Cartographer Version 2.5_011 [North Carolina State Uni., USA, 2012]. * Phương pháp vẽ bản đồ liên kết di truyền: Bản đồ liên kết di truyền đƣợc vẽ tự động bằng phần mềm MapChart version 2.2. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐÁNH GIÁ NGUỒN GEN BÔNG LÀM VẬT LIỆU PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU 3.1.1. Phân tích đa dạng di truyền các giống bông nghiên cứu Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng hai hệ thống chỉ thị là 24 chỉ thị hình thái và 38 chỉ thị phân tử để phân tích đa dạng di truyền tập đoàn 38 giống bông Gossypium spp. Kết quả phân tích cho thấy bông Cỏ G. arboreum có năng suất và chất lƣợng xơ thấp nhất, bông Luồi G. hirsutum có ƣu thế về năng suất và bông Hải đảo G. barbadense vƣợt trội hơn hẳn hai nhóm bông còn lại về chất lƣợng xơ. Đa dạng di truyền của 38 giống bông đã đƣợc phân tích với 38 chỉ thị SSR (hình 2). Số lƣợng alen/locus dao động từ 2 alen đến 6 alen, với giá trị trung bình 3,53 alen/locus. Hệ số đa dạng PIC dao động từ 0,36 (BNL0119) đến 0,82 (BNL3431), với giá trị trung bình là 0,61. Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các giống bông nghiên cứu với chỉ thị BNL3992 trên gel agarose SFR 3,5% (M: Thang ADN chuẩn 100bp; Từ 1-38: các giống bông nghiên cứu) Kết quả phân tích đa dạng di truyền đƣợc thể hiện qua các hệ số hoảng cách di truyền Euclid thu đƣợc thông qua dữ liệu hình thái và hệ số tƣơng đồng di truyền DICE thu đƣợc thông qua dữ liệu chỉ thị ADN. Kết quả phân tích cho thấy tiềm năng đa dạng di truyền cao trong 38 giống bông nghiên cứu cũng nhƣ giữa các giống bông Cỏ G. arboreum và giữa các giống bông tứ bội hác loài. Tuy nhiên, cơ sở di truyền hẹp trong nhóm bông tứ bội cùng loài cũng đã đƣợc ghi nhận ở hai nhóm bông Luồi G. hirsutum và bông Hải đảo G. barbadense trên cả hai hệ thống chỉ thị đƣợc áp dụng. (Bảng 1) 9 Bảng 1. Kết quả phân tích đa dạng di truyền 38 giống bông nghiên cứu bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử Đối tƣợng phân tích Hệ số di truyền Euclid(1) DICE(2) 38 giống bông (Gossypium spp.) 1,0 - 18,06 0,20 - 0,99 Nhóm bông Cỏ (G. arboreum) 1,0 - 12,81 0,44 - 0,86 Nhóm bông Luồi (G. hirsutum) 2,24 - 5,92 0,57 - 0,96 Nhóm bông Hải đảo (G. barbadense) 2,00 - 6,48 0,74 - 0,99 Bông tứ bội (Luồi và Hải đảo) 6,86 - 9,85 0,23 - 0,99 Chú thích: (1) Hệ số khoảng cách di truyền Euclid thu được khi phân tích 24 chỉ thị hình thái; (2) Hệ số tương đồng di truyền DICE thu được khi phân tích 38 chỉ thị phân tử SSR Trên thế giới, việc đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen bông đƣợc nghiên cứu để phục vụ cho nhiều mục đích: hảo sát đa dạng di truyền, xác định quan hệ họ hàng, cấu trúc quần thể, nhận biết chỉ thị phân tử liên quan đến những tính trạng quan tâm... Kết quả phân tích đa dạng