Tóm tắt Luận án Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2 - Oxoindolin

ết thu đƣợc với hiệu suất khá thấp (dƣới 40%). Trong khi đó, nếu sử dụng dung môi acetonitril thì sau khi kết thúc phản ứng có thể dễ dàng loại bỏ dung môi bằng phƣơng pháp cất quay và tinh chế sản phẩm chỉ cần qua một bƣớc, lƣợng sản phẩm tinh khiết thu đƣợc với hiệu suất tƣơng đối cao 9 khoảng trên 60%. Vì vậy, dung môi acetonitril là dung môi đƣợc lựa chọn để tiến hành các phản ứng đóng vòng để tạo khung 1,2,3-triazol. Nhìn chung, phản ứng Click là một phản ứng tƣơng đối dễ thực hiện, tiến hành trong điều kiện đơn gian và có hiệu suất cao từ 58,2% đến 89,0%. Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic: phản ứng cuối cùng của mỗi chuỗi phản ứng để tạo ra các acid hydroxamic theo thiết kế ban đầu. Cơ chế phản ứng đƣợc minh hoạ trong Sơ đồ 4.3 nhƣ sau: Sơ đồ 4.3. Sơ đồ cơ chế phản ứng tạo acid hydroxamic từ ester Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic từ ester và hydroxylamin là một phản ứng N-acyl hoá theo cơ chế thế nucleophil. Phản ứng chỉ có thể diễn ra trong môi trƣờng kiềm mạnh pH > 10. Nguyên liệu hydroxylamin tham gia phản ứng thƣờng đƣợc dùng dƣ khá nhiều so với ester để đảm bảo thu đƣợc tối đa sản phẩm acid hydroxamic từ một lƣợng ester ban đầu. Theo các tài liệu tham khảo, hydroxylamin có thể dùng dƣới dạng muối NH2OH. HCl và khi tham gia phản ứng cần sự có mặt của các chất kiềm mạnh để chuyển hoàn toàn thành dạng base. Do đó, các phản ứng tạo acid hydroxamic trong luận án đều sử dụng NaOH thêm vào hỗn hợp phản ứng với tỷ lệ gấp đôi số mol NH2OH.HCl. Lƣợng NaOH dùng dƣ để chuyển hoàn toàn hydroxylamin thành dạng base, đồng thời tạo đƣợc pH môi trƣờng đủ cao để phản ứng có thể diễn ra. Ngoài ra, do cấu trúc của các acid hydroxamic đƣợc thiết kế khá cồng kềnh, không có nhiều nhóm chức thân nƣớc nên khả năng tan trong nƣớc có thể dự đoán là rất thấp (thực tế là các chất đều không tan trong nƣớc) nên khi đƣợc tạo thành có thể kết tủa ngay trong bình phản ứng, cản trở sự tƣơng tác của các ester với hydroxylamin. Do đó, một lƣợng dƣ NaOH là cần thiết để chuyển dạng acid sang dạng muối hydroxamat tan đƣợc trong hỗn hợp dung môi phản ứng. Và sau khi kết thúc phản ứng cần acid hoá dung dịch về pH = 3 – 4 để thu đƣợc sản phẩm acid hydroxamic dạng kết tủa. Phản ứng tạo acid hydroxamic của các chất trong luận án có hiệu suất phản ứng dao động từ 45,0 đến 82,5%. 10 4.2. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC Tất cả các chất sau khi tổng hợp và tinh chế đƣợc đo phổ IR, MS, 1H- NMR và 13 C-NMR để xác định cấu trúc. Ngoài ra, các chất trung gian đƣợc tạo thành trong quá trình tổng hợp chất Ia là 3.2a, chất trung gian trong quá trình tổng hợp IXa gồm chất 3.7, 3.24, 3.25a cũng đƣợc tiến hành đo phổ MS, 1 H-NMR và 13 C-NMR. Các chất Ia, VIIa và IXa đƣợc chọn làm chất đại diện để đo phổ 2D NMR HMBC và HSQC. 4.2.1. Phổ hồng ngoại Căn cứ các kết quả trên phổ đồ và các giá trị tham khảo trong tài liệu có thể biện luận một số nhóm chức nhƣ sau: - Trong vùng 3400 – 3100 của các chất đều có từ 1 đến 3 đỉnh