Tóm tắt Luận án Xác định và phân tích hoàn chỉnh trình tự hệ gen ty thể của 6 giống lợn bản địa tại một số tỉnh miền bắc Việt Nam

ựa trên mô hình để phân tích phát sinh chủng loại. MrBayes lượng giá một phân bố xác suất tiên nghiệm, là khả năng một cây tạo ra thỏa mãn dữ liệu quan sát. (5) Phân tích cây phát sinh 4 chủng loại: Tính chính xác của cây được đánh giá bằng phân tích bootstrap. Bootstrap mô tả độ mạnh về hình học tô-pô của cây. Việc xác định gốc của cây giúp đánh giá tổng thể chiều hướng biến đổi. Có thể xác định gốc của cây dựa vào trung điểm hoặc nhờ nhóm đối chứng. Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu Các cá thể lợn thuộc 6 giống lợn bản địa Việt Nam (Ỉ, Móng Cái, Mường Khương, Mường Lay, Hương và Hạ Lang) được lựa chọn ngẫu nhiên trong các đàn lợn tại một số địa phương: Điện Biên, Lào Cai, Cao Bằng, Hải Phòng và Thanh Hóa. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp điều tra dựa trên đặc điểm ngoại hình lợn Quan sát bên ngoài con vật bởi các nhóm chỉ tiêu màu sắc lông, da và nhóm chỉ tiêu đánh giá về hình dạng, đặc điểm của các bộ phận trên cơ thể lợn, đo đạc khối lượng, các chỉ số: dài thân, vòng ngực và cao vai. Tiêu chí đánh giá đối chiếu với Át lát Các giống vật nuôi ở Việt Nam và Chuyên khảo Bảo tồn và khai thác nguồn gen vật Nuôi Việt Nam. 2.3.2. Xác định trình tự hệ gen ty thể Tách chiết DNA, khuếch đại phân đoạn mtDNA bằng PCR, giải trình tự hệ gen ty thể bằng phương pháp phân đoạn (shotgun) theo nguyên lý của Sanger. 2.3.3. Nhóm phương pháp lắp ráp, dóng hàng trình tự, dự đoán và chú giải hệ gen 2.3.3.1. Lắp ráp hệ gen Dữ liệu trình tự được đánh giá và chỉnh sửa trên phần mềm BioEdit v7.2.5. Các đoạn contig thu được từ quá trình cắt gọt sẽ 5 được ghép nối lại dựa trên phần trình tự gối lên nhau ở hai đầu mỗi đoạn bằng phần mềm DNA Dragon v1.6.0 (SequentiX) và phần mềm EditSeq (DNASTAR). 2.3.3.2. Dóng hàng đa trình tự Các trình tự vùng D-loop và trình tự vùng mã hóa của hệ gen ty thể vừa lắp ráp sẽ được tách riêng. Các đoạn trình tự lặp ngắn trước sau 5' -CGTGCGTACA-3' được xác định số lượng đơn vị lặp và loại bỏ. Trình tự hệ gen ty thể của các giống lợn trên thế giới được dóng hàng đa trình tự, sử dụng thuật toán MUSCLE. Xác định mô hình tiến hóa thích hợp nhất bằng phần mềm MEGA7. 2.3.3.3.Phân tích, chú giải hệ gen Phân tích và chú giải hệ gen và các gen tRNA của các giống lợn bản địa Việt Nam bằng công cụ trực tuyến Dogma và Mitos Web Server. Tất cả các chú giải được kiểm tra bằng công cụ BLAST trên GenBank. 2.3.4. Phân tích trình tự và phương pháp xác định mức độ tương đồng trình tự Với trình tự thu được, chúng tôi tiến hành phân tích các chỉ số cơ bản về tỷ lệ bất đối xứng của các loại nucleotide như phần trăm của các loại nucleotide sử dụng phần mềm DAMBE v6.3.17 ( cùng với đó là hai chỉ số độ lệch: GC skew và AT skew được tính toán dựa theo công thức sau: 2.3.5. Phương pháp xây dựng cây và phân tích chủng loại phát sinh 2.3.5.1. Khoảng cách tiến hóa Khoảng cách p (p-distance) giữa các cặp trình