di truyền của một số công trình trên thế giới và của nghiên cứu này đƣợc tổng hợp trong bảng 2. Bảng 2. Một số kết quả nghiên cứu về đa dạng di truyền trên nguồn gen cây bông sử dụng chỉ thị ADN Nguồn gen SL giống SL chỉ thị Số alen Trung bình GD GS Nguồn tài liệu Số alen PIC G. hirsutum 97 56 SSR 325 5,0 0.31 - - Liu, 2000 G. hirsutum 11 60 SSR 139 2,0 - 0,06-0,34 - Gutiéreez, 2002 G. hirsutum 50 42EST-SSR 91 2,4 - 0,11-0,83 - Wang, 2004 G. arboreum 53 31SSR 66 2,13 0,40 0,0-0,41 - Bertini, 2006 G. arboreum 39 74SSR 165 - - 0,58-0,87 Liu, 2006 G. arboreum 47 201 SSR 1128 5,61 0,55 - - Lacape, 2007 G. arboreum 30 45 RAPD - - 0,47-0,99 Rahman, 2008 G. barbadense 56 98 SSR 211 2,33 - 0,00-0,66 - Kantartzi, 2009 G. hirsutum 56 218 SSR 361 1,66 0,32 - - Wang, 2011 G. hirsutum 59 40 SSR 255 5,08 0,8 - 0,53-0,99 Zhang, 2011 G. hirsutum+ hybrids 30 11 SSR 44 2,53 0,29 - - Kalivas, 2011 Gossypium spp. 38 38 SSR 134 3,53 0,61 - 0,20-0,99 Nghiên cứu này Ghi chú: GD: khoảng cách di truyền (genetic distance); GS: độ tương đồng di truyền (genetic similarity) Các nghiên cứu đều cho thấy tiềm năng hai thác đa dạng di truyền từ nguồn gen bông Cỏ G. arboreum còn há lớn. Trong hi đó, đa dạng di truyền hẹp đƣợc ghi nhận trong các nguồn gen bông trồng trọt cùng loài hệ gen tứ bội, đặc biệt là nguồn gen bông Hải đảo G. barbadense. Tuy nhiên, việc phát hiện đa dạng di truyền há cao giữa các giống bông tứ bội hác loài G. hirsutum và G. barbadense trong nghiên cứu của chúng tôi sẽ giúp cho việc hai thác đa dạng di truyền giữa hai nhóm bông này và mang lại những tổ hợp lai có hiệu quả trong chọn tạo giống. 3.1.2. Chọn lọc nguồn vật liệu bố mẹ cho lai tạo 10 Với mục đích chính của nghiên cứu là lập bản đồ liên ết di truyền và xác định QTL chất lƣợng xơ trên cây bông, từ đó có định hƣớng ứng dụng trong chọn tạo giống bông năng suất cao, chất lƣợng xơ tốt tại Việt Nam, chúng tôi đã chọn lọc cặp giống bố mẹ là các giống bông Luồi cho năng suất cao và các giống bông Hải đảo có chất lƣợng xơ tốt. Do cặp giống bố mẹ là hai giống bông hác loài nên thế hệ con lai sẽ cho ƣu thế lai cao, tuy nhiên để hắc phục những hó hăn do lai hác loài nhƣ: hả năng tạo hạt lai hông ổn định giữa các tổ hợp, tỷ lệ rụng quả cao, quả lai nhiều dị dạng, hông có hợp chất polyphenol gossypol..., chúng tôi đã tiến hành lai tạo nhiều cặp lai để có thể chọn tổ hợp lai tốt nhất. Tổng số mƣời lăm tổ hợp đã đƣợc lai tạo và thu đƣợc hạt lai F1, trong đó tổ hợp L591 x HD138 cho hối lƣợng hạt lai F1 lớn nhất là 280g, đồng thời hai giống bố mẹ có hoảng cách di truyền hông quá xa, do vậy tổ hợp lai này đƣợc tiếp tục sử dụng để tạo quần thể con lai F2 phục vụ cho việc xây dựng bản đồ liên ết di truyền cây bông. 3.2. XÂY DỰNG BẢN ĐỒ LIÊN KẾT DI TRUYỀN TRÊN HỆ GEN CÂY BÔNG TỨ BỘI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ 3.2.1. Xác định các cặp mồi SSR cho đa hình giữa hai giống bông bố mẹ L591 và HD138 Để xác định các cặp mồi SSR cho đa hình giữa hai giống bông bố mẹ L591 và HD138, chúng tôi đã sàng lọc tổng số 746 cặp mồi SSR và thu đƣợc 221 cặp mồi cho đa hình, chiếm tỷ lệ 29,62% (hình 3, bảng 3). Hình 3. Ảnh điện di sản phẩm PCR của hai giống bông bố mẹ với các chỉ thị SSR trên gel agarose SFR 3,5% Từ trái qua phải: thang ADN chuẩn 50bp, tiếp theo là cặp P1, P2 với các chỉ thị SSR. Những chỉ thị cho đa hình được đánh dấu với vòng elip. Kết quả phân tích đa hình ADN hai giống bông L591 và HD138 đã cho thấy trong số 10 nhóm mồi SSR, 3 nhóm mồi đƣợc sử dụng nhiều nhất là nhóm mồi BNL cho tỷ lệ đa hình 47,76%, tiếp theo là hai nhóm mồi NAU và CIR cho tỷ lệ đa hình tƣơng ứng là 36,16% và 20% (bảng 3). Bảng 3. Kết quả phân tích đa hình hai giống bông bố mẹ với các chỉ thị SSR T T Nhóm mồi Nguồn gốc Số cặp mồi Tỷ lệ đa hình (%) Sàng lọc Đa hình G.h/G.b(1) G.a/G.a(2) 1 BNL Brookhaven National Laboratory, 2007 245 117 47,76 26,77 2 CIR CIRAD, 2007 120 24 20,00 10,45 11 3 CMS Texas A&M University, 1998 11 0 0 7,69 4 JESPR Texas A&M University, 2007 30 3 10,00 0 5 MGHES Mississippi State University, 2007 43 6 13,95 4,44 6 MUCS Park & Mauricio Ulloa, 2005 42 0 0 8,33 7 MUSS Park & Mauricio Ulloa, 2005 43 0 0 0 8 NAU Nanjing Agricultural University, 2007 177 64 36,16 14,28 9 STV Taliercio E, Scheffler J. 2006 13 3 23,08 7,69 10 TM John Yu, 2002 22 4 18,18 13,64 Tổng số 746 221 29,62 15,45 (1)Kết quả của nghiên cứu này: G.h/G.b: bông Luồi/ bông Hải đảo (L591 x HD138) (2) Kết quả nghiên cứu của N.T.L Hoa, 2010: G.a/G.a: bông Cỏ/bông Cỏ (BC75 x KXL002) Khi so sánh ết quả thu đƣợc với công bố của N.T.L. Hoa và cs. (2010) chúng tôi nhận thấy với cùng một nhóm mồi sử dụng, cặp giống bông Luồi/bông Hải đảo (L591/ HD138) trong nghiên cứu này cho đa hình ADN cao hơn hẳn so với cặp giống bông Cỏ (BC75 x KXL002). Sự sai hác trên có thể giải thích là do nghiên cứu của chúng tôi đã sử dụng cặp giống bố mẹ là hai giống bông tứ bội hác loài (G. hirsutum/ G. barbadense), trong hi tác giả N.T.L. Hoa phân tích trên cặp giống bông lƣỡng bội cùng loài G. arboreum. Các công trình công bố trên thế giới đã cho thấy đa hình ADN giữa hai giống bông cùng loài há thấp [Lin & cs., 2005], do vậy sử dụng cặp lai giữa hai giống bông hác loài đã thu đƣợc nhiều chỉ thị đa hình giữa hai giống bố mẹ, tạo điều iện thuận lợi cho việc phân tích di truyền quần thể phân ly F2. 