Tóm tắt Luận văn Xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid trong lá và nụ vối

ng định tính bằng phương pháp hóa học, định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và định lượng bằng phương pháp đo quang, HPLC. CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chiết xuất và phân lập một flavonoid chính từ nụ vối 3.1.1. Chiết xuất dƣợc liệu và phân đoạn Cân 8 kg dược liệu (nụ vối) làm khô, chiết bằng ethanol 96% bằng phương pháp ngâm lạnh, cho ethanol ngập hết dược liệu, thời gian ngâm là 1 tuần/lần rút dung dịch chiết, ngâm 3 lần (dịch đã nhạt màu). Dung dịch chiết thu được, đem cất thu hồi dung môi ethanol và cô cách thủy, thu được cao toàn phần (1192 g). Lấy 1000 g cao đem hòa tan một lượng vừa đủ 0,5 lít ethanol 96%, và tiếp tục bổ xung thêm 1,5 lít nước cất để hòa tan. Quy trình chiết được tóm tắt ở sơ đồ 3.1: 3.1.2 Phân lập flavonoid chính trong cao phân đoạn ethyl acetat Cân khoảng 300g cao phân đoạn EtOAc Tiến hành chạy cột với hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat với độ phân cực tăng dần (tỉ lệ dung môi từ 49:1 đến 1:1). Dùng bình nón có thể tích 250 ml để hứng dung dịch ra khỏi cột, thu được 32 bình (200 ml). Tất cả các bình hứng đều được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Bằng cách này, ta thấy từ bình 04 đến bình 09 cho sắc đồ giống nhau có 1 vết màu vàng (hình 3.1), gộp các bình này lại, cất thu hồi dung môi và cô cách thủy đến khô thu được chất rắn có màu da cam, gọi là chất rắn CO-1 (4,329 g). a) Hình ảnh SKLM b) Hình ảnh chất CO-1 Hình 3.1: Hình ảnh SKLM và chất CO-1 phân lập từ nụ vối 6 3.1.3. Xác định cấu trúc chất phân lập Chất rắn CO-1 là tinh thể có màu vàng da cam, có điểm nóng chảy 125-1270C. Kiểm tra độ tinh khiết bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho biết chất CO-1 phân lập được có độ tinh khiết 98,21% tính theo diện tích pic, sắc ký đồ thể hiện ở hình 3.2 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 m A U 0 100 200 3 4 0 1 6 1 4 5 7 5 2 4 2 1 1 9 9 1 8 7 5 6 9 1 2 4 7 6 6 6 6 4 1 2 2 0 3 6 1 0 0 9 2 3 5 1 1 2 0 1 1 5 9 4 9 4 2 5 0 6 8 7 5 0 6 1 1 6 1 6 0 1 0 2 1 4 2 3 0 0 1 9 7 3 5 8 3 1 4 1 4 6 1 1 3 2 5 9 5 4 5 2 5 8 1 6 5 1 7 9 2 5 2 8 3 2 5 1 2 0 6 9 6 6 5 8 1 3 8 1 1 4 4 9: 341 nm, 8 nm nuvoistd nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat Area Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC của chất CO-1 Kết hợp số liệu các phổ UV, IR, 1H-NMR và 13C-NMR cho thấy chất CO-1 là 2',4'- dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon, có CTPT là C18H18O4 và KLPT 298 amu. Phổ khối MS cho pic ion phân tử ở [M+H]+, có m/z = 299; ở [M-H]+ có m/z = 297, tương ứng với khối lượng phân tử của chất rắn CO-1 là M = 298 amu. Công thức cấu tạo của chất CO-1 được trình bày trong hình 3.3. Hình 3.3: Công thức cấu tạo chất CO-1 Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC, đo nhiệt độ nóng chảy của CO-1 nhiều lần đều cho kết quả ổn định ở 125-127oC. Như vậy, có thể sử dụng