tự được tính toán sử dụng thuật toán hai thông số của Kimura trong phần mềm MEGA. 6 2.3.5.2. Phân tích phát sinh chủng loại Trình tự của vùng Dloop và toàn bộ vùng mã hóa của hệ gen ty thể được sử dụng riêng biệt làm dữ liệu đầu vào để dựng các cây phát sinh chủng loại tương ứng. Phương pháp Bayes được sử dụng trong phần mềm BEAST v1.8.3, thiết lập Yule process và MCMC 10000000 để tính toán xác suất hậu nghiệm. Cây tối thích được tìm ra bằng phần mềm Tree Annotater v.1.8.4. Gốc của cây được xác định bằng phương pháp sử dụng nhóm đối chứng (out - group. Kiểm tra thứ tự phân nhánh và tính chính xác bằng phân tích bootstrap sau 1000 lần lặp lại. Cuối cùng, phần mềm Figure Tree v1.4.2 được sử dụng để đọc tệp tin kết xuất ra và xây dựng cây phát sinh chủng loại. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Chọn lựa, thu thập mẫu Tính đến nay tại Việt Nam, để nhận diện các giống lợn bản địa các nhà chọn giống chưa có cơ sở dữ liệu phân tử nào mà chủ yếu căn cứ và bộ chỉ tiêu các đặc điểm hình thái đã được công bố và phê chuẩn. Để đảm bảo độ tin cậy trong việc thu mẫu phục vụ nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành khảo sát các đặc điểm ngoại hình dựa trên 3 nhóm chỉ tiêu là: (1) Đặc điểm lông, da; (2) tầm vóc, khối lượng và (3) hình dáng cơ thể, số lượng núm vú. a. Nhóm chỉ tiêu đặc điểm lông da Ở giống Mường Lay, qua quan sát thấy sự phân bố màu sắc lông da thường kèm theo với một số chỉ tiêu ngoại hình để tạo thành phân nhóm nhỏ hơn (gọi tên: nhóm A+). Số lượng các cá thể lợn được quan sát màu sắc lông da được phân vào các nhóm A+, A và B theo thứ tự giảm dần các chỉ tiêu đặc trưng của giống. Chỉ những cá thể nào có đầy đủ chỉ tiêu của giống (nhóm A hoặc A+) mới được chọn lựa để sàng lọc ở các nhóm chỉ tiêu tiếp theo. 7 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát đặc điểm lông, da của 6 giống lợn bản địa Đặc điểm về màu sắc lông da Tổng số N Nhóm % Lợn Ỉ Lông thưa, thô. Lông, da đen nhưng không bóng 9 9 A 100 Lợn Móng Cái - Thân lang đen trắng, đầu đen, tiếp giáp giữa lông đen và trắng có khoảng mờ 100 82 B 82,0 - Thân lang đen trắng, đầu đen giữa trán có đốm trắng, tiếp giáp giữa lông đen và trắng có khoảng mờ 18 A 18,0 Lợn Mường Khương - Màu sắc lông da đen tuyền. Lông thưa và mềm. 100 77 B 77,0 - Màu sắc lông da đen tuyền hoặc đen có đốm trắng ở đầu đuôi và chân, lông thưa mềm. 23 A 23,0 Lợn Hương - Thân và 4 chân trắng, có mảng lông da màu đen ở mông và da đầu. Phần tiếp giáp giữa đen và trắng rộng khoảng 2-3 cm, trên đó da đen, lông trắng 38 22 B 57,8 - Có thêm đặc điểm: giữa trán có một điểm trắng, bốn chân có mầu trắng. 