Tóm tắt Luận án Nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm

iệc nhân bản, nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa protein VP28 tái tổ hợp ở E. coli và Bacillus subtilis. Đề tài đã xá định trình tự và một số đặ trưng ủa gen VP28 từ các mẫu WSSV phân lập được ở Việt Nam. - Nghiên cứu biểu hiện thành công gen mã hóa protein VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử B. subtilis dưới dạng các cấu trúc protein dung hợp CotB-VP28 và CotB-GST-VP28, tr ng đó, CotB là protein vỏ của B. subtilis và GST (Glutathione S Transferase) là protein trung gian nhằm hạn chế cản trở không gian đối với VP28. - Đã tối ưu đượ điều kiện thu nhận bào tử tái tổ hợp B. subtilis biểu hiện tốt kháng nguyên VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử và nghiên cứu các tính chất của bào tử tái tổ hợp B. subtilis CotB-VP28, CotB-GST- VP28 trong một số điều kiện môi trường khác nhau. - Đã đánh giá được ự tăng hoạt độ của các enzyme phenoloxidase (PO), superoxide dismutase (SOD) phản ánh đáp ứng miễn dịch của tôm thẻ hân tr ng và đánh giá khả năng phòng bệnh đốm tr ng trên tôm thẻ hân tr ng với mứ bả hộ trên 70% của bào tử B. subtilis biểu hiện VP28 trên bề mặt. 6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài - Kết quả nghiên cứu của đề tài là ơ ở để tạo chế phẩm probiotic dạng bào tử B. subtilis tái tổ hợp bền nhiệt, biểu hiện VP28 trên bền mặt, có khả năng tăng ường miễn dịch và bảo vệ tôm khỏi nhiễm bệnh đốm tr ng, giúp góp phần kiểm soát dịch bệnh trên tôm. - Thành công của đề tài sẽ là tiền đề cho việc phát triển các vaccine tái tổ hợp dạng bào tử B. subtilis tái tổ hợp có khả năng phòng bệnh do các vi sinh vật khác gây ra ở tôm. 4 7. Bố cục của luận án Luận án gồm 120 trang bao gồm: Phần mở đầu (3 trang); Tổng quan tài liệu (40 trang); Đối tượng và phương pháp nghiên ứu (19 trang); Kết quả và thảo luận (39 trang); Kết luận và kiến nghị (1 trang), Các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (16 trang ,với 122 tài liệu gồm 2 thứ tiếng tiếng Việt (8 tài liệu) và tiếng Anh (11 tài liệu). Luận án có 15 bảng, 43 hình. 5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về virus gây bệnh đốm trắng ở tôm Virus gây bệnh đốm tr ng (White Spot Syndrome Virus, đượ viết t t là WSSV) thuộc họ Nimaviridae và chi Whispovirus ( VP28, đượ mã hóa bởi đ ạn gen hay khung đọ mở(ORF) 421 bp (wsv421), là một protein vỏ quan trọng, đóng vai trò rất quan trọng trong những bướ đầu tiên của quá trình nhiễm WSSV vào tôm (Van Hulten và tập thể, 2001). Ch đến nay hưa ó giải pháp hiệu quả để ngằn ngừa sự tấn công của loại virus này ở tôm. 1.2. Nghiên cứu tạo vaccine dựa trên kháng nguyên vỏ WSSV Tôm thuộ nhóm động vật giáp xá , ó hệ miễn dịch òn ơ khai, nhưng một số nghiên cứu gần đây h thấy có khả năng phòng ngừa đặc hiệu WSSV khi được kích thích bởi các dạng kháng nguyên VP28. Vì vậy protein VP28 đã đượ họn làm kháng nguyên đí h tr ng việ tạ á hế phẩm dạng va ine để phòng ngừa bệnh đốm tr ng ở tôm. VP28 đã được biểu hiện thành công ở E. coli (Zhang và tập thể, 2002; Sathish và tập thể, 2004; Witteveldt