3.2.2. Lai tạo quần thể, phân tích chất lƣợng xơ và phân tích phân li di truyền quần thể F2 Trong nghiên cứu này, bản đồ liên ết di truyền đƣợc xây dựng dựa trên sự phân ly di truyền của quần thể con lai F2 với các chỉ thị SSR. Kết hợp số liệu phân tích iểu gen với số liệu phân tích chất lƣợng xơ của quần thể con lai F2 sẽ xây dựng đƣợc bản đồ QTL chất lƣợng xơ và xác định đƣợc các chỉ thị SSR liên ết. Thí nghiệm lai tạo quần thể con lai F2 đƣợc tiến hành tại Viện Nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố. Quần thể con lai F2 (L591 x HD138) gồm 295 cá thể đƣợc gieo trồng, theo dõi các đặc tính nông sinh học và chất lƣợng xơ theo Tiêu chu n phân cấp xơ bông Việt Nam (10TCN 911: 2006). Trong tổng số 295 cây F2 đƣợc thu m u lá để tách chiết ADN, có 171 cây có quả để phân tích các chỉ tiêu chất lƣợng xơ. Tuy nhiên, một số cây rất ít quả hông đủ để phân tích tất cả các chỉ tiêu, do vậy chỉ có 133 cá thể có số liệu đầy đủ với các chỉ tiêu chất lƣợng xơ chính mới đƣợc sử dụng trong nội dung phân tích QTL chất lƣợng xơ. Tổng số 221 chỉ thị SSR cho đa hình đã đƣợc sử dụng để phân tích phân ly di truyền của quần thể con lai F2 (L591 x HD138) (hình 4). 12 Hình 4. Kết quả phân tích sản phẩm PCR quần thể con lai F2 (L591 x HD138) với chỉ thị BNL3992 trên gel agarose SFR 3,5% Từ trái qua phải: 50bp ladder, P1: L591; P2: HD138; Các cá thể F2 Phân tích ết quả chúng tôi nhận thấy đa số các chỉ thị SSR xuất hiện ở trạng thái một cặp alen đặc trƣng và đồng trội. Theo nguyên tắc lập bản đồ ở F2, các cá thể mang iểu gen giống mẹ đƣợc cho điểm 1, giống bố đƣợc cho điểm 3, cá thể dị hợp tử đƣợc cho điểm 2. Một số ít chỉ thị SSR xuất hiện ở trạng thái nhiều alen và đồng trội (BNL686, BNL3255, BNL3992...), trong trƣờng hợp này chúng tôi chỉ xét đến alen cho đa hình giữa bố và mẹ và cho điểm tƣơng tự nhƣ trên. Số liệu phân tích phân li di truyền quần thể F2 (L591 x HD138) đƣợc xử lý bằng phần mềm MAPMAKER/EXP version 3.0b và xây dựng đƣợc bản đồ gồm 26 nhóm liên ết với tổng số 214 chỉ thị. 26 nhóm liên ết đƣợc đặt tên từ LG1 đến LG26, tƣơng ứng với 26 NST của hệ gen AD (hình 5). 13 Hình 5. Bản đồ liên kết di truyền cây bông tứ bội xây dựng từ quần thể con lai F2 (L591 x HD138) với các chỉ thị SSR Chú thích: Bản đồ liên kết di truyền được xây dựng bằng phần mềm MAPMAKER/EXP version 3.0b gồm 214 chỉ thị phân bố trên 26 nhóm liên kết, tương ứng với 26 NST cây bông tứ bội. Tổng chiều dài bản đồ là 3.083,8cM, khoảng cách trung bình giữa hai chỉ thị ~ 14,4cM. LG: Nhóm liên kết. Đơn vị bản đồ: cM 14 Chiều dài bản đồ đƣợc lập đối với từng nhóm liên ết dao động há lớn, từ 24cM ở LG22 đến 300,8cM ở LG5. Tổng chiều dài bản đồ liên ết đƣợc lập là 3.083,8cM, hoảng cách trung bình giữa hai chỉ thị là 14,4cM. Khoảng cách gần nhất giữa hai chỉ thị liền ề là 2,6cM (BNL3594 và NAU0905) trên LG25. Khoảng cách xa nhất giữa hai chỉ thị là 46,8cM (BNL3580 và CIR009-2) trên LG1. Bản đồ liên kết di truyền hệ gen cây bông tứ bội (G. hirsutum x G. barbadense) thu đƣợc trong nghiên cứu này là bản đồ đầu tiên đƣợc lập