16 A 42,1 Lợn Hạ Lang - Bụng trắng và có dải trắng vắt vai có dải đen gần giống yên ngựa. 41 13 B 31,7 - Có thêm đặc điểm: Giữa trán có điểm trắng gần giống hình nêm 28 A 68,3 Lợn Mường Lay - Đen tuyền, lưng thẳng, đầu núm vú cách mặt đất 10-15cm 70 35 B 50,0 - Có thêm đốm trắng ở chân, trán, đuôi, lưng thẳng, đầu núm vú cách mặt 10-15 cm 8 A 11,4 2 - Có thêm lưng hơi võng, bụng hơi sệ, đầu núm vú đều không sa sệ. 27 A+ 38,5 (N: Số cá thể được lựa chọn có đặc điểm màu sắc lông da phù hợp với Át lát; %: phần trăm cá thể có đặc điểm phù hợp trên tổng số cá thể quan sát) 8 Chỉ những cá thể ở nhóm A và A+ sẽ được chọn lựa để tiến hành khảo sát ở nhóm tiêu chí về tầm vóc, khối lượng. b. Đặc điểm về kích thước các chiều đo và khối lượng Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khối lượng và kích thước của 6 giống lợn bản địa Giống lợn Khối lượng Dài thân Vòng ngực Cao vai ± SD ± SD ± SD ± SD Ỉ 40,34 ± 0,92 85,76 ± 1,32 83,93 ± 1,44 39,58 ± 0,91 Móng Cái 51,47 ± 0,32 92,41 ± 1,35 90,77 ± 1,46 45,25 ± 0,93 Hương 40,55 ± 0,22 86,73 ± 1,33 81,31 ± 1,42 42,56 ±0,36 Hạ Lang 42,68 ± 042 87,12 ± 1,33 84,34 ± 1,43 43,68 ±0,98 Mường Khương 52,64 ± 0,92 93,94 ± 1,32 90,52 ± 1,46 46,14 ±0,96 Mường Lay 40,43 ± 0,95 85,71 ± 1,38 83,97 ± 1,46 43,25±0,94 (ĐVT: Khối lượng: Kg; kích thước: cm) : Trị số trung bình ± SD: độ lêch chuẩn Kết quả cho thấy 100% các cá thể được khảo sát về nhóm chỉ tiêu tầm vóc và kích thước cơ thể đều mang những đặc điểm đặc trưng của từng giống. c. Khảo sát trên nhóm chỉ tiêu hình dáng cơ thể Bảng 3.3. Khảo sát đặc điểm hình dáng cơ thể của 6 giống lợn bản địa Đặc điểm hình dáng cơ thể (số lượng núm vú) Tổng số N % Lợn Ỉ - Đầu to vừa phải, trán gần phẳng, mặt nhăn, nọng cổ và má chảy sệ khi béo, mõm ngắn, - Bụng ít sệ, thân, chân dài và cao hơn so với lợn Ỉ Mỡ 9 9 100 Lợn Móng Cái - Đầu to, mõm nhỏ và dài, tai nhỏ và nhọn, có nếp nhăn to và ngắn ở miệng. 18 15 83,3 9 Đặc điểm hình dáng cơ thể (số lượng núm vú) Tổng số N % - Cổ to ngắn, ngực nở và sâu, lưng dài, hơi võng, bụng hơi sệ, mông rộng và xuôi. Lợn Mường Khương - Mõm dài thẳng hoặc hơi cong. Trán nhẵn, tai tô cúp rủ về phía trước. - Bốn chân to cao, vũng chắc. Lưng hơi cong, bụng to nhưng không sệ tới sát đất, mông hơi dốc. 23 20 86,9 Lợn Hương - Đầu đen và thô, giữa trán có một điểm trắng. - Chân to, bụng to vừa phải và không chạm đất, lưng võng nhưng không gãy, bốn chân có mầu trắng, mông dốc, vai nở, ngực sâu. 16 10 62,5 Lợn Hạ Lang - Mõm ngắn, mặt nhăn to. - Chân to ngắn. Lưng võng, bụng không chạm đất 28 25 89,2 Lợn Mường Lay - Mõm thẳng, dài vừa phải, trán có nếp nhăn, tai to và dày cụp. - Mình thuôn dài, lưng hơi võng, chân to và cao vừa phải, đi bằng bàn. - Núm vú đều, khi mang thai và nuôi con, núm vú không sa sệ, không chạm đất. 27 13 48,1 (N: Số cá thể được lựa chọn có đặc điểm hình dáng cơ thể phù hợp với Át lát; %: phần trăm cá thể có đặc điểm phù hợp trên tổng số cá thể quan sát) Số cá thể thuộc 6 giống lợn sau khi được chọn lựa qua 3 nhóm chỉ tiêu về ngoại hình đã đạt đầy đủ các tiêu chí đặc trưng của từng giống. Mẫu máu của những cá thể này được lựa chọn ngẫu nhiên mỗi 10 giống 6 mẫu đem tách chiết DNA tổng số phục vụ nghiên cứu. 3.2. Trình tự hệ gen ty thể của 6 giống lợn bản địa Trình tự hoàn chỉnh hệ gen ty thể của 6 giống lợn bản địa gồm Ỉ, Móng Cái, Mường Khương, Mường Lay, Hương và Hạ Lang đã được xác định và đăng ký trên GenBank với các mã số