mẫu chất CO-1 phân lập được làm chất đối chiếu trong phép xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid và chất này trong các mẫu nụ và lá vối. 3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính flavonoid trong lá và nụ vối 3.2.1 Định tính bằng phản ứng hóa học Bảng 3.1: Kết quả định tính flavonoid trong nụ và lá vối 3.2.2 Định tính bằng TLC 3.2.2.1 Định tính flavonoid trong dược liệu nụ và lá vối a) Chuẩn bị mẫu chấm sắc ký Dung dịch thử: Lấy 1 gam bột dược liệu (nụ, lá vối) cho vào bình nón, thêm 50 ml methanol (MeOH) rồi đem siêu âm 30 phút, lọc qua giấy lọc, dịch lọc để làm các phép định tính. 7 Dung dịch đối chiếu: Dung dịch flavonoid chính (tách được ở nụ vối) trong MeOH (hàm lượng khoảng 1 mg/ml). b) Hệ dung môi sắc ký: Tiến hành khảo sát triển khai sắc ký cho các hệ dung môi sau: Hệ 1: Toluen:EtOAc:Aceton:Acid formic =5:2:2:1 (v:v:v ) Hệ 2: EtOAc:Acid acetic:Acid formic:Nước =10:1:1:2 (v:v:v:v ) Hệ 3: n-Hexan : EtOAc : Acid formic =6:3:0,1 (v:v:v ) Hệ 4: EtOAc : Toluen : Acid formic : Nước = 7:3:1,5:1 (v:v:v) Hình 3.4: Sắc ký đồ định tính flavonoid trong nụ và lá vối C: Chất chuẩn CO-1 N: Nụ vối L: Lá vối Các sắc ký đồ hình (A,B,C) cho thấy flavonoid trong nụ, lá vối cho các vết màu đen xám khi soi dưới UV-254 nm và UV-366 nm. Sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% /ethanol và sấy ở 1050C, ở miền ánh sáng trắng cho các vết có màu vàng (Rf =0,47) đặc trưng của flavonoid. Như vậy có thể sử dụng hệ 3 làm hệ dung môi cho việc triển khai sắc ký để định tính flavonoid trong việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu nụ, lá vối. 3.2.3 Định tính bằng HPLC * Chuẩn bị dung dịch lá vối: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu, thêm chính xác khoảng 25,00 ml methanol, đem siêu âm 30 phút, làm lặp 2 lần, để nguội, bổ sung lượng methanol đã mất cho đủ 50,00ml. Lọc, đem đi xác định hàm lượng. * Chuẩn bị dung dịch nụ vối: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu, thêm chính xác khoảng 25,00 ml methanol, đem siêu âm 30 phút, làm lặp 2 lần, để nguội, bổ sung lượng methanol đã mất cho đủ 50,00 ml. Lọc, hút ra chính xác 1ml đem hòa tan định mức thành 10,00ml bằng methanol, sau đó đem đi tiêm sắc ký. * Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn: Cân chính xác 1,10 mg chất CO-1, thêm chính xác 1,00 ml methanol, sau đó đem siêu âm trong 10 phút. Hút chính xác 0,50 ml đem pha loãng bằng methanol tới 5,00 ml để được nổng độ của CO-1 là 0,11 mg/ml, sau đó đem tiêm sắc ký. 8 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 m A U 0 100 200 3 4 0 1 6 1 4 5 7 5 2 4 2 1 1 9 9 1 8 7 5 6 9 1 2 4 7 6 6 6 6 4 1 2 2 0 3 6 1 0 0 9 2 3 5 1 1 2 0 1 1 5 9 4 9 4 2 5 0 6 8 7 5 0 6 1 1 6 1 6 0 1 0 2 1 4 2 3 0 0 1 9 7 3 5 8 3 1 4 1 4 6 1 1 3 2 5 9 5 4 5 2 5 8 1 6 5 1 7 9 2 5 2 8 3 2 5 1 2 0 6 9 6 6 5 8 1 3 8 1 1 4 4 9: 341 nm, 8 nm nuvoistd nu voi_stdCO55(0.11mg-ml)- 13042012 - 5uL -002.dat Area Sắc ký đồ chất đối chiếu (C) Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 