hấp thụ mạnh và rộng. Các đỉnh này đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết N- H (xuất hiện trên phổ với số sóng khoảng 3474 –3307) và O-H (xuất hiện trên phổ với số sóng khoảng 3296 - 3137). Sự có mặt của các dao động hóa trị N-H, O-H kết hợp với sự có mặt của dao động hóa trị của liên kết C=O là chứng minh cho sự hiện diện của nhóm chức acid hydroxamic ở tất cả các chất mục tiêu tổng hợp đƣợc. - Các vòng benzen có dao động hóa trị C-H vòng thơm xuất hiện trong khoảng 3089 – 3004 cm-1 và dao động hóa trị C=C vòng thơm xuất hiện trong khoảng 1615 – 1456 cm-1. - Phần cầu nối alkyl của các chất tổng hợp đƣợc cũng cho thấy sự có mặt trên phổ đồ với dao động hóa trị bất đối xứng CH2 từ 2998 – 2903 cm -1 và dao động hóa trị đối xứng CH2 từ 2895 – 2834 cm -1. Vị trí xuất hiện của hai đỉnh hập thụ này tƣơng đối cố định trong mỗi dãy dẫn chất. - Trong vùng khoảng 1660 –1820 cm-1 của hầu hết các chất đều có hai đỉnh hấp thụ với cƣờng độ mạnh và độ rộng trung bình. Đây là dải phổ đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết C=O. Tƣơng ứng với hai nhóm chức carbonyl trong cấu trúc của các chất mục tiêu gồm nhóm C=O ở vị trí số 2 trên khung indolin và nhóm C=O của chức acid hydroxamic. Giá trị của 2 đỉnh hấp thụ dao động trong khoảng 1685-1638 và 1735-1703 cm-1. 4.2.2. Phổ khối lượng Phổ khối lƣợng đóng vai trò quan trọng trong khẳng định cấu trúc các chất tổng hợp và thƣờng đƣợc dùng để kiểm chứng xem sản phẩm phản ứng đƣợc tạo thành có khối lƣợng phân tử đúng nhƣ công thức dự kiến hay không. Sau khi phân tích ion phân tử thu đƣợc trên phổ khối lƣợng, kết quả cho thấy tất cả các chất đều có sự phù hợp giữa kết quả đo khối phổ với công thức phân tử dự kiến. Một số chất trên phổ đồ xuất hiện pic M+23 tƣơng ứng với ion [M+Na]+ thay vì pic [M+H]+ trên phổ ESI(+). Đây là hiện tƣợng thƣờng gặp trong phƣơng pháp đo ESI vì dòng khí mang hoặc 11 bên trong thiết bị có thể chứa ion H+, Na+, K+... Nhƣ vậy, phổ khối lƣợng là cơ sở để khẳng định các chất tổng hợp đƣợc có công thức phân tử đúng nhƣ dự kiến. 4.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phổ cộng hưởng từ proton 1H-NMR: 4.2.3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của dãy chất Ia-g, IIa-g và IIIa-g - Proton vị trí 4” (H-4”) có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 7,03 – 8,01 ppm. Tín hiệu cộng hƣởng của proton H-4” có thể có dạng singlet, doublet hoặc doublet-doublet, do có tƣơng tác ghép cặp với proton H-5”, JH4”-H5”(ortho) = 7,0 – 8,5 Hz, tƣơng tác với proton H-6”, JH4”-H6”(meta) = 2,0 – 2,5 Hz hoặc tƣơng tác với F, JH4”-F(ortho) = 6,5 – 8,5 Hz. - Proton vị trí 5” có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 7,07–7,15 ppm, tín hiệu cộng hƣởng có dạng triplet do có tƣơng tác ghép cặp với proton H- 4” và H-6” ở các chất không có nhóm thế hoặc các chất mang nhóm thế 7”- Cl. Hằng số ghép cặp của proton H-5” với hai proton bên cạnh là JH5”-4”(ortho) = JH5”-6”(ortho) = 7,5–8,5 Hz. - Proton vị trí 6” có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 6,94 – 7,56 ppm. Tín hiệu cộng hƣởng của proton