tại Việt Nam. Trƣớc đó, tác giả N.T.L. Hoa (2013) đã công bố bản đồ liên kết di truyền trên cây bông lƣỡng bội (G. arboreum x G. arboreum) với chiều dài 1.294,5 cM với 99 chỉ thị SSR. 3.2.3. So sánh các bản đồ di truyền liên kết hệ gen cây bông tứ bội G. hirsutum xG. barbadense sử dụng chỉ thị phân tử SSR Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hai bản đồ liên ết di truyền xây dựng từ các quần thể F2 giữa G. hirsutum x G. barbadense để so sánh sự phân bố của các chỉ thị SSR. Bản đồ của He & cs. (2007) nghiên cứu trên quần thể F2 (Handan208 x Pima90) gồm 26 nhóm liên ết, tổng số 1.029 locus với 834 SSRs, bao phủ 5.472,3 cM, hoảng cách trung bình giữa hai locus là 5,32 cM. Bản đồ của Yu & cs. (2007) xây dựng từ quần thể F2 (CRI36 x Hai7124) gồm 1.252 locus với 697 SSRs, bao phủ 4.536,7 cM, hoảng cách trung bình giữa hai chỉ thị là 4,1 cM. Phân tích so sánh cho thấy có 39 trong tổng số 214 chỉ thị của nghiên cứu này thể hiện sự tƣơng đồng về NST với bản đồ của He (2007), tƣơng ứng 18,2% số chỉ thị phân tích. Trong đó, nhóm liên ết LG1 có sự tƣơng đồng cao nhất với NST 1 trên bản đồ của He với 5 chỉ thị tƣơng đồng. 59 chỉ thị (27,6%) tƣơng đồng về vị trí trên NST giữa bản đồ của nghiên cứu này với bản đồ của Yu (2007), trong đó 3 nhóm liên ết LG12, LG6 và LG26 có số chỉ thị tƣơng đồng nhiều nhất, tƣơng ứng với 7, 5 và 5 chỉ thị (hình 6). 15 Hình 6. So sánh vị trí chỉ thị SSR trên NST số 1 và số 12 giữa các bản đồ liên kết hệ gen cây bông tứ bội (F2: G. hirsutumx G. barbadense) Cây bông là cây trồng có hệ gen phức tạp, sự biến động về vị trí các chỉ thị SSR trên hệ gen cây bông có thể lý giải là do hiện tƣợng nhân đôi hệ gen trong quá trình tiến hóa gặp điển hình ở một số thực vật trong đó có Gosypium spp. [Flagel, 2008, 2010]. Đó là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tƣợng một chỉ thị có thể đƣợc định vị tại các vị trí hác nhau trong hệ gen tứ bội AADD. Các chỉ thị có thể xuất hiện ở trạng thái nhân đôi trên cùng NST và/hoặc nhân đôi ở các NST khác nhau. Bản đồ của He (2007) cho thấy rõ điều đó, trong khi bản đồ của chúng tôi và của Yu (2007) hông phát hiện đƣợc hiện tƣợng trên. Những phân tích trên đã củng cố thêm nhận định của các nhà hoa học cho rằng sự biến động vị trí, trật tự của các chỉ thị SSR trên hệ gen cây bông là há phổ biến, đòi hỏi những nghiên cứu sâu hơn nữa về hệ gen phức tạp của chi Gossypium spp. [Blenda, 2012]. Điều này cũng gây ra hó hăn cho những nghiên cứu về QTL/gen liên ết với những tính trạng có lợi ở cây bông và hả năng ứng dụng chúng trong công tác chọn giống. 