m A U 0 20 40 60 80 1 8 8 5 5 9 7 6 2 0 4 0 7 6 8 3 1 0 3 4 1 4 5 2 9 2 3 7 4 6 7 1 0 7 2 8 9 6 8 8 4 0 6 3 0 8 8 5 2 7 7 7 3 5 3 0 4 1 6 5 2 9 1 0 5 2 1 5 4 8 2 9 5 5 3 7 3 5 2 9 7 7 7 8 8 5 4 3 5 8 3 2 5 2 2 9 8 8 5 4 7 1 1 6 7 2 1 1 7 8 1 3 0 7 4 2 5 2 2 7 6 1 1 6 9 4 2 9 4 5 2 2 5 4 9 3 1 4 0 1 7 1 1 5 5 9: 341 nm, 8 nm nuvoihungyen nuvoihungyenm2(4mg.ml)- 25042012 - 10uL -001.dat Area Sắc ký đồ của nụ vối (N) Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 m A U 0 100 200 300 400 9: 341 nm, 8 nm lavoi lavoibacgiang(20mg.ml)- 29052012 - 10uL -003.dat Area Sắc ký đồ của lá vối (L) Hình 3.5 : Sắc ký đồ của mẫu đối chiếu CO-1 và nụ, lá vối Qua tiến hành thí nghiệm tìm ra điều kiện định tính CO-1 trong nụ và lá vối bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thông qua thời gian lưu tR. 3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid trong lá và nụ vối 3.3.1 Xây dựng bằng phƣơng pháp trắc quang 3.3.1.2 Độ lặp lại của phƣơng pháp Để xác định độ lặp lại của phương pháp tiến hành với 6 thí nghiệm riêng biệt cho mẫu nụ vối Hưng yên. Bảng 3.2: Kết quả độ lặp lại của phương pháp trắc quang STT 1 2 3 4 5 6 mmẫu(g) 1,0041 1,0064 1,0110 1,0365 1,0189 1,0831 Abs 0,174 0,181 0,184 0,191 0,196 0,193 Số liệu thống kê SD = 0,83.10 -2 ; RSD = 4,45% Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy phương pháp có độ lặp lại có thể chấp nhận được thông qua RSD = 4,45% (< 5%). 3.3.1.3 Xây dựng đƣờng chuẩn Xây dựng đường chuẩn bằng chất đối chiếu CO-1: Tiến hành pha một dãy dung dịch đối chiếu CO-1 (chất tách được từ nụ vối) với nồng độ chính xác là 12, 24, 36, 48 , 72 và 100 mg/l. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn ở (hình 3.6). Bảng 3.3: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất đối chiếu CO-1 Nồng độ (mg/l) 12 24 36 48 72 100 A510 (Abs) 0,042 0,082 0,120 0,160 0,231 0,332 9 y = 0.0033x + 0.0026 R 2 = 0.999 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ CO-1 (mg/l) Đ ộ h ấ p t h ụ q u a n g Hình 3.6: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo CO-1 Từ kết quả ở bảng 3.5 và hình 3.7 kết quả khảo sát trên cho thấy với nồng độ của chất đối chiếu CO-1 từ 12-100 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. Ta được y = 0.0033x + 0.0026 với hệ số tương quan R2 = 0.9990. Dựa trên phần mềm Originpro 7.5 tính được độ lệch chuẩn của phương trình hồi quy là Sy= 0,00366 và SA= 5,04.10 -5 ; SB = 0,0028. Tra bảng ta t(0,95; 5) = 2,571 phƣơng trình hồi quy đầy đủ: y = (0,0033 ± 1,30.10-4)x + (0,0026± 0,0072) Xây dựng đường chuẩn bằng chất chuẩn catechin: Tiến hành pha một dãy dung dịch chuẩn catechin (Sigma) với các nồng độ chính xác là 45, 90, 180, 360 và 450 mg/l. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6. Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường chuẩn ở (hình 3.7). Bảng 3.4: Kết quả xây dựng đường chuẩn theo chất chuẩn catechin Nồng độ (mg/l) 45 90 180 360 450 Độ hấp thụ quang A510(Abs) 0,107 0,214 0,457 0,890 1,091 y = 0.0024x + 0.0022 R 2 = 0.9993 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 100 200 300 400 500 Nồng độ Catechin (mg/l) Đ ộ h ấ p t h ụ q u a n g Hình 3.7: Đường chuẩn xác định flavonoid toàn phần theo catechin Kết quả ở bảng 3.6 và hình 3.8 kết quả khảo sát trên đã chỉ ra rằng với nồng độ của chất chuẩn catechin từ 45-450 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. Ta được y = 0,0024x + 0,002 với hệ số tương quan R2 = 0.9993. Tra bảng được t(0,95; 4) = 2,776. Dựa trên phần mềm Originpro 7.5 ta tính được độ lệch chuẩn của phương trình hồi quy như sau: Sy = 0,01289 và Sa= 3,70.10 -5 ; Sb = 0,01013. Phƣơng trình hồi quy đầy đủ là: y = (0,0024 ± 1,07.10-4)x + (0,002 ± 0,0028) 3.3.1.4 Giới hạn phƣơng pháp. a) Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ: 10 Để tiến hành xác định LOD và LOQ tiến hành chuẩn bị các dung dịch mẫu trắng bằng cách lấy vào 10 bình định mức cỡ 10 ml: Cho vào bình có chứa sẵn khoảng 4 ml nước cất + 0,3 ml NaNO2 5% + 0,3 ml AlCl3 10% + 2 ml NaOH 1M sau đó định mức bằng nước cất hai lần, sau khoảng 10 phút thì đem đi đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch trên ở bước sóng 510 nm (với dung dịch so sánh là nước cất) ta thu được kết quả như trong bảng 3.7. Bảng 3.5: Kết quả xác định độ lệch chuẩn của mẫu trắng STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A510 0,002 0,002 0,003 0,002 0,004 0,002 0,003 0,002 0,002 0,004 Kết quả trên ta tính được giá trị trung bình: OA = 0,0026 Giá trị độ lệch chuẩn: SD = 0,843.10-3 Giới hạn phát hiện LOD và LOQ của phương pháp khi dùng chất CO-1 làm chất đối chiếu: LOD = 3. Y S b = 3. 30,843.10 0,0033  = 0,77 mg/l LOQ = 10. Y S b = 10. 30,843.10 0,0033  = 2,55 mg/l Giới hạn phát hiện LOD và LOQ của phương pháp khi dùng chất chuẩn catechin làm chuẩn: LOD = 3. Y S b = 3. 30,843.10 0,0024  = 1,05 mg/l LOQ = 10. Y S b = 10. 30,843.10 0,0024  = 3,51 mg/l b) Giới hạn LOL: Xác định bằng cách nới rộng nồng độ ở điểm trên của đường chuẩn cho đến khi tương quan giữa nồng độ và độ hấp thụ quang không còn tuyến tính nữa. Đối với chất đối chiếu CO-1: Bảng 3.6: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của chất đối chiếu CO-1 Nồng độ CO-1 (mg/l) 48 72 100 110 120 130 A510 0,160 0,231 0,332 0,351 0,376 0,381 11 Giới hạn LOL 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 50 100 150 Nồng độ CO-1 (mg/l) Đ ộ h ấ p t h ụ q u a n g Hình 3.8: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của CO-1 Kết quả bảng 3.6 và hình 3.8 cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 120 mg/l, tại nồng độ này trở đi thì đồ thị của độ hấp thụ quang theo nồng độ không còn tuyến tính. Như vậy khoảng tuyến tính của phương pháp xác định theo chất đối chiếu CO-1 là khoảng từ 2,55 – 120 mg/l. Đối với chất chuẩn catechin: Bảng 3.7: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL của catechin Nồng độ catechin (mg/l) 500 900 1000 1100 1200 1300 A510 1,217 2,246 2,534 2,712 2,798 2,834 Giới hạn LOL 0 1 2 3 