và tập thể 2004; Jha và tập thể, 2005; Caipang và tập thể, 2008; Hou và tập thể, 2011; Syed-Musthaq và tập thể, 2011; Mu và tập thể, 2012). Sử dụng VP28 tái tổ hợp là một biện pháp giúp tăng khả năng ống sót của tôm đối với WSSV. Tuy vậy, phương pháp này có hạn hế là khó áp dụng trên thực tế do protein VP28 không bền vững nếu như được cho trực tiếp và á đầm nuôi tôm, việ ử dụng bằng á h tiêm từng á thể mất nhiều thời gian, ông ứ và hi phí để sản xuất VP28 ũng rất cao. D đó, gần đây đã ó một ố nghiên cứu tập trung vào việc phát triển các dạng vaccine vi khuẩn sống tái tổ hợp biểu hiện VP28. ết quả thu đượ cho thấy rằng các loại bào tử tái tổ hợp VP28 giúp bảo vệ và tăng tỷ lệ 6 sống của tôm khi thử nghiệm với WSSV so với tôm hưa được dùng bào tử tái tổ hợp VP28 (Fu và tập thể, 2010; Ning và tập thể, 2011). Tuy vậy các kết quả nghiên cứu mới chỉ là bướ đầu, hưa ó một loại vaccine chính thứ nà được tạo ra. Vì vậy việc tiếp tục nghiên cứu để tạ được vaccine phòng bệnh đốm tr ng là hết sức cần thiết. 7 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và nguyên liệu 2.1.1. Đối tượng 23 mẫu tôm có biểu hiện nhiễm WSSV được thu thập từ các đầm nuôi tôm tại các địa phương khác nhau (Hải Phòng; Huế; Khánh Hòa; Thành phố Hồ Chí Minh; Só Trăng; Ninh Thuận; Bến Tre; Bình Định, Kiên Giang; Trà Vinh), được bảo quản ở -80 o C hoặc trong cồn 95 o C. Tôm thẻ chân tr ng (2-5g/con) dùng trong thử nghiệm thử thách khả năng bảo hộ phòng ngừa WSSV được lấy từ Phân viên nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản B c Trung bộ thuộc Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1. 2.1.2. Nguyên liệu Chủng vi khuẩn B. subtilis PY79 và vector pDG364, pDG364-CotB; pDG364-CotB-GST là quà tặng của GS. Simon Cutting, Đại học Hoàng gia Holloway, London, Vương quố Anh. Các chủng vi khuẩn E. coli DH5α; E. coli BL21 (DE3 RIL được mua từ hãng Novagen. Vector pET28b của hãng Novagen (Mỹ); các oligonucleotide của hãng Life Technology, kit nhân dòng trực tiếp sản phẩm PCR pGEM TA easy vàT DNA liga e được mua từ hãng Promega; thang chuẩn protein, thang chuẩn DNA 1kb và 100 bp, hỗn hợp dNTP được mua từ hãng Fermentas; Hot-Taq DNA p lymera e được mua từ hãng Enzynomics; kit thôi gel được mua từ Bioneer; MagPure viral DNA/RNA nan kit được mua từ ANABIO R&D; Qiaprep-miniprep kit được mua của hang Qiagen; lyz zyme được mua từ hãng Biobasic. Các cặp mồi được thiết kế đặc hiệu h á đ ạn gen mã hóa cho VP28 của virus gây bệnh đốm tr ng WSSV, cotB; cặp mồi đặc hiệu cho vị 8 trí amyE front, amyE back của vector pDG 364, cặp mồi của vector pGEM T và cặp mồi T7 promoter Fw/T7 terminator Rv của hãng Life Technology. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu nhận virus gây bệnh đốm tr ng từ mẫu tôm nhiễm bệnh 2.2.2. iểm tra ự ó mặt ủa WSSV bằng PCR và định lượng WSSV bằng real-time PCR 2.2.3. Nuôi cấy tạo bào tử B. subtilis the phương pháp ủa Nicholson và Setlow (1990) 2.2.4. Tách chiết DNA bằng kit ủa Qiagen, ANABIO R&D, Định lượng DNA bằng đ độ hấp thụ ánh áng tử ng ại ở bướ óng 260 nm 2.2.5. Nhân bản và kiểm tra ự ó mặt ủa gen vp28 bằng PCR 2.2.6. Định lượng pr tein the phương pháp Brad rd (1976) và tinh sạch proteinVP28 bằng k ái lự qua ột Hisbind 2.2. . iểm tra độ ạ h ủa pr tein bằng điện di gel p la rylamide ó SDS (SDS-PGAGE) theo Laemmli (1970) 2.2.8. iểm tra ự biểu hiện ủa gen bằng SDS-PA E, thẩm tá h miễn dị h và miễn dị h hu nh quang 2.2.9. Thử nghiệm khả năng phòng bệnh đốm tr ng của bào tử B. subtilis tái tổ hợp thông qua đánh giá mứ độ ống ót ủa tôm qua thời gian au khi h nhiễm WSSV và á hỉ ố h ạt độ phen l xida e, superoxide dismutase. 9 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 NHÂN DÒN , XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ VÀ MỘT SỐ ĐẶC TRƯN CỦA GEN VP28 TỪ CÁC MẪU WSSV PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM 3.1.1 Nh n n đ ạn g n m hóa P2 ng PCR 23 mẫu tôm nhiễm WSSV đã đượ thu thập tại á địa phương khá nhau, DNA của các mẫu tôm bị nhiễm WSSV được tách chiết và dùng làm khuôn cho phản ứng PCR để nhân đ ạn gen mã hóa h pr tein VP28 . Hình 3.1: Nhân b n vp28 b ng PCR từ các mẫu tôm nhiễm WSSV ở các địa điểm khác nhau M: Thang chuẩn DNA 1kb ; - : Đối chứng âm 1-23:Sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen vp28 từ các mẫu tôm nhiễm WSSV thu thập ở các địa phương khác nhau Kết quả PCR (hình 3.1) cho thấy, cả 23 mẫu tôm dương tính với WSSV đều có cho một băng DNA nhân bản duy nhất với kí h thướ như tính toán lý thuyết (615 bp) của vp28. Tr ng khi đó, mẫu đối hứng âm, mẫu không ó DNA thì không xuất hiện băng DNA. Kết quả này cho phép khẳng định rằng húng tôi đã nhân bản thành ông đ ạn gen mã hóa cho VP28 từ DNA hệ gen của tôm nhiễm viru đốm tr ng 3.1.2. Xác định trình tự và nghiên cứu tính đa hình của gen mã hóa VP28 Đ ạn gen nhân bản bằng PCR ủa á mẫu nghiên ứu đã đượ nhân dòng vào ve t r p E T tạ ra dạng ve t r tái tổ hợp p E -VP28 và au 10 đó á gen vp28 tr ng ve t r tái tổ hợp đã đượ xá định trình tự. hi ánh trình nu le tide và trình tự a id amin uy diễn ủa vp28 với trình tự vp28 đã đượ ông bố trướ đó (Phan Thị Phượng Trang và tập thể, năm 2003) ủa Việt Nam mang mã ố AY168644 (Bảng 3.2) thì thấy rằng ó 5 ự ai khá về trình tự nu leotide đượ phát hiện, đó là A125 , A183 , A22 , A 03 , T51 C và tr ng 5 ai khá này dẫn đến ự thay đổi trình tự a id amin (A125G ->D42G, A183G -> T76A, A403G-> T135A, T517C-> C173R). B ng 3.2: Một số sai khác của về trình tư nucl tid và acid amin của VP28 thu thập tại Việt Nam so với trình tự đ công ố (AY168644) Tên mẫu Sai khác nucleotide Sai khác mức axit amin suy diễn Só Trăng, Ninh Thuận, Cam Ranh 1.2 Khánh Hòa và Cần Giờ 1, 4, 7, 9, 10 ở thành phố Hồ Chí Minh Bến Tre, Bình Định 1, Điền Hương 1, 2, Phong Hải ở Huế Cần Giờ 2, 3, 5, 6, 8 ở thành phố Hồ Chí Minh, Kiên Giang, Hải Phòng, Trà Vinh A125G D42G Bình Định 2 A403G T135A Cần Giờ 2 A125G D42G A183G T76A A226G T517C C173R 11 Các nghiên cứu của Wang và tập thể (2008) cho thấy các vị trí quyết định kháng nguyên của VP28 là các vị trí từ a id amin 28 đến , 8 đến 93 và 171đến 20 . D đó A125 dẫn đến sự thay thế aspartatic bằng glycine (D42G) và T517C dẫn đến sự thay thế cysteine bằng arginine (C173R) của các mẫu thu được từ Bến Tre, Bình Định (1), Huế và Cần Giờ (2) ở thành phố Hồ Chí Minh là những sai khác trong vị trí quyết định kháng nguyên của VP28 và rất cần được quan tâm trong các nghiên cứu tiếp theo. 3 trong số 23 trình tự gen vp28 có những khác biệt đáng lưu với các ký hiệu 05VN.VP28.HCM2.12, 06VN.VP28.BD1.11, 0 VN.VP28.BD2.12 đã đượ đăng k trên enBank với các mã số (accession number) tương ứng là JX444992.1, JX444993.1 và JX444994.1. 