H-6” có các dạng là doublet, triplet, doublet-doublet hoặc doublet-triplet. Dạng tín hiệu cộng hƣởng doublet và doublet-doublet của proton H-6” có thể xuất hiện ở phổ đồ của các chất mang nhóm thế không phải F ở vị trí 5”, 7” do tƣơng tác với các proton H- 5”, 7” và 4”. Dạng tín hiệu cộng hƣởng triplet hoặc doublet-triplet xuất hiện trên phổ đồ của các chất không mang nhóm thế hoặc mang nhóm thế F ở vị trí 5” do tƣơng tác với H-4”, 5”, 7” và nguyên tử F. - Proton vị trí 7” có độ dịch chuyển hóa học tƣơng đối ổn định, ít bị ảnh hƣởng bởi các nhóm thế hút hay đẩy electron, chỉ thay đổi trong một khoảng hẹp 6,82 – 7,02 ppm. Dạng tín hiệu cộng hƣởng của proton H-7” đa số trƣờng hợp là doublet do có tƣơng tác ghép cặp với H-6”, JH7”-6”(ortho) = 7,5 – 8,5 Hz. Riêng với hai chất có nhóm thế 5”-F (Ib, IIIb), tín hiệu cộng hƣởng có dạng doublet-doublets do H-7” ngoài tƣơng tác với H-6” còn có tƣơng tác ghép cặp với nguyên tử F, JH7”-F(meta) = 4,0 Hz. - Hai proton của cầu nối methylen cũng có độ dịch chuyển hóa học tƣơng đối ổn định, nằm trong khoảng 4,82 – 4,95 ppm. Ngoại trừ, các dẫn xuất có nhóm thế 7”-Cl, pic của proton methylen bị dịch chuyển về vùng trƣờng thấp nằm trong khoảng 5,21 – 5,30 ppm. - Khung benzen trong phần cầu nối có dạng thế di-para, có 4 proton tạo thành hai cặp đối xứng là cặp 2’, 6’ và 3’, 5’. Vị trí cộng hƣởng của các cặp tƣơng đối cố định với δH3’-H5’ = 7,19 – 7,35 ppm, δH2’-H6’ = 7,51 – 7,54 ppm. Tín hiệu cộng hƣởng của cả hai cặp proton luôn là doublet có hằng số ghép cặp JH2’-H3’(ortho) = JH5’-H6’(ortho) = 7,0 – 8,5 Hz. - Cầu nối –CH2=CH2- có hai proton có giá trị nằm trong khoảng δH-2 = 6,42 12 – 6,49 ppm, δH-3 = 7,41 – 7,43 ppm. Hằng số ghép cặp qua lại giữa hai proton này có giá trị JH2-H3 = JH3-H2 = 15,5 -16,0 Hz, đây là hằng số ghép cặp đặc trƣng cho cấu hình trans ở nối đôi. Do đó, có thể khẳng định cấu hình của các acid hydroxamic tổng hợp đƣợc là cấu hình E. - Cấu trúc của các chất còn có 2 đến 3 proton rất linh động của các nhóm chức -CO-NH-OH và =NOH. Do tính linh động nên tín hiệu cộng hƣởng của các proton này có hình dạng singlet giãn rộng và đôi khi có thể không xuất hiện trên phổ đồ. Proton của nhóm oxim (-NOH) chỉ có mặt trong cấu trúc của các chất dãy I, có giá trị độ dịch chuyển hóa học khoảng 13,50 – 13,90 ppm. Về hai proton của nhóm chức acid hydroxamic, nhóm NH nằm gần nhóm C=O hơn so với nhóm OH nên bị ảnh hƣởng nhiều hơn của hiệu ứng hút điện tử của nhóm carbonyl. Do đó nên proton của –NH cộng hƣởng ở trƣờng yếu hơn (H(NH) = 10,73 – 10,80 ppm) và proton của –OH cộng hƣởng ở vùng trƣờng mạnh hơn (H(OH) = 9,01 – 9,05 ppm). - Ngoài các proton trên khung cấu trúc chung phổ đồ cũng xuất hiện đủ và có hình dạng tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng cho các nhóm thế. Cụ thể, proton nhóm –CH3 trong các chất Ie, IIe, IIIe luôn xuất hiện tại vị trí cộng hƣởng 2,24 – 2,26 ppm với hình dạng singlet và độ lớn 3 proton. Proton nhóm –OCH3 trong các chất If, IIf, IIIf luôn xuất hiện tại vị trí cộng hƣởng 3,72 – 3,74 ppm với hình dạng singlet và độ lớn 3 proton. Bốn proton của vòng dioxolan chia làm hai vân cộng hƣởng multiplet nằm trong khoảng 4,37 – 4,44 ppm và khoảng 4,30 – 4,39 ppm. Ba proton của nhóm =NOCH3 của các chất dãy IIIa-g có vị trí cộng hƣởng nằm trong khoảng 4,23 – 4,27 ppm với hình dạng singlet và độ lớn là 3 proton. 