truy cập KX094894, KU556691, KY432578, KX147101, KY964306 và KY800118. Công trình của nhóm tác giả Tran Thi Thuy Nhien và cộng sự (2016) tiến hành nghiên cứu độc lập cũng công bố trình tự hoàn chỉnh hệ gen ty thể của giống lợn Móng Cái (mã số truy cập GenBank: KU556691). Kích thước hệ gen của lợn Móng Cái do nhóm tác giả này công bố là 16.632 bp, ngắn hơn so với trình tự trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi là 79 bp, sự khác biệt chủ yếu chỉ nằm trong vùng D-loop, trong đó có sự khác biệt số lượng motif lặp ‘CGTGCGTACA'. 3.3. Phân tích hệ gen ty thể 3.3.1. Phân tích thành phần hệ gen ty thể Tỷ lệ thành phần các loại nucleotide được liệt kê tại bảng 3.5. Bảng 3.5. Tỷ lệ thành phần base ở hệ gen ty thể của 6 giống lợn bản địa Việt Nam. Giống lợn A(%) C(%) G(%) T(%) G+C(%) Ỉ 34,64 26,24 13,33 25,75 39,57 Móng Cái 34,70 26,20 13,30 25,79 39,50 Mường Khương 34,68 26,19 13,31 25,81 39,50 Hạ Lang 34,67 26,20 13,32 25,78 39,55 Hương 34,65 26,22 13,35 25,78 39,57 Mường Lay 34,70 26,19 13,32 25,79 39,51 Kết quả cho thấy, độ lệch thành phần các nucleotide hệ gen ty thể của các giống lợn nghiên cứu theo hướng giàu A+T (60,43 - 60,50). Một số chỉ số đặc trưng cho trình tự hệ gen ty thể như tỷ lệ phần trăm base loại G và loại C (% GC), độ lệch GC và AT (GC skew và AT skew) được liệt kê nhằm phân tích và so sánh giữa 11 các giống lợn bản địa Việt Nam với các giống lợn khác trên thế giới tại bảng 3.6. Bảng 3.6. Thành phần trình tự của các nhóm lợn trên thế giới Khu vực Giống lợn Trình tự hoàn chỉnh Trình tự D-loop %GC GC skew AT skew %GC GC skew AT skew Lợn bản địa Việt Nam Ỉ 39,35 -0,33 0,15 39,91 -0,32 0,16 Móng Cái 39,23 -0,33 0,15 38,77 -0,33 0,16 Hạ Lang 39,24 -0,33 0,15 38,47 -0,34 0,16 Hương 39,25 -0,33 0,15 39,25 -0,30 0,14 Mường Khương 39,25 -0,33 0,15 38,79 -0,33 0,16 Mường Lay 39,29 -0,33 0,15 39,59 -0,31 0,16 Đông Bắc Á Jeju - - - 38,55 -0,35 0,17 Korean native pig - - - 38,76 -0,35 0,15 WB-China northeast 39,25 -0,33 0,15 38,2 -0,34 0,15 WB-Japan - - - 39,09 -0,33 0,16 WB-Korea 39,19 -0,33 0,15 38,59 -0,33 0,16 Sông Hoàng Hà Bamei 39,21 -0,33 0,15 38,69 -0,34 0,16 Huzu 39,2 -0,33 0,15 38,69 -0,34 0,16 Khu vực các nước Châu Âu Berkshire 39,28 -0,33 0,15 38,47 -0,34 0,16 Duroc 39,32 -0,33 0,15 38,66 -0,35 0,16 Hampshire 39,33 -0,33 0,15 38,27 -0,36 0,16 Iberian 39,29 -0,34 0,15 38,37 -0,35 0,16 Landrace 39,28 -0,33 0,15 38,47 -0,35 0,15 Large White 39,27 -0,33 0,15 38,47 -0,35 0,16 Pietrain 39,28 -0,34 0,15 38,52 -0,35 0,16 WB-European 39,28 -0,34 0,15 38,56 -0,35 0,17 Lưu vực sông Mê Kông Banna mini 39,28 -0,33 0,15 39,16 -0,34 0,16 Dahe 39,24 -0,33 0,15 38,92 -0,33 0,16 Thailand indigenous pig - - - 38,7 -0,33 0,16 WB-Malaysia 39,18 -0,33 0,15 38,59 -0,38 0,19 WB-Vietnam 39,26 -0,33 0,15 38,69 -0,34 0,16 WB-Yunnan 39,28 -0,33 0,15 39,27 -0,31 0,15 Khu vực Nam Trung Quốc Lantang 39,22 -0,33 0,15 38,57 -0,34 0,16 Lanyu 39,25 -0,30 0,12 38,55 -0,34 0,16 WB-Fujian 39,19 -0,33 0,15 38,71 -0,33 0,16 WB-Hainan 39,19 -0,33 0,15 38,68 -0,33 