3.2. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA VP28 3.2.1. Biểu hiện P28 b ng hệ thống vector pET28b trong E. coli Ve t r tái tổ hợp đượ k hiệu là pGEM – VP28 và đượ tá h ra ở dạng tinh ạ h đượ dùng làm khuôn h phản ứng PCR. Cặp mồi đặc hiệu (VP28.2 Fw/Rv được thiết kế dựa trên trình tự nu le tide hai đầu của gen vp28 ó đưa và thêm trình tự nhận biết của BamHI ở đầu và HindIII ở cuối để thuận tiện cho ghép gen vào vector pET28b về sau. Đ ạn gen vp28 nhân bản bằng ặp mồi VP28.2 Fw/Rv đượ xử lý bằng HindIII và BamHI và g n và pET28b ũng đã đượ xử l bằng ùng hai enzyme, ử dụng enzyme g n T DNA liga e. Sản phẩm g n đượ biến nạp vào chủng E. coli BL21-RIL. Vector tái tổ hợp pET28b-VP28 au đ đã được tách ra, tinh sạch và giải trình tự đ ạn gen vp28, sử dụng cặp mồi T7Fw/Rv. Kết quả đọc trình tự khẳng định ch c ch n gen vp28 đã đưa được g n và ve t r pET28b đúng trình tự và vị trí khung đọ . D đó, đủ ơ ở để khẳng định đã nhân dòng thành ông gen vp28 vào vector pET28b. 12 Kết quả biểu hiện gen vp28 được kiểm tra bằng SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch (Hình 3.6) cho thấy dịch chiết tế bào BL21-RIL mang vector pET28b-VP28 có chứa băng pr tein 28 kDa, (Đường chạy 7, 8, 9, Hình 3. A . Tr ng khi đó, ở mẫu đối chứng âm (tế bào BL21-RIL không mang vector pET28b-VP28) không ó băng pr tein này. Kết quả thẩm tách miễn dịch, sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng VP28 ũng h thấy sự có mặt của băng pr tein 28 kDa ở các mẫu tương ứng với mẫu trên SDS- PA E. (Đường chạy 7, 8, 9, Hình 3.6B). Từ đó, húng tôi kết luận rằng đã biểu hiện được VP28 ở E. coli. Hình 3.6: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu hiện VP28 ở E. coli - 1: Dịch đồng nhất tủa tế bào BL21-RIL - 7: Dịch đồng nhất tủa tế bào BL21- RI mang pET28b-VP28 - 2: Dịch chiết protein tổng số tế bào BL21-RIL - 8: Dịch chiết protein tổng số tế bào BL21-RIL mang pET28b-VP28 - 3: Dịch hòa phân đoạn tủa tế bào BL21-RIL - 9: Dịch hòa phân đoạn tủa tế bào BL21-RIL mang pET28b-VP28 - 4, 6: không tra mẫu - 5: Protein marker 925 bp 13 Dịch chiết tế bào có chứa pr tein VP28 (dưới dạng g n với Hi tag) au đó được tinh sạch bằng cách cho s c ký qua cột His-bind. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của protein VP28 (Hình 3.7A) cho thấy việc sử dụng cột His-bind trong tinh sạ h pr tein VP28 thu được hiệu quả tốt bởi hầu hết các thành phần protein phức tạp bị loại bỏ hết. Tr ng á phân đ ạn rửa chiết bằng imidaz l, húng tôi thu được chỉ một băng pr tein ó kí h thước khoảng 28 kDa, tương ứng với kí h thước của protein VP28 tái tổ hợp. So sánh kết quả thẩm tách miễn dịch (Hình 3.7B) với kết quả SDS- PAGE cho thấy những băng pr tein xuất hiện trên màng PDVF có cùng kí h thước 28 kDa với á phân đ ạn tinh sạ h khi điện di SDS-PAGE cho phép khẳng định rằng húng tôi đã tinh ạch thành công protein VP28. Kết quả định lượng protein cho thấy từ 100 ml dịch nuôi cấy, húng tôi đã thu được tổng số 1,26 mg protein VP28-Histag. Protein VP28 tinh sạ h được sử dụng làm đối chứng dương tr ng á nghiên ứu về biểu hiện trên bề mặt bào tử tiếp theo. Hình 3.7: Kết qu SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra độ tinh sạch của VP28 1: Dịch chiết tế bào có chứa protein VP28lên cột His-bind 2: Dịch rửa cột His-bind bằng đệm A có imidazol 5 mM 3: Dịch rửa cột His-bind bằng đệm A có imidazol 80 mM 14 4: Dịch rửa cột His-bind bằng đệm A có imidazol 100 mM 5: Thang chuẩn p otein 6-9 Dịch rửa chiết cột His-bind bằng đệm A có Imidazol 250 mM 3.2.2. Biểu hiện VP28 dạng dung hợp với protein CotB trên bề mặt bào tử B. subtilis Plasmid pDG364-cotB, pDG364-cotB- ST đượ tạ thành từ plasmid pD 3 ó g n thềm gen tB, tB- ST ở vị trí enzyme giới hạn BamHI, HindIII. Việ dung hợp thêm pr tein ST (26 kDa) ó thể làm tăng khả năng bộ lộ ủa pr tein ng ại lai trên bề mặt bà tử B. subtilis (Li và tập thể, 2008). Vector pDG364-cotB, pDG364-cotB-GST đượ lựa họn để biểu hiện VP28 trên bề mặt bà tử B. subtilis. Trong ve t r tái tổ hợp pDG364cotB-VP28, pDG364cotB-GST-VP28 tạ đượ đã ba gồm những vùng pr m ter tB (P tB và đ ạn gen ó kí h thướ 825 bp, 1325 bp tương ứng mã hóa h CotB ải biến và C tB ó g n ST. Đ ạn gen vp28 đượ nhân lên từ p E -VP28 bằng PCR ử dụng ặp mồi VP28.3 Fw và VP28.3 Rv có hứa trình tự ủa HindIII ở đầu Fw và EcoRI ở đầu Rv để thuận tiện cho việ đưa và vector pDG364-cotB, pDG364-cotB-GST au này. Để đưa đượ đ ạn gen vp28 vào vector pDG364-cotB, pDG364-cotB-GST cả đ ạn gen VP28 nhân bản bằng PCR và pDG364-cotB và pDG364-cotB- ST đều được xử lý bằng HindIII và EcoRI để tạ đầu g n tương thí h. en và ve t r tương ứng đượ g n bằng T4 DNA ligase và đượ biến nạp và tế bà E. coli DH5α. Các khuẩn lạc thu được sau quá trình biến nạp được kiểm tra bằng phương pháp PCR, với cặp mồi của vp28 và của vector pDG364. ết quả phân tí h PCR, đọc trình tự cho thấy gen mã hóa VP28 đã đượ đưa vào vector pDG364-cotB và pDG364-cotB- ST đúng trình tự và vị trí khung đọ . Như vậy, ó thể kết 15 luận rằng húng tôi đã tạo thành công vector tái tổ hợp pDG364-cotB- vp28 và pDG364-cotB-GST-vp28. Để dung hợp đ ạn gen cotB-vp28, cotB-GST-vp28 vào hệ gen của B. subtilis PY79 dựa trên ơ hế tra đổi chéo kép tương đồng, húng tôi đã sử dụng enzyme XhoI t mở vòng ve t r này và au đó tiến hành biến nạp vào tế bào B. subtilis PY79. Kết quả kiểm tra bằng á h nuôi ấy vi khuẩn trên đĩa thạch có hứa 1% tinh bột và chloramphenicol 5µg/ml cho thấy các khuẩn lạ được kiểm tra đều không òn khả năng tổng hợp amylase thủy phân tinh bột, hứng tỏ đ ạn gen cotB-vp28, cotB-GST-vp28 đã được dung hợp vào hệ gen B. subtilis PY79 (Hình 3.10). A B Hình 3.10: Kiểm tra sự có mặt của gen dung hợp trong DNA hệ gen B. subtilis A) Đĩa thạch LB chứa các khuẩn lạc B.subtilis mọ được trên môi