4.2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của dãy chất IVa-c, Va-g, VIa-g, VIIa-g, VIIIa-g Các proton phần khung chung và các proton đặc trƣng cho các nhóm chức của các chất đều thể hiện trên phổ đồ phù hợp với công thức dự kiến. - Các dẫn chất trong năm dãy gồm IV - VIII đều có phần khung indolin và các nhóm thế trên khung tƣơng tự nhau. Các proton đặc trƣng trên khung indolin của các chất có các vị trí cộng hƣởng tƣơng tự nhau giữa các dãy và khá tƣơng đồng với các proton khung indolin đã đƣợc biện luận ở dãy I. - Proton của khung triazol H-5’ trong các dẫn chất đƣợc đặc trƣng bởi một tín hiệu cộng hƣởng singlet và có độ dịch chuyển hóa học khá cố định trong khoảng 8,02 – 8,10 ppm. Thêm vào đó, trên phổ cộng hƣởng từ dị hạt nhân HMBC của chất VIIa cũng cho thấy C-5’ có tƣơng tác ghép cặp với hai nhóm methylen bên cạnh ở vị trí 6, 6’. Nhƣ vậy, quá trình đóng vòng Click để tổng hợp các dẫn chất này cũng chỉ tạo ra một sản phẩm duy nhất là vòng triazol thế ở vị trí 1,4. 13 - Hai proton của nhóm methylen cầu nối vị trí 6’ có độ dịch chuyển hóa học khoảng δH-6’ = 4,95 - 4,98 ppm, ngoại trừ các dẫn xuất có nhóm thế 7”-Cl có δH- 6’ = 5,31 ppm do ảnh hƣởng hiệu ứng hút electron của nhóm -Cl. - Các proton của phần mạch alkyl đƣợc đặc trƣng bởi các tín hiệu cộng hƣởng triplet hoặc multiplet nằm trong khoảng 4,28 - 1,17 ppm. - Các proton của nhóm thế -CH3 và -OCH3 cũng xuất hiện đầy đủ trên các phổ đồ của các dẫn chất tƣơng ứng với δH(CH3) = 2,27 ppm và δH(OCH3) = 3,72 ppm. - Ba proton của hai nhóm -NOH và -NHOH đều là các proton rất linh động, xuất hiện trên phổ ở vùng trƣờng thấp và có dạng phổ singlet giãn rộng khá giống nhau. Căn cứ theo tài liệu tham khảo và sự biến mất của các pic vùng trên 13 ppm ở những chất không có -NOH, các proton này đƣợc xác định có độ dịch chuyển hóa học là δH(NOH) = 13,43 - 13,84 ppm, δH(NH) = 10,34 - 10,48 ppm, δH(OH) = 8,63 - 8,82 ppm. Thêm vào đó, phổ HMBC của chất VIIa cũng cho thấy proton ở vị trí 13,47 ppm (NOH) có tƣơng tác ghép cặp với C-3” trên khung indolin và proton ở vị trí 10,31 ppm (NH) có tƣơng tác ghép cặp với C-1 ở phần nhóm chức acid hydroxamic. 4.2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của dãy chất IXa-g và Xa-c Phổ cộng hƣởng từ proton 1H-NMR: - Các dẫn chất trong năm dãy gồm IX - X đều có phần khung indolin và các nhóm thế trên khung tƣơng tự nhau. Các proton đặc trƣng trên khung indolin của các chất có các vị trí cộng hƣởng tƣơng tự nhau giữa các dãy và khá tƣơng đồng với các proton khung indolin đã đƣợc biện luận ở dãy I, II. - Khung benzen trong phần cầu nối của dãy chất IX và X tƣơng tự nhƣ phần cầu nối của các chất dãy I, II, III. Và vị trí cộng hƣởng cũng nhƣ hình dạng tín hiệu cộng hƣởng của các cặp proton 2’, 6’ và 3’, 5’ cũng tƣơng tƣơng giữa các dãy chất. Độ dịch chuyển hóa