0,15 Lưu vực sông Aba 39,21 -0,33 0,15 38,69 -0,34 0,16 Bihu 39,81 -0,31 0,14 38,69 -0,34 0,16 Jinhua 39,22 -0,33 0,15 38,46 -0,34 0,16 12 Khu vực Giống lợn Trình tự hoàn chỉnh Trình tự D-loop %GC GC skew AT skew %GC GC skew AT skew Trường Giang Kele - - - 38,68 -0,34 0,16 Taoyuan - - - 38,66 -0,34 0,16 WB-Jiangxi 39,22 -0,33 0,15 38,59 -0,34 0,16 Wei 39,2 -0,33 0,15 38,69 -0,34 0,16 Xiang pig 39,18 -0,33 0,15 38,59 -0,33 0,16 "-" : Trình tự hoàn chỉnh chưa được công bố. Các chỉ số GC skew ở các giống lợn đều mang giá trị âm, AT skew đều mang giá trị dương. Như vậy, xét về tiến hóa, xu hướng thay đổi thành phần nucleotide giữa các giống lợn là không có khác biệt lớn. Đối với trình tự hoàn chỉnh, toàn bộ sáu giống lợn nghiên cứu đều giống nhau về trị số GC skew và AT skew với giá trị tương ứng là -0,33 và 0,15. Ở hai giống Hương và Mường Lay cùng với giống WB-Yunnan của Trung Quốc trình tự hoàn chỉnh ít có sự chênh lệch nhất giữa C và G tương ứng là 0,30 và 0,31. Giống lợn Hương là giống có độ lệch giữa hai loại nucleotide A và T thấp nhất (0,14). So sánh giữa vùng trình tự D-loop và trình tự hoàn chỉnh, có thể thấy vùng D-loop ở đa phần các giống lợn đều có chỉ số AT skew cao hơn, tức là có mức độ biến đổi thành phần nucleotide loại A và T cao hơn. Giá trị trung bình cộng của trị số GC skew đối với các giống lợn bản địa Việt Nam (-0,32) cao hơn so với giá trị trung bình cộng của các giống lợn khác trên thế giới (-0,34). Về lý thuyết, các chỉ số độ lệch này cũng cho phép đánh giá một phần độ đa dạng di truyền và gián tiếp xác định các mối quan hệ về phát sinh chủng loại. Tuy nhiên sự khác biệt là chưa đủ lớn giữa các đối tượng nghiên cứu, nên chưa thể đưa ra suy luận khoa học cụ thể nào theo hai hướng trên từ các chỉ số GC skew và AT skew. 3.3.2. Chú giải cấu trúc hệ gen ty thể Kết quả chú giải cấu trúc hệ gen ty thể của các giống lợn 13 nghiên cứu đều bao gồm 37 gen trong đó có 2 gen mã hóa RNA ribosome, 13 gen mã hóa protein, 22 gen mã hóa RNA vận chuyển và một vùng kiểm soát D-loop. Ngoài ra còn có mười hai vùng không mã hóa nhỏ nằm rải rác trên khắp hệ gen ty thể. Kết quả chú giải hệ gen sử dụng công cụ trực tuyến GenomeVx cho thấy các giống lợn bản địa Việt Nam có hệ gen ty thể mạch kép, khép vòng, với kích thước lần lượt là: lợn Móng Cái: 16.711 base pairs (bp), lợn Mường Lay: 16.740 bp, lợn Mường Khương: 16.679 bp, lợn Hạ Lang: 16.722 bp, lợn Hương:16.753 bp và lợn Ỉ: 16.731 bp. So sánh các trình tự lặp trước sau theo motif 5'-tacacgtgcg-3' ở vùng D-loop cho thấy có những khác biệt lớn giữa nhóm lợn Việt Nam so với các giống lợn nhóm Châu Âu, Châu Á. Kết quả phân tích cấu trúc, tổ chức hệ gen ty thể của 6 giống lợn bản địa Việt Nam ở trên cho thấy có sự tương đồng với cấu trúc hệ gen ty thể của các loài động vật có vú khác. Thành phần các loại base có trong hệ gen ty thể của cả 6 giống lợn đều theo hướng giàu A+T (trên 60%), tương tự với các nhóm lợn Châu Á khác. 3.3.3. Cấu trúc thành phần của các gen RNA vận chuyển Thông tin về cấu trúc thành