trường có kháng sinh CM B) Đĩa (A au khi lựa chọn cấy chuyển ang đĩa LB+ tinh bột 1 , gạt bỏ á khuẩn lạ để kiểm tra vòng phân giải tinh bột 1-30: các khuẩn lạc kiểm tra 1-30 ĐC(-): B. subtilis PY79 dạng thể dại không chứa đ ạn gen dung hợp Để kiểm tra ch c ch n sự có mặt của gen cotB-vp28, CotB-GST- vp28 trong hệ gen của B. subtilis, chúng tôi tiến hành nuôi và tách DNA của 02 khuẩn lạ dương tính. ết quả phản ứng PCR với các cặp mồi vp28, tB, pD 3 , đã thu được những kết quả hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết. 16 Từ kết quả này, có thể kết luận rằng đã dung hợp thành công gen cotB-vp28, CotB-GST-vp28 vào hệ gen của B. subtilis và chủng tái tổ hợp đượ k hiệu là B. subtilis CotB-VP28 và B. subtilis CotB-GST-VP28. Một số khuẩn lạc của 2 chủng tái tổ hợp CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 được chọn nuôi, tạo bào tử để kiểm tra sự biểu hiện của VP28. So sánh bào tử của chủng chuẩn B. subtilis PY79 với bào tử của chủng CotB-VP28 và CotB-GST-VP28, chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt về mặt hình thái. Bào tử tạo thành bởi 3 chủng đều đạt hơn 95 . Với mụ đí h xá định VP28 có biểu hiện trên lớp áo của bào tử và dung hợp với CotB hoặc CotB-GST hay không, chúng tôi đã thu dịch chiết tổng số từ 5× 10 9 bào tử chủng B. subtilis PY79, CotB-VP28 và CotB- GST-VP28 và phân tích ự ó mặt ủa VP28 bằng SDS-PA E và thẩm tá h miễn dị h ử dụng kháng thể đa dòng kháng VP28. Theo tính toán lý thuyết, protein dung hợp giữa CotB-VP28 có KLPT khoảng 63 kDa (CotB khoảng 35 kDa và VP28 kh ảng 28 kDa), tr ng khi đó pr tein dung hợp CotB-GST-VP28 ó kí h thước khoảng 89 kDa d ó thêm GST (26 kDa). Hình 3. 13: Kết qu SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra sự biểu hiện VP28 trên bào tử B. subtilis 17 (+ : Đối chứng dương, pr tein VP28 tinh ạch M: Thang chuẩn protein 1: Bào tử B. subtilis cotB-vp28 biểu hiện protein CotB-VP28 2: Bào tử B. subtilis PY79 chủng chuẩn 3: Bào tử B. subtilis cotB-GSTvp28 biểu hiện CotB-GST-VP28 Kết quả SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch (hình 3.13) cho thấy ó sự xuất hiện băng pr tein với KLPT khoảng 63 kDa trong dịch chiết bào tử CotB-VP28 (đường chạy 1 và băng pr tein với khối lượng phân tử khoảng 89 kDa trong dịch chiết áo bào tử tương ứng với kí h thước của CotB-GST-VP28 (đường chạy 3 . Tr ng khi đó, ở đường chạy số 2 là mẫu bào tử hình thành từ tế bào B. subtilis chủng PY79 không xuất hiện băng protein nào. Áp dụng phương pháp dùng phần mềm SCION IMAGE (Nguyễn Thị Vân Anh và tập thể, 2013), với lượng VP28 chiết xuất từ 5x10 9 bào tử CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 vào khoảng 225 ng, căn ứ vào KLPT của VP28 (27,5 kDa), có thể tính toán đượ rằng ó khoảng 1000 phân tử VP28 tái tổ hợp đượ biểu hiện trên một bà tử B. subtilis. Kết quả này, bướ đầu khẳng định bào tử B. subtilis của 2 chủng tái tổ hợp đã biểu hiện protein dung hợp CotB-VP28, CotB-GST-VP28. ết quả kiểm tra khả năng biểu hiện protein VP28 và GST-VP28 trên bề mặt bào tử bằng phương pháp miễn dịch hu nh quang (hình 3.14 h thấy, ở mẫu đối chứng âm là