học của proton 2’, 6’ và 3’, 5’ nằm trong các khoảng lần lƣợt là 7,52 – 7,54 và 7,25 – 7,29 ppm. Tín hiệu cộng hƣởng của hai cặp proton đều có dạng doublet với JH2’-H3’(ortho) = JH3’- H2’(ortho) = 7,5 – 8,5 Hz. - Hai proton của vùng cầu nối -CH=CH- có vị trí cộng hƣởng nằm trong các khoảng là δH2 = 6,44 – 6,45 ppm, δH3 = 7,41 – 7,43 ppm. Hằng số ghép cặp giữa H-2 và H-3 có giá trị khoảng 15,5 – 16,0 Hz, đặc trƣng cho cấu hình trans của nối đôi. - Cấu trúc của các chất dãy IX, X có hai cầu nối methylen và do ảnh hƣởng khác nhau bởi các nhóm thế bên cạnh nên hai cụm proton methylen có vị trí cộng hƣởng rất khác nhau. Hai proton của methylen vị trí 7’ có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 5,56 – 5,57 ppm. Hai proton của methylen vị trí 6” có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 4,98 – 5,32 ppm. Hai proton của mỗi nhóm methylen đều tƣơng đƣơng nên tín hiệu cộng hƣởng có dạng singlet. 14 - Vòng triazol có một proton luôn xuất hiện ở dạng một tín hiệu cộng hƣởng singlet và có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 8,11 – 8,15 ppm. Trên phổ HMBC của chất IXa, carbon vị trí 5” trên vòng triazol (C-5”) thể hiện tƣơng tác rõ ràng với hai cặp proton của hai cầu nối bên cạnh H-6” và H-7’. Dữ liệu này kết hợp với 1 tín hiệu cộng hƣởng duy nhất của H-5” là cơ sở để khẳng định phản ứng đóng vòng Click chỉ tạo ra 1 sản phẩm duy nhất theo hƣớng các mạch nhánh gắn vào vị trí 1,4 của vòng triazol. - Bên cạnh đó, các proton của nhóm -CH3, -OCH3 và -NOCH3 cũng xuất hiện đầy đủ trên các phổ đồ của các dẫn chất ở các khoảng tƣơng ứng là 2,26 - 2,27 ppm 3,84 ppm và 4,20 - 4,23 ppm. Các proton của nhóm chức acid hydroxamic có vị trí hấp thụ lần lƣợt trong các khoảng δH(NH) = 10,75- 10,77 ppm, δH(OH) = 9,04 - 9,05 ppm. Phổ cộng hưởng từ carbon 13C-NMR: - Cấu trúc của các chất có hai nguyên tử carbon của nhóm carbonyl, có vị trí cộng hƣởng ở vùng trƣờng thấp nhất trên phổ đồ, độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 158,72 - 172,82 ppm. - Các carbon của khung indolin, vòng benzen, cầu nối -CH=CH- có vị trí cộng hƣởng nằm ở khoảng giữa từ 109,92 - 156,82 ppm. - Carbon của các cầu nối methylen và mạch nhánh alkyl có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 22,01 - 49,33 ppm.. Dãy II, III, X có thêm nhóm =NOCH3 và vòng dioxolan với độ dịch chuyển hóa học của các carbon khoảng 64,48 - 66,83 ppm. - Phổ đồ các chất cũng đều cho tín hiệu cộng hƣởng của các carbon có trên nhóm thế -CH3 ( = 20,46 – 20,97 ppm), -OCH3 ( = 55,63 – 55,68 ppm). Riêng các chất có nhóm thế F còn xuất hiện thêm tƣơng tác từ của F với các carbon lân cận trên khung indolin làm tách đôi một số pic. 4.3. HOẠT TÍNH SINH HỌC 4.3.1. Bàn luận hoạt tính sinh học của dãy dẫn chất Ia-g và IIa-g Hình 4.1: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của dãy chất Ia-g, IIa-g, IIIa-g 15 Trong thứ nghiệm Western blot (Hình 4.1), khi nồng độ acetyl-histon H3 và H4 xuất hiện rõ ràng khi có mặt các chất Ia, Ib, Id-f, IIa-c, IIe-f gợi ý rằng các chất này có khả năng ức chế HDAC mạnh. Khi có mặt chất Ic, IId, acetyl-histon