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Nồng độ catechin (mg/l) Đ ộ h ấ p t h ụ q u a n g Hình 3.9: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL của catechin Kết quả ở bảng 3.7 và hình 3.9 cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 1000 mg/l, tại nồng độ này trở đi thì đồ thị của độ hấp thụ quang theo nồng độ không còn tuyến tính. Như vậy khoảng tuyến tính của phương pháp xác định theo chất chuẩn catechin là khoảng từ 3,51 – 1000 mg/l. 3.3.1.5 Độ đúng của phƣơng pháp Để xác định độ đúng thực hiện với một dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ chính xác 12 mg/l. Sau đó tiến hành phân tích mẫu chuẩn đó lặp lại 6 lần, kết quả được ghi ở bảng 3.7 Bảng 3.8: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp STT 1 2 3 4 5 6 12 A510 0,043 0,042 0,044 0,041 0,041 0,042 Hàm lƣợng 12,367 12,000 12,700 11,700 11,700 12,000 Số liệu thống kê m = 12,78; SD = 0,86 Ta có ttn = 2 12 12,78 0,86 6  = 2,22 Tra bảng t(0,95;5) = 2,57 > ttn = 2,22. Như vậy : tc > ttn : Không có sự khác nhau về kết quả của giá trị trung bình so với giá trị tham chiếu ở mức ý nghĩa α = 0,95, tức là phương pháp có độ đúng đạt yêu cầu → Phƣơng pháp không mắc sai số hệ thống. 3.3.1.6 Độ ổn định của phƣơng pháp Tiến hành đo độ hấp thụ quang của chất CO-1 có nồng độ 12 mg/l và của catechin có nồng độ 100 mg/l. Sau đó dùng hàm chuẩn studen (t) để đánh giá. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.9 Bảng 3.9 : Kết quả đánh giá độ ổn định của phương pháp theo cách 1 STT 1 2 3 4 5 6 A510 CO-1 0,043 0,042 0,044 0,041 0,041 0,042 Catechin 0,242 0,242 0,243 0,242 0,241 0,243 Ta có : Đối với chất CO-1: 510A 1 = 0,0422 ; S1 = 11,70.10 -4 Đối với chất catechin : 510A 2 = 0,2422 ; S2 = 7,54.10 -4 Ta có: Ftn = 2 1 2 2 S S = 4 2 4 2 (11,70.10 ) (7,54.10 )   = 1,55 > 1 . Ta So sánh Ftn với Fc(0,05 ;5 ;5). Tra bảng ta có Fc(0,05 ;5 ;5) = 5,0503 > Ftn = 1,55 : Như vậy hai phương sai không có sự khác nhau có ý nghĩa, hai phương pháp có độ lặp lại tương đồng. Kết quả định lƣợng flavonoid toàn phần trong nụ và lá vối Hàm lượng flavonoid toàn phần trong nụ và lá vối được tính theo khối lượng chất chuẩn catechin (g) và chất đối chiếu CO-1 (g). Được tính trong 1 g khối lượng mẫu dược liệu khô tuyệt đối. Giá trị kết quả của hàm lượng flavonoid toàn phần được làm lặp lại 3 lần và kết quả ở bảng 3.12 được biểu diễn : m ± SD Bảng 3.10 : Kết quả xác định flavonoid toàn phần STT Tên mẫu (nơi thu hái) mmẫu (g) Hàm lƣợng flavonoid toàn phần tính theo Catechin (mg/g) Hàm lƣợng flavonoid toàn phần tính theo CO-1 (mg/g) Các mẫu lá 13 1 Bắc Giang 1,0028 30,33 ± 1,060 22,42 ± 1,060 2 Bắc Ninh 1,0017 20,73 ± 1,040 15,44 ± 1,040 3 Hà Đông (HN) 1,0028 21,81 ± 1,230 16,23 ± 1,230 4 Hòa Bình 1,0180 29,70 ± 1,320 21,99 ± 1,320 5 Phú Thọ 1,0066 23,74 ± 1,160 17,62 ± 1,160 6 Quảng Ninh 1,0221 22,61 ± 0,840 16,81 ± 0,840 7 Thái Bình 1,0380 22,69 ± 0,840 16,87 ± 0,840 Các mẫu nụ 8 Chợ Đồng Xuân(HN) 1,0020 39,23 ± 1,630 28,91 ± 1,630 9 Hưng Yên 1,0014 