3.3. XÁC ĐỊNH CÁC QTL CHẤT LƢỢNG XƠ VÀ CÁC CHỈ THỊ SSR LIÊN KẾT GẦN VỚI CÁC QTL 3.3.1. Xây dựng bản đồ QTL chất lƣợng xơ Đề tài đã xác định đƣợc vị trí 14 QTL liên quan đến các tính trạng chất lƣợng xơ chính, các QTL đƣợc đặt tên dựa trên tên viết tắt của tính trạng và nhóm liên ết mà QTL định vị, bao gồm: 3 QTL chiều dài xơ qFL-2, qFL-12 và qFL-26 nằm trên các nhóm liên ết số 2, 12 và 26; ba QTL độ bền xơ qFS-3, qFS-19a và qFS19-b nằm trên các nhóm liên ết số 3 và số 19; hai QTL độ đều xơ qFU-5 và qFU-8 nằm trên các nhóm liên ết số 5 và số 8; ba QTL độ giãn xơ qFE-1, qFE-2 và qFE-23 nằm trên các nhóm liên ết số 1, số 2 và số 23; 2 QTL tỉ lệ xơ qLP- 19, qLP-20 và QTL chỉ số xơ ngắn qSF-2 nằm trên các nhóm liên ết số 19, số 20 và số 2. (hình 7, bảng 4) 16 Hình 7. Một số QTL quy định chất lƣợng xơ đƣợc phát hiện khi phân tích quần thể F2 (L591 x HD138) bằng phần mềm Windows QTL Cartographer Giá trị LOD của các QTL dao động từ 2,31 (QTL độ bền xơ qFS-19a) đến 3,31 (QTL chiều dài xơ qFL-26), trong đó có 5 trong số 14 QTL có giá trị LOD >3; 8 QTL có giá trị LOD nằm trong hoảng từ 2,5 đến 3,0; duy nhất QTL qFS-19a có giá trị LOD dƣới 2,5. Kết quả phân tích cũng cho thấy tỷ lệ % các QTL này quy định biến dị iểu hình (giá trị R2%) dao động trong hoảng từ 5,98% (ở QTL độ bền xơ qFS-19b và QTL chỉ số xơ ngắn qSF- 2) đến 22,40% (ở QTL chiều dài xơ qFL-12), trong đó có bảy QTL có tỷ lệ R2>10% (bảng 4). Tám trong số 14 QTL có nguồn gốc từ giống HD138, 6 QTL còn lại có nguồn gốc từ giống bông L591. Mƣời bốn QTL đƣợc định vị trên 10 nhóm liên ết, trong đó 2 nhóm liên ết LG2 và LG19 có 3 QTL đƣợc định vị (hình 8). Đặc biệt, trên nhóm liên ết số 2, tại hai vị trí 86,2 và 87,7cM phát hiện đƣợc 2 QTL qFL-2 và qFS-2 cùng đƣợc nhận biết bằng hai chỉ thị phân tử liền ề BNL3971-NAU1250. 17 Hình 8. Vị trí các QTL liên quan đến chất lƣợng xơ trên bản đồ liên kết di truyền của quần thể con lai F2 (L591 x HD138) Chú thích: Tổng số 14 QTL chất lượng xơ được định vị trên bản đồ liên kết di truyền. Giá trị LOD của các QTL dao động từ 2,31 - 3,31; tỷ lệ % các QTL quy định biến dị kiểu hình (giá trị R2%) dao động trong khoảng từ 5,98% - 22,40%. Bảng 4. Các QTL liên quan đến chất lƣợng xơ đƣợc phát hiện bằng phần mềm QTL Cartographer 2.5 Tính trạng QTL Nhó m liên kết Vị trí QTL trên bản đồ liên kết (cM) Chỉ thị liền kề Vị trí chỉ thị liền kề (cM) LOD a Additiv e b R 2 (%) c Nguồn gốc Chiều dài xơ qFL-2 LG2 86,2 BNL3971- NAU1250 86,1-92,4 2,55 1,438 13,23 L591 qFL-12 LG1 2 87,5 BNL2768- BNL3816 87,4- 116,7 3,18 1,416 22,40 L591 qFL-26 LG2 6 44,2 BNL341- BNL840 38,6- 49,5 3,31 -1,303 10,53 HD13 8 Độ bền xơ qFS-3 LG3 42,5 BNL3989- NAU2571 39,8- 47,0 2,75 -0,457 8,71 HD13 8 qFS-19a LG1 9 9,6 BNL285- BNL852 0,0- 13,9 2,31 -1,151 7,92 HD13 8 qFS-19b LG1 9 64,0 BNL2656- CIR212-2 49,5-74,1 2,85 -0,829 5,98 HD13 8 Độ đều xơ qFU-5 LG5 7,7 BNL3992- BNL542 0,0- 22,2 2,64 -1,352 9,46 HD13 8 qFU-8 LG8 85,2 NAU1037- 80,2- 87,0 3,21 -0,651 12,65 HD13 18 Tính trạng QTL Nhó m