H3 và H4 cũng xuất hiện nhƣng mức độ thấp hơn nhiều. Gợi ý rằng chất Ic, IId cũng có khả năng ức chế HDAC nhƣng yếu hơn các chất kể trên. Riêng với vị trí trên Hình 4.1 tƣơng ứng với thí nghiệm có mặt Ig và IIg, hầu nhƣ không thấy sự xuất hiện của acetyl-histon H3 và H4. Chứng tỏ HDAC không bị ức chế và quá trình deacetyl hoá vẫn diễn ra ở nồng độ thử nghiệm. Kết quả thí nghiệm Western blot nhìn chung cho thấy sự ảnh hƣởng khác nhau của các nhóm thế trên vòng indolin đối với hoạt tính ức chế enzym, các chất có nhóm thể Cl ở vị trí số 7 có thể không có hoạt tính ức chế enzym tốt bằng các dẫn xuất khác. Bảng 4.1: Kết quả thử độc tính tế bào của dãy chất Ia-g và IIa-g Chất R LogP Độc tính trên tế bào ung thư (IC50, M) Kết quả docking (kcal/mol) SW620 PC3 AsPC-1 Ia H 2,11 2,26 1,33 0,95 -9,40 Ib 5-F 2,27 0,91 1,29 1,46 -9,00 Ic 5-Cl 2,67 0,90 0,47 0,81 -9,00 Id 5-Br 2,94 1,41 0,91 0,63 -9,10 Ie 5-CH3 2,60 1,93 1,20 0,83 -8,30 If 5-OCH3 1,98 2,46 1,13 0,68 -9,00 Ig 7-Cl 2,67 2,24 1,94 1,68 -8,90 IIa H 2,37 1,96 1,14 1,23 -8,60 IIb 5-F 2,53 0,71 0,93 0,56 -8,60 IIc 5-Cl 2,93 1,10 0,88 0,82 -8,40 IId 5-Br 3,20 0,80 0,81 1,11 -8,30 IIe 5-CH3 2,86 1,23 1,37 1,79 -8,60 IIf 5-OCH3 2,25 5,25 4,31 4,55 -8,30 IIg 7-Cl 2,93 3,15 4,54 3,58 -8,40 SAHA 1,44 3,26 1,75 3,19 -7,40 Dữ liệu trong Bảng 4.1 chỉ ra rằng trừ chất IIf, IIg, các chất còn lại đều có độc tính tế bào tƣơng đƣơng hoặc mạnh hơn SAHA trên các dòng tế bào thử nghiệm. Chất Ia và IIa có độc tính tế bào tƣơng đƣơng nhau, cho thấy việc methyl hoá nhóm oxim trên indolin vẫn duy trì đƣợc hoạt tính sinh học tốt. Các nhóm thế hút electron (-F, -Cl, -Br) đƣợc thế vào vị trí 5 trên vòng 16 indolin (chất Ib-d, IIb-d) dƣờng nhƣ làm tăng độc tính tế bào, trong khi đó thế nhóm hút electron (-Cl) vào vị trí 7 (chất Ig, IIg) làm giảm rõ rệt hoạt tính kháng tế bào ung thƣ. Ngƣợc lại, với hai nhóm đẩy electron methyl và methoxy, nhóm thế methyl có tác dụng làm tăng nhẹ hoạt tính sinh học (so sánh Ie, IIe với chất Ia, IIa), nhƣng nhóm thế methoxy không thể hiện tác dụng này, thậm chí nhóm thế methoxy gắn trên khung 3-methoxim-2- oxoindolin còn làm giảm độc tính đáng kể so với chất không nhóm thế. Nhìn chung, với kết quả thu đƣợc có thể khẳng định rằng các acid hydroxamic mang khung 3-oxim/methoxim-2-oxoindilin là những chất có tiềm năng ức chế HDAC tốt và tác dụng độc tính tế bào rất khả quan. Độc tính của các chất đa số tƣơng đƣơng hoặc mạnh hơn so với SAHA, hứa hẹn khả năng phát triển khung cầu trúc này nhằm tìm kiếm các chất ức chế HDAC tiếp theo. 4.3.2. Bàn luận hoạt tính sinh học của dãy chất IIIa-g Trong thử nghiệm Western blot có 6 trong 7 chất thể hiện tác dụng ức chế HDAC dẫn đến xuất hiện các vết acetyl-H3 và H-4. Chất IIIg với nhóm thế -Cl ở vị trí số 7 trên khung indolin không thể hiện tác dụng ức chế HDAC ở nồng độ thử nghiệm. Trong khi đó, chất IIIc cũng mang nhóm thế -Cl nhƣng ở vị trí số 5 vẫn có tác dụng ức chế enzym rõ rệt. Nhƣ vậy, vị trí nhóm thế có thể là yếu tố ảnh hƣởng lớn đến tác dụng sinh học của các chất và vị trí số 7 trên khung indolin có thể không phù hợp để gắn các nhóm thế. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả thử độc tính tế bào. Trong đó, trên cả 3 dòng tế bào chất IIIg đều có tác dụng yếu nhất trong cả dãy chất và nồng độ cần để gây độc tính đƣợc trên 50% các tế bào ung thƣ cũng khá cao. Với dãy dẫn chất này, kết quả thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào cũng khá tƣơng đồng ở cả các chất còn lại. Kết quả thử Weston blot cho thấy vết acetyl-H3 và acetyl-H4 của SAHA xuất hiện rõ nét hơn cả 7 chất IIIa-g. Giá trị IC50 khi thử nghiệm trên 3 dòng tế bào SW620, AsPC-1 và PC3 của SAHA cũng tƣơng ứng thấp hơn tất cả các chất IIIa-g, thể hiện độc tính của SAHA mạnh hơn cả 7 chất dãy IIIa-g. Khi so sánh giữa các chất với nhau không nhận thấy có xu hƣớng khác biệt rõ ràng giữa các nhóm thế hút và đẩy electron, hay kích thƣớc nhóm thế. Khi so sánh kết quả 17 thử độc tính tế bào của dãy IIIa-g với hai dãy Ia-g, IIa-g có thể thấy rõ sự suy giảm độc tính. Tất cả các chất của dãy IIIa-g đều yếu hơn các chất của dãy Ia-g, IIa-g. Vị trí số 3 trên khung indolin có thể không phù hợp với khung vòng lớn nhƣ spiro[1,3]-dioxolan. Bảng 4.2: Kết quả thử độc tính tế bào của dãy chất IIIa-g Chất R LogP Độc tính trên tế bào ung thư, (IC50, M) Kết quả docking (kcal/mol) SW620 PC3 AsPC-1 IIIa H 2,36 3,60 18,89 18,45 -9,80 IIIb 5-F 2,51 3,30 11,50 7,28 -9,90 IIIc 5-Cl 2,91 3,42 17,44 22,35 -9,90 IIId 5-Br 3,18 3,05 7,30 6,83 -9,90 IIIe 5-CH3 2,84 3,44 12,25 7,47 -9,70 IIIf 5-OCH3 2,23 4,62 22,70 27,25 -9,90 IIIg 7-Cl 2,91 38,35 >100 69,51 -9,60 SAHA 1,44 1,44 5,30 7,04 -7,40 4.3.3. Bàn luận hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất IVa-c, Va-g, VIa-g Các dãy dẫn chất này đƣợc tạo từ hai phần cấu trúc chính là khung 3- (hydroxyimino)-2-oxoindolin đóng vai trò nhóm nhận diện bề mặt và cầu nối mang vòng triazol và mạch carbon no với độ dài thay đổi từ 2C-4C. Dựa vào chiều dài cầu nối 6C của SAHA, đầu tiên luận án thiết kế khoảng cách giữa vòng triazol và nhóm chức acid hydroxamic là 2C. Nhƣng do liên kết C=N và C-N có độ dài ngắn hơn liên kết C-C nên cầu nối có thể cần dài hơn 2C. Do đó, luận án thiết kế thêm dãy dẫn chất Va-g với khoảng cách tăng lên là 3C, đây là dãy chất mục tiêu nghiên cứu. Cùng với đó, dãy chất VIa-g với khoảng cách 4C cũng đƣợc thiết kể để so sánh kết quả với dãy Va-g. Nhìn chung dãy chất Va-g có hoạt tính ức chế enzym cao hơn dãy VIa-g. Một xu hƣớng tƣơng tự cũng đƣợc nhận thấy với khả năng gây độc tế bào khi so sánh giữa hai dãy chất Va-g và VIa-g. Độc tính tế bào của dãy IVa-c đặc biệt yếu hơn hẳn so với cả hai dãy Va-g và VIa-g. Nhƣ vậy, từ kết quả thực nghiệm cho thấy, khi khung 4-methyl-1H-1,2,3-triazol đóng vai trò là một phần cấu trúc của cầu nối thì một mạch alkyl dài 3C là phù hợp nhất cho hoạt tính sinh học. 18 Bảng 4.3: Kết quả thử tác dụng ức chế enzym HDAC2 và độc tính tế bào của các dãy dẫn chất IVa-c, Va-g, VIa-g Chất R LogP Độc tính trên tế bào ung thư, IC50 (µM) Tác dụng ức chế HDAC2 (IC5i0, M) Kết quả docking (kcal/mol) SW620 PC3 AsPC-1 IVa H 0,41 29,0 >30 >30 1,70 -7,40 IVb 5-F 0,61 >30 >30 >30 