phần của các gen tRNA được liệt kê ở bảng 3.13. Bảng 3.13. Thành phần nucleotide của 22 gen tRNA STT Tên gen Sợi (+/-) Chiều dài (bp) Thành phần Nucleotide GC skew AT skew A G C T 1. tRNA Phe + 70 26 13 16 15 -0,10 0,27 2. tRNA Val + 68 26 10 14 18 -0,17 0,18 3. tRNA Leu2 + 75 23 14 17 21 -0,10 0,05 4. tRNA Ile + 69 28 11 8 22 0,16 0,12 5. tRNA Gln - 73 16 20 8 29 0,43 -0,29 6. tRNA Met + 70 20 13 20 17 -0,21 0,08 7. tRNA Trp + 68 26 12 14 16 -0,08 0,24 14 STT Tên gen Sợi (+/-) Chiều dài (bp) Thành phần Nucleotide GC skew AT skew A G C T 8. tRNA Ala - 68 19 15 8 26 0,30 -0,16 9. tRNA Asn - 75 21 18 11 25 0,24 -0,09 10. tRNA Cys - 66 18 16 12 20 0,14 -0,05 11. tRNA Tyr - 65 21 15 11 18 0,15 0,08 12. tRNA Ser2 - 69 17 20 11 21 0,29 -0,11 13. tRNA Asp + 68 23 12 9 24 0,14 -0,02 14. tRNA Lys + 67 20 14 16 17 -0,07 0,08 15. tRNA Gly + 69 25 10 13 21 -0,13 0,09 16. tRNA Arg + 69 29 6 9 25 -0,20 0,07 17. tRNA His + 69 29 8 8 24 0,00 0,09 18. tRNA Ser1 + 59 20 9 12 18 -0,14 0,05 19. tRNA Leu1 + 70 27 13 11 19 0,08 0,17 20. tRNA Glu - 69 17 17 8 27 0,36 -0,23 21. tRNA Thr + 68 22 12 18 16 -0,20 0,16 22. tRNA Pro - 65 13 19 10 23 0,31 -0,28 Tổng chiều dài 1509 486 297 264 462 Giá trị trung bình 68,59 22,09 13,50 12,00 21,00 0,06 0,02 22 gen tRNA có kích thước tổng thể là 1509 bp và chiều dài trung bình là 68,6 bp, nằm trong khoảng từ 59 bp (tRNAPro) đến 75 bp tRNALeu(CTA). Thành phần nucleotide của toàn bộ 22 gen tRNA đều theo hướng độ lệch thiên về hàm lượng AT với tỉ lệ các loại nucleotide là: 32,2% A, 30,6% T, 19,6% G và 17,5% C, theo thứ tự A > T > G >C . Giá trị chỉ số GC skew trong 22 gen tRNA có 10 gen mang giá trị âm (chiếm 0,45%), 8 gen tRNA có chỉ số AT skew âm (chiếm 36%) và giá trị trung bình chỉ số AT skew, GC skew đều mang giá trị dương (0,06 và 0,02 %). Điều này chứng tỏ rằng sự hiện diện của nucleotide loại A trên các sợi DNA nhiều hơn T ở đa số các gen tRNA và tỉ lệ chênh lệch G, C gần như tương đương nhau trong số 22 gen tRNA của hệ gen ty thể các giống lợn bản địa Việt Nam. Duy nhất chỉ có gen tRNA His có tần số G bằng C với chỉ số GS skew bằng 0. 3.3.4. Phân tích cấu trúc bậc hai của các tRNA 15 Kết quả dự đoán cấu trúc bậc hai của 22 tRNA cho thấy, cấu trúc của 21 tRNA ngoại trừ tRNASer-1 đều có dạng cỏ ba lá điển hình được tạo thành từ ba thùy dihydrouridine DHU, pseudouridin (TψC ) và anti-codon. 21 tRNA đều có các gốc nhánh gắn amino acid (amino acid acceptor) và gốc nhánh bộ ba đối mã (aniticodon) tương ứng đều là 7 bp và 5 bp, ngoại trừ tRNA Ser-1 có chiều dài gốc nhánh bộ ba đối mã là 6 bp. Riêng tRNA Ser-1 do có kích thước gen ngắn, do đó có phần thùy dihydrouridine (DHU) không hình thành được cấu trúc bền vững. 3.4. So sánh đa hình trình tự Do có sự khác biệt về đặc điểm cấu trúc và vai trò trong tiến hóa giữa hai vùng trình tự, nên kết quả phân tích đa hình trình tự được thể hiện ở hai nhóm kết quả: đa hình vùng D-loop và đa hình vùng mã hóa. 3.4.1. Trình tự vùng D-loop 3.4.1.1. Mức độ tương đồng Kết quả so sánh hệ số tương đồng