liên kết Vị trí QTL trên bản đồ liên kết (cM) Chỉ thị liền kề Vị trí chỉ thị liền kề (cM) LOD a Additiv e b R 2 (%) c Nguồn gốc BNL3257 8 Độ giãn xơ qFE-1 LG1 37,1 BNL3090- BNL3580 29,8- 49,9 2,68 -1,809 8,07 HD13 8 qFE-2 LG2 67,0 NAU1072- NAU1193 61,4- 67,2 2,50 -0,804 13,74 HD13 8 qFE-23 LG2 3 20,5 BNL1414- BNL2690 18,4- 26,5 2,96 5,816 14,22 L591 Tỷ lệ xơ qLP-19 LG1 9 142,2 BNL3535- BNL3348 139,5- 147,4 3,26 3,081 11,59 L591 qLP-20 LG2 0 128,2 CIR166- BNL3482 117,9- 142,7 2,92 6,008 7,37 L591 Chỉ số xơ ngắn qSF-2 LG2 87,7 BNL3971- NAU1250 86,1- 92,4 3,02 2,341 5,98 L591 Chú thích: a LOD: logarithm of odds score, cho biết khả năng có mặt QTL tại vị trí nghiên cứu (LOD > 2,0); bAdditive effect: Hiệu quả cộng thêm của QTL, giá trị (+) có nghĩa là hiệu quả cộng thêm đến từ giống mẹ L591, giá trị (-) có nghĩa là hiệu quả cộng thêm đến từ giống bố HD138; cR2 %: tỷ lệ phần trăm biến dị kiểu hình của tính trạng do QTL kiểm soát. 19 3.3.2. Xác định các chỉ thị phân tử SSR liên kết gần với các QTL chất lƣợng xơ Trong số 14 QTL đƣợc định vị trên bản đồ liên ết, chúng tôi xác định đƣợc 11 chỉ thị SSR liên ết chặt với QTL, với hoảng cách từ chỉ thị tới QTL  5cM. Đây là nguồn chỉ thị quan trọng cho việc chọn lọc những cá thể mang QTL chất lƣợng xơ tƣơng ứng. Mƣời ba chỉ thị SSR còn lại thể hiện mối liên ết há lỏng (>5cM) với QTL. Việc sử dụng những cặp chỉ thị liền ề để xác định sự có mặt của QTL chất lƣợng xơ sẽ hỗ trợ rất nhiều trong quá trình chọn giống, giúp rút ngắn thời gian, hỗ trợ cho những số liệu đánh giá ngoài đồng ruộng nhằm chọn lọc những dòng giống triển vọng trong sản xuất. Trong nghiên cứu này, 10 QTL có thể đƣợc nhận biết chính xác thông qua sự phân tích với các chỉ thị liên ết, các QTL còn lại cần có những nghiên cứu bổ sung để có thể xác định đƣợc những chỉ thị phân tử liên ết gần phục vụ cho chọn giống (bảng 5). Bảng 5. Các chỉ thị phân tử SSR liên kết và khoảng cách tới QTL chất lƣợng xơ trong nghiên cứu Chỉ thị liên kết QTL Khoảng cách chỉ thị- QTL(cM ) Tính trạng Chỉ thị liên kết QTL Khoảng cách chỉ thị- QTL (cM) Tính trạng BNL3971 - NAU1250 qFL-2 0,1 6,2 Chiều dài xơ BNL3090- BNL3580 qFE-1 7,3 12,8 Độ giãn xơ BNL2768 - BNL3816 qFL-12 0,1 >15 NAU1072 - NAU1193 qFE-2 5,6 0,2 BNL341- BNL840 qFL-26 5,6 5,3 BNL1414 - BNL2690 qFE-23 2,1 6,0 BNL3989 - NAU2571 qFS-3 2,7 4,5 Độ bền xơ BNL3535 - BNL3348 qLP-19 2,7 5,2 Tỷ lệ xơ BNL285- BNL852 qFS-19a 9,6 4,3 CIR166- BNL3482 qLP-20 10,3 14,5 BNL2656- CIR212-2 qFS-19b 14,5 10,1 BNL3971 - NAU1250 qSF-2 1,6 4,7 Chỉ số xơ ngắn BNL3992- BNL542 qFU-5 7,7 14,5 Độ đều xơ NAU1037 - BNL3257 qFU-8 5,0 1,8 3.3.3. Đánh giá tiềm năng ứng dụng các QTL kiểm soát chất lƣợng xơ và các chỉ thị SSR liên kết QTL trong nghiên cứu chọn tạo giống bông chất lƣợng xơ tốt Kết quả tổng hợp và phân