42,11 ± 1,630 30,99 ± 1,630 10 Nam Định 1,0032 40,93 ± 2,230 30,13 ± 2,230 11 Hải Dương 1,0045 39,23 ± 2,200 28,88 ± 2,200 12 Hà Đông (HN) 1,0052 34,98 ± 1,620 25,79 ± 1,620 13 Hà Nam 1,0066 38,51 ± 1,160 28,36 ± 1,160 14 Thái Nguyên 1,0013 37,43 ± 1,620 27,57 ± 1,650 Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn CO-1: Trong các mẫu lá vối trong khoảng 15,443 – 22,418 mg/g. Trong nụ vối khoảng từ 25,791 – 30,995 mg/g. Hàm lượng flavonoid toàn phần xác định theo chất chuẩn catechin: Trong các mẫu lá vối trong khoảng 20,728 – 30,331 mg/g. Trong nụ vối khoảng từ 34,978 – 42,114 mg/g. Qua bảng 3.10 nhận thấy hàm lượng flavonoid toàn phần trong nụ vối cao hơn so với hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá vối. 3.3.2 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid chính bằng HPLC 3.3.2.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký, tiến hành pha một mẫu đối chiếu có nồng độ 0,053 mg/ml, tiến hành sắc ký 6 lần với điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống được ghi ở bảng 3.11. Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống Lần tiêm Thời gian lƣu Diện tích pic Các thông số thống kê 1 9,12766 2190950 14 2 9,07053 2186244 SD = 21052 RSD = 0,95 (%) 3 9,18479 2205546 4 9,47704 2245278 5 9,53417 2214240 6 9,41771 2213154 Kết quả trên cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC là phù hợp và đảm bảo sự ổn định của phép phân tích định lượng CO-1. 3.3.2.2 Khoảng tuyến tính của phƣơng pháp Chuẩn bị một dãy gồm 5 dung dịch mẫu đối chiếu CO-1 có nồng độ chính xác khoảng 0,0055 mg/ml đến 0,11 mg/ml rồi tiến hành chạy sắc ký như điều kiện đã mô tả. Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.15 và đường chuẩn lập được, được thể hiện ở hình 3.12. Bảng 3.12: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính Dung dịch Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic (AU.s) 1 0,11 4575033 2 0,055 2483455 3 0,0275 1138335 4 0,011 529218 5 0,0055 269653 6 0 27465 Sử dụng phần mềm origin 7.5 vẽ đường chuẩn và tính toán 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 Ph-¬ng tr×nh: Y = A + B * X Th«ng sè Gi¸ trÞ Sai sè ------------------------------------------------------------ A 54599.803 46041.88268 B 4.16056E7 890693.07305 ------------------------------------------------------------ R SD N P ------------------------------------------------------------ 0.99908 83327.81606 6 <0.0001 ------------------------------------------------------------ D iÖ n t Ýc h P Ýc Nång ®é (mg/ml) Hình 3.10: Đường chuẩn xác định hàm lượng CO-1 trong nụ và lá vối 15 Δa = t(0,95, 4).Sa = 2,131841*46041,883 = 98153,9739 Δb = t(0,95, 4).Sb = 2,131841*890693,073 = 1898815,935 Phương trình hồi quy đầy đủ của đường chuẩn có dạng y = a + b.x có dạng như sau : y = a + b.x = (a ± Δa) + (b ± Δb).x yi = (54599,803 ± 98153,9739) + (4,16056x10 7 ± 1898815,935). CC.01 (1) 3.3.2.3 Độ lặp lại của phương pháp Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng cách tiến