trình tự ở vùng D-loop đạt mức thấp nhất ở giống lợn Ỉ (< 0,951), tiếp đến là giống lợn Mường Lay (<0,971), qua đó phản ánh nét đặc trưng về mặt di truyền của hai giống lợn bản địa này. Bên cạnh đó, có thể thấy mức độ tương đồng cao về trình tự giữa hai giống lợn Hương và Hạ Lang (chỉ số tương đồng cao nhất đạt: 0,999). So sánh độ tương đồng ở nhóm lợn lang của Việt Nam (Hương, Hạ Lang và Móng Cái) cho thấy có mức độ tương đồng cao hơn trong nội bộ nhóm so với các giống lợn bản địa Việt Nam khác và các giống lợn trên thế giới. 3.4.1.2. Mức độ khác biệt Có 25 vị trí đa hình trên tổng số 1184 vị trí (chiều dài contig), trong đó có 5 vị trí có mặt ít nhất 2 biến thể. Kết quả so sánh khác 16 biệt vùng D-loop được trình bày ở bảng 3.15. Bảng 3.15. Các vị trí SNP ở vùng D-loop của 6 giống lợn nghiên cứu STT Giống Vị trí Ỉ Mường Khương Mường Lay Móng Cái Hạ Lang Hương 1 24 G/A - - - - - 2 183 T/C - - - - - 3 215 T/C - - - - - 4 242 T/C T/C T/C T/C - - 5 280 - C/T C/T - - - 6 407 - - - T/C T/C T/C 7 454 - C/T C/T C/T C/T C/T 8 503 A/G - - - - - 9 562 T/C - - - - - 10 706 G G - G - - 11 714 A - A - - - 12 736 - - A - - - 13 734 G/G/A - - - - - 14 744 A - - - - - 15 746 - - A - - - 16 754 G/G/A - - - - - 17 756 - - A - - - 18 764 G/G/A - - - - - 19 766 - - A - - - 20 774 A - - - - - 21 776 - - A - - - 22 791 C - - - - - 23 813 - T/T/C - - - - 24 1032 A/G - - - - - 25 1165 - - - - A/C/A A/C/A Khi so sánh khác biệt trình tự vùng D-loop có thể thấy một số vị trí, chẳng hạn tại vị trí nucleotide thứ 454 (hình 3.6.) tất cả các nhóm lợn Việt Nam trừ lợn Ỉ khác biệt với hầu hết các giống lợn còn lại ở biến thể này (C/T). Vùng trình tự này của giống lợn Ỉ mang khá nhiều các điểm khác biệt với 5 giống lợn bản địa Việt Nam còn lại và với các giống lợn khác trên thế giới. 17 Hình 3.6. Vị trí khác biệt trên trình tự vùng D-loop của các giống lợn bản địa Việt Nam và các giống lợn trên thế giới 3.4.2. Trình tự vùng mã hóa hệ gen ty thể 3.4.2.1. Mức độ tương đồng Các giống lợn trong nhóm lợn lang của Việt Nam (Hạ Lang, Hương và Móng Cái) có mức độ tương đồng với nhau khá cao. Hai giống bản địa tại tỉnh Cao Bằng (Hương và Hạ Lang) thể hiện mức độ gần gũi về di truyền với chỉ số tương đồng cao (0,999). So với vùng D-loop, trình tự vùng mã hóa của giống Ỉ không thể hiện mức độ đặc trưng cao. 3.4.2.2. Mức độ khác biệt Khác biệt thường rơi vào các vùng gen mã hóa cho protein và tRNA, trong khi các vùng còn lại khá bảo thủ. Bên cạnh đó, trong số các biến thể SNP đáng chú ý có biến thể tại vị trí 2250 nằm trên gen mã hóa 12S rRNA. Tất cả các giống bản địa Việt Nam ngoại trừ giống Ỉ không có biến thể (C/T) nằm ở vùng này, trong khi hầu hết 18 các giống lợn khác đều có, kết quả này được minh chứng ở hình 3.8. Hình 3.8. Biến thể trình tự tại vị trí nucleotide 2250 vùng mã hóa hệ gen ty thể các giống lợn Kết quả so sánh biến thể trình tự này thể hiện có sự tương đồng giữa giống lợn Ỉ với giống Banamini (ở lưu vực sông Mekong) và giữa nhóm 5 giống lợn Việt Nam (Hương, Móng Cái, Mường