mẫu bào tử PY79 thể dại, các tín hiệu màu đỏ quan át được rất yếu, hầu như không rõ. Tr ng khi đó, ở cùng điều kiện kích thích, mẫu bào tử CotB-VP28, CotB-GST-VP28 cho thấy các tín hiệu màu đỏ sáng nét, rõ ràng, chứng tỏ bào tử tái tổ hợp biểu hiện VP28 mạnh hơn nhiều so với dạng bào tử PY79. Như vậy, protein dung 18 hợp CotB-VP28, CotB-GST-VP28 đã đượ biểu hiện thành ông trên bề mặt bào tử B. subtilis. Hình 3.14: Ảnh chụp ết u ph n tích miễn dịch huỳnh quang kiểm tra biểu hiện CotB-VP28 và cotB-GST-VP28 trên bề mặt bào tử B. subtilis Ning và tập thể (2011) đã biểu hiện protein VP28 trên bề mặt của bào tử B. subtilis sử dụng một đ ạn DNA 825 bp mã hóa cho 275 acid amin đầu tiên của CotB làm yếu tố dung hợp. Mặc dù, mứ độ biểu hiện của protein VP28 tr ng nghiên ứu ủa nhóm tá giả này khi được kiểm tra bằng điện di gel p lya rylamide là không rõ nét, nhưng á kết quả thử nghiệm ban đầu khẳng định chế phẩm tạo ra có khả năng giúp tôm kháng lại sự tấn công của viru đốm tr ng. Các chủng CotB-VP28, CotB-GST-VP28 được lấy ra và nuôi cấy tạo bào tử và nghiên cứu một số tính chất của bào tử cho thấy bào tử tái tổ hợp B. subtilis cotB-VP28 và cotB-GST-VP28 được tạo thành tối ưu tr ng môi 19 trường DSM sau 48 giờ và đạt mật độ tương ứng là 3,1 x 10 9 , 4,2 x 10 9 , bền ở nhiệt độ 80 o C, nồng độ muối 4% và chịu được pH trong khoảng từ 2-10, có thể bảo quản ở điều kiện khô ráo ở nhiệt độ ngoài trời (25-37 o C) trong vòng 3 tháng. 3.3. HẢ NĂN PHÒN BỆNH ĐỐ TRẮN TRÊN TÔ THẺ CHÂN TRẮN CỦA BÀO TỬ TÁI TỔ HỢP 3.3.1 Sự tồn tại của bào tử B. subtilis biểu hiện VP28 trong ruột tôm thẻ chân trắng Thứ ăn au khi trộn với bào tử và dầu bao áo (chất kết dính) có cảm quan về màu s không thay đổi, không bị dính bết và vẫn là dạng hạt nhỏ riêng rẽ nhau. Kết quả đếm thể hiển các mẫu thứ ăn trộn bào khi kiểm tra đúng chủng vi khuẩn như ghi trên nhãn ản phẩm và có nồng độ gần với nồng độ dự kiến ban đầu khi trộn, khoảng 1 x 10 9 CFU/gam. Kết quả đánh giá mứ độ sống ót ủa bà tử ở nồng độ pha loãng 10 -2 , trong ruột tôm (hình 3.22) h thấy khi h tôm ăn thứ ăn trộn bào tử B. subtilis CotB- VP28 và C tB-GST-V28, mật độ bào tử tr ng ruột tôm tăng dần the thời gian, chứng tỏ sự tồn tại của bào tử trong ruột tôm. Hình 3.22: Sự tồn tại của bào tử B. subtils biểu hiện vp28 trong ruột tôm thẻ chân trắng 20 3.3.2 Đánh giá h năng ích thích miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng của bào tử tái tổ hợp Để đánh giá khả năng kí h thí h miễn dịch của bào tử tái tổ hợp, h ạt độ enzyme superoxide dismutase (SOD) và h ạt độ phenoloxidase (PO) tr ng dị h huyết tương ủa á á mẫu tôm thí nghiệm đượ xá định. ết quả thu đượ (hình 3.25) h thấy hoạt độ PO ở tất cả các mẫu tôm được cho thứ ăn không bổ sung hay có bổ sung bào tử thể dại PY79, bào tử B. subtillis CotB-GST-VP28 và CotB-VP28 thấp nhất ở thời điểm 0 ngày, tăng lên sau 7 hoặc 14 ngày tùy theo từng lô. Đáng hú là mẫu tôm ăn B. subtilis C tB-VP28 ó h ạt độ PO a hơn đáng kể (30%) với mẫu đối hứng. Hình 3.25. Hoạt độ phenoloxidase (PO) trong hemolymph của tôm thẻ chân trắng ăn à tử tái tổ hợp Kết quả phân tí