6,24 -7,60 IVc 5-Cl 1,05 >30 >30 >30 2,80 -7,70 Va H 0,90 26,26 >30 26,87 6,16 -7,50 Vb 5-F 1,10 23,64 >30 >30 8,27 -7,70 Vc 5-Cl 1,54 13,46 16,28 11,60 1,72 -7,80 Vd 5-Br 1,79 2,93 6,08 3,01 3,53 -7,80 Ve 5-CH3 1,44 0,73 0,76 0,49 1,28 -8,10 Vf 5-OCH3 0,98 1,61 1,74 1,49 0,91 -7,40 Vg 7-Cl 1,54 10,58 9,27 12,90 5,08 -7,90 VIa H 1,39 >30 >30 >30 4,87 -6,70 VIb 5-F 1,59 >30 >30 >30 26,64 -7,00 VIc 5-Cl 2,03 9,16 4,69 4,51 2,65 -7,10 VId 5-Br 2,28 5,64 3,42 4,43 2,16 -7,00 VIe 5-CH3 1,94 >30 >30 >30 3,52 -7,40 VIf 5-OCH3 1,47 >30 >30 >30 4,15 -7,40 VIg 7-Cl 2,03 >30 >30 >30 4,77 -7,20 SAHA 1,44 3,20 3,70 3,75 1,06 -7,40 4.3.4. Bàn luận hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất VIIa-g và VIIIa-g Khả năng ức chế HDAC2 của đa số các chất dãy VIIa-g và VIIIa-g tƣơng đƣơng với SAHA. Dãy các chất VIIIa-g có tác dụng ức chế enzym mạnh hơn so với dãy các dẫn chất VIIa-g. Về khía cạnh độc tính tế bào, các chất mang cầu nối giữa acid hydroxamic và hợp phần 1-((1H-1,2,3-triazol- 4-yl)methyl)-3-hydroxyimino-2-oxoindolin có độ dài 6C (VIIIa-g) có độc tính tế bào cao hơn hẳn so với các chất có cầu nối 5C (VIIa-g). Khi so sánh tác dụng sinh học của hai dãy VIIa-g, VIIIa-g với ba dãy IVa-c, Va-g, VIa-g có thể thấy rõ sự cải thiện cả về khả năng ức chế HDAC2 cũng nhƣ độc tính tế bào. Tuy nhiên, so với kết quả tác dụng sinh học của những dãy 19 dẫn chất khác trong luận án, hai dãy dẫn chất này không phải là các chất có tiềm năng ức chế tế bào ung thƣ mạnh. Trong 14 chất của hai dãy VIIa-g và VIIIa-g, chỉ có 3 chất bao gồm VIIIc, VIIId và VIIIe thể hiện tác dụng độc tính trên các dòng tế bào thử nghiệm ở mức dƣới micro mol, nhƣng các giá trị này cũng chỉ tƣơng đƣơng với chất đối chứng dƣơng tính là SAHA. Bảng 4.4: Kết quả thử tác dụng ức chế enzym HDAC2 và độc tính tế bào của các dãy dẫn chất VIIa-g, VIIIa-g Ký hiệu chất R LogP Độc tính trên tế bào ung thư IC50 (µM) Ức chế HDAC2 (IC50, M) Kết quả docking (kcal/mol) SW620 PC3 AsPC-1 NCI-H23 VIIa H 1,88 9,80 7,49 5,72 10,47 1,77 -7-7,100 VIIb 5-F 2,08 11,40 9,04 7,12 8,40 1,87 -7,20 VIIc 5-Cl 2,52 7,03 3,74 7,99 12,49 1,06 -7,30 VIId 5-Br 2,77 19,74 10,50 14,87 13,74 0,93 -7,30 VIIe 5-CH3 2,43 14,13 7,94 9,13 8,67 1,06 -7,60 VIIf 5-OCH3 2,77 13,87 8,47 6,01 13,69 1,96 -7,00 VIIg 7-Cl 2,52 43,31 15,68 16,59 32,20 6,15 -7,40 VIIIa H 2,37 9,19 6,23 5,43 11,07 0,93 -7,80 VIIIb 5-F 2,57 7,47 10,21 7,42 13,60 1,41 -7,10 VIIIc 5-Cl 3,02 3,64 4,15 3,25 5,06 1,09 -7,80 VIIId 5-Br 3,26 3,00 2,47 2,62 3,61 1,23 -7,20 VIIIe 5-CH3 2,92 2,52 1,95 3,15 2,10 0,75 -7,50 VIIIf 5-OCH3 2,45 7,71 4,54 3,67 5,67 1,42 -7,90 VIIIg 7-Cl 3,02 9,15 7,87 5,54 5,61 1,14 -7,30 SAHA 1,44 3,20 3,70 3,75 3,18 1,06 -7,40 4.3.5. Bàn luận hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất IXa-g và Xa-c So sánh với kết quả hoạt tính sinh học của hai dãy VIIa-g và VIIIa-g, hai dãy dẫn chất IXa-g, Xa-c có độc tính tế bào mạnh hơn trên cả 3 dòng tế bào ung thƣ SW620, PC-3 và AsPC-1. Trong hai dãy chất này, có 5 chất (IXc, g, Xa-c) thể hiện độc tính mạnh hơn SAHA, 2 chất (IXd, f) thể hiện độc tính tƣơng đƣơn