Lay, Mường Khương và Hạ Lang) với giống lợn Lantang (ở khu vực miền nam Trung Quốc) cho phép đưa ra những dự đoán về những mối liên hệ gần gũi về mặt di truyền giữa các giống lợn này. 3.5. Phân tích về quan hệ phát sinh chủng loại Để tăng cường độ tin cậy về nguồn gốc và quan hệ phát sinh chủng loại, dữ liệu vùng D-loop và dữ liệu trình tự hoàn chỉnh được phân tích một cách độc lập để xây dựng các cây phát sinh chủng loại khác nhau. Đối với giống lợn Móng Cái ngoài kết quả trình tự của luận án, chúng tôi còn sử dụng trình tự của nhóm tác giả Tran Thi Thuy Nhien (2016) (kí hiệu trên cây phát sinh 19 chủng loại là MongCai_TN) để xây dựng cây phát sinh chủng loại, cũng như phân tích về quan hệ tiến hóa. 3.5.1. Cây phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu trình tự D-loop Ba giống lợn vùng Đông Bắc Bộ (lợn Móng Cái, Hạ Lang, và Hương) đều có cùng cặp taxon chị em với giống lợn Lantang (vùng Nam Trung Quốc, khoảng cách p từ 0,0006 - 0,0016. Hai giống lợn thuộc khu vực Tây Bắc Bộ (lợn Mường Khương và lợn Mường Lay) có quan hệ di truyền gần gũi với giống lợn Bamei (khu vực lưu vực sông Hoàng Hà với khoảng cách p là 0,0012). Kết quả về phát sinh chủng loại thể hiện trên cây phù hợp với dự đoán về sự gần gũi giữa hai giống Hương và Hạ Lang khi chúng có những sự tương đồng về hình thái và phân bố địa lý. Tồn tại khoảng cách p tương đối gần trong nhóm các con lợn Việt Nam là 0,0039±0,00112. Giống lợn Ỉ của Việt Nam ở cùng nhánh với giống lợn Banna Mini (thuộc vùng sông Mê Kông, với khoảng cách p là 0,0006, giá trị bootstrap đạt 99%). Khoảng cách tiến hóa của giống lợn Ỉ là xa nhất so với 5 giống lợn bản địa Việt Nam còn lại, cụ thể là giống lợn Ỉ có khoảng cách p với Hương và Hạ Lang là 0,0081; khoảng cách với 3 giống Móng Cái, Mường Khương và Mường Lay là 0,00782. Quan hệ giữa các giống lợn này được thể hiện rõ trên cây phát sinh chủng loại ở hình 3.11. Đối với giống lợn Móng Cái, taxon MongCai_TN có trình tự mtDNA được công bố bởi Tran Thi Thuy Nhien và cs khác biệt khá lớn về kích thước và đoạn lặp so với các giống lợn khác nên nắm ở nhánh tách biệt với hầu hét các giống lợn Châu Á khác và nằm rất xa với taxon từ kết quả nghiên cứu của chúng tôi. 3.5.2. Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự hoàn chỉnh 20 Quan hệ gần của nhóm lợn lang Việt Nam (Hương, Hạ Lang và Móng Cái) một lần nữa được khẳng định ở cây dựa trên trình tự hoàn chỉnh (hình 3.12). Cùng với những tương đồng về đặc điểm hình thái giữa giống lợn Hương và giống Lantang ở tỉnh Quảng Đông, miền nam Trung Quốc. Từ quan hệ phát sinh này có thể đưa ra giả thiết về nguồn gốc chung của nhóm lợn bản địa Việt Nam với lợn Lantang xuất phát từ hoạt động giao thương trong quá khứ giữa tỉnh Quảng Đông Trung Quốc với các tỉnh biên giới miền núi phía bắc Việt Nam. Khoảng cách p trung bình xác định được là tương đối gần trong nhóm các con lợn bản địa Việt Nam (0,00209), lớn hơn khi so sánh với nhóm lợn Châu Á (0,00694) và đặc biệt có khoảng cách rất xa với nhóm lợn Châu Âu (0,01734). Nhó