h h ạt độ SOD (hình 3.26) ở mô thịt ủa tôm cho thấy có sự tăng h ạt độ SOD the thời gian, á hế phẩm B. subtilis dạng dại hay tái tổ hợp đều ó tá dụng làm tăng h ạt độ SOD ủa tôm. Đặ biêt, hế phẩm B. subtilis C tB- ST-VP28 làm tăng h ạt độ SOD rõ rệt nhất, 21 a nhất ở ngày 1 và tăng 84,3% với đối hứng. Tuy nhiên, hưa thấy ó ự khá biệt rõ rệt về mứ tăng h ạt SOD giữa hế phẩm B. subtilis CotB-VP28 và B. subtilis PY79. Hình 3.26. Hoạt độ enzyme SOD trong mô thịt của tôm thẻ chân trắng 3.3.3. Đánh giá h năng o hộ trên tôm thẻ chân trắng của bào tử tái tổ hợp WSSV đượ phân lập từ nguồn tôm bệnh tại trang trại nuôi tôm ở Điền Hương, Ph ng Điền, Huế. ẫu tôm bệnh đượ kiểm tra bằng PCR để khẳng định nhiễm WSSV trướ khi tiến hành hiết viru . Bằng phương pháp Real-time PCR húng tôi đã xá định được số bản copy của WSSV trong dịch nghiên ứu là khoảng 7,73 x10 8 bản copy/ml. Tôm đượ h nhiễm WSSV để xá định liều gây chết 75% (LD75). Kết quả thu được từ thí nghiệm h thấy liều LD75 là 1,3x10 4 bản a /lít. Nhằm xá định khả năng phòng bệnh đốm tr ng ở tôm thẻ chân tr ng của bào tử B. subtilis CotB-VP28 và C tB- ST-VP28, tôm đượ h ăn thứ ăn the á ông thứ : lô đối chứng âm, lô đối chứng dương ăn thức ăn công nghiệp, còn các lô PY79, cotB-VP28 và cotB-GST-VP28 ăn thức 22 ăn ông nghiệp đã bổ xung loại bào tử tương ứng với một độ 10 9 . Các lô lặp lại 2 lần trong mỗi lần thử nghiệm. Sau 1 ngày, trừ lô đối chứng âm tất ả á lô tôm còn lại đều đượ ông ường độc bằng WSSV với nồng độ 1,3x10 4 bản a /lít. Tôm tiếp tụ h ăn thứ ăn thử nghiệm tương ứng và theo dõi số lượng tôm òn ống trong 14 ngày ngày tiếp theo. Kết quả theo dõi quá trình nuôi tôm và đánh giá ố tôm ống ót qua thí nghiệm (hình 3.32) cho thấy tôm ở lô đối hứng dương ó biểu hiện ăn ít và b t đầu hết au 2 ngày. Tỷ lệ hết tăng nhanh từ ngày thứ đến ngày thứ 9 và 100% tôm hết ở ngày 11 au khi ường độ . Tại lô thử nghiệm cho tôm ăn thứ ăn ó bổ sung bà tử PY 9, tôm ó hiện tượng ăn ít ở ngày thứ 5. Tỷ lệ tôm hết tăng nhanh từ ngày thứ đến ngày thứ 11, và tỷ lệ hết lên tới 94,5% sau 14 ngày. Tại lô h ăn thứ ăn trộn bào tử cotB- VP28, cotB-GST-VP28 và lô đối chứng âm tỷ lệ chết sau 14 ngày theo ghi nhận đượ tương ứng là 19,23%, 26,67% và 25,81%. Hình 3.32 Tỷ lệ chết tích lũy của các lô tôm khi đánh giá h năng o hộ của bào tử B. subtilis tái tổ hợp 23 Như vậy, ó thể thấy rằng, mứ độ bảo hộ tôm thẻ chân tr ng hống lại WSSV của các dạng bảo tử CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 (ở mật độ bào tử 1 x 10 9 CFU/g thứ ăn) tương ứng là 81% và 73,3%. Các giá trị này đều cao hơn mức hiệu quả quy ướ (RPP≥ 0 khi kiểm định hiểu quả bảo vệ của vaccine ở thủy sản và thỏa mãn á điều kiện về đánh giá hiệu quả vaccine dùng cho thủy sản của Ủy ban châu Âu. D đó hế phẩm thử nghiệm này có tiềm năng bảo vệ tôm chống lại bệnh đốm tr ng do WSSV gây ra. Nhìn hung lại, húng tôi thấy rằng hế phẩm bà tử B. subtilis C tB-VP28 và C tB-GST-VP28 tạ ra tr ng nghiên ứu này thể hiện tính bền với nhiệt, ổn định tr ng một dải pH rộng (2-10), hịu đượ nồng độ muối a (4%). Cá hế phẩm này ó khả năng kí h thí h đáp ứng m