hành 6 thí nghiệm riêng biệt cho mẫu chứa chất đối chiếu CO-1 có nồng độ 0,042 mg/ml (Bảng 3.13A) và mẫu thực nụ vối Hưng yên (Bảng 3.13B). Bảng 3.13A: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu CO-1 Lần tiêm 1 2 3 4 5 6 PICS (AU.s) 1663046 1712229 1725100 1730613 1666705 1727390 Các thông số thống kê SD = 31102; RSD = 1,82(%) Bảng3.13 B: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu thực Tên mẫu thử Số mẫu định lƣợng Hàm lƣợng tìm thấy % Các số liệu thống kê Nụ vối Hưng Yên 6 1,86 SD = 0,0346 ; RSD = 1,696% 3.3.2.4 Độ đúng của phƣơng pháp Thêm vào mẫu thử (nụ vối Hưng Yên) đã được xác định hàm lượng một lượng chính xác chất chuẩn sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức sau : H(%) = 100%.(Ccó thêm chuẩn - Cnền)/Cchuẩn được thêm vào Bảng 3.14: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp Tên mẫu thử Số lần định lƣợng Lƣợng thêm vào (mg) Lƣợng tìm lại đƣợc trung bình % tìm lại đƣơc trung bình Số liệu thống kê Mẫu nụ vối Hưng Yên 6 0,044 0,043 97,73 RSD = 2,16 % Qua bảng trên cho thấy, phương pháp phân tích định lượng HPLC có khả năng thu hồi lại cao hơn 90% có thể chấp nhận được. Như vậy phương pháp này có độ đúng cao. 3.3.2.5 Giới hạn của phƣơng pháp 16 Phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ 44 μg/ml, sau đó pha loãng dần đến khi dung dịch chuẩn không còn xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Tiến hành phân tích theo các điều kiện đã lựa chọn, ở nồn độ 0,031 μg/ml được coi là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp (Bảng 3.20) thể hiện qua việc tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N) đạt trong khoảng 2-3. Ta có S/N = 2H h = 2.0,6 0,4 =3 Hình 3.11: Chiều cao tín hiệu phát hiện LOD Qua bảng 3.20 và hình 3.12 xác định được giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp xác định CO-1 là 0,031 μg/ml. Như vậy suy ra giới hạn định lượng LOQ = 3,3 × LOD = 0,1023 μg/ml. Xác định giới hạn LOL: Xác định bằng cách nới rộng điểm trên của đường chuẩn cho đến khi tương quan giữa nồng độ và diện tích píc không còn tuyến tính nữa. Bảng 3.15: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOL Nồng Độ (mg/ml) 0,11 0,1375 0,22 0,275 0,367 0,55 Diện tích Píc 4575033 7119423 12105281 14809513 16490167 20791750 Giới hạn LOL 0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Nồng độ CO-1 (mg/ml) D iệ n t íc h P íc Hình 3.12: Đồ thị xác định nồng độ giới hạn LOL Từ kết quả (Bảng 3.15 và Hình 3.12) cho thấy nồng độ giới hạn LOL là 0,275 mg/ml, tại nồng độ này trở đi trên đồ thị cho thấy diện tích píc và nồng độ không còn tuyến tính. Như vậy, khoảng nồng độ tuyến tính CO-1 để định lượng cho kết quả tốt nhất được xác định nằm trong khoảng 0,1-275 μg/ml. Bảng 3. 16: Kết quả định lượng hoạt chất trong một số mẫu nụ và lá vối STT Tên mẫu Khối Độ PicS (A Hàm lƣợng chất CO-1 17 (nơi thu hái) lƣợng cân (g) ẩm (%) U.s) (mg/g) (% kl/kl) Các mẫu nụ vối 1 Chợ Đồng Xuân (HN) 1,0709 12,62 1324731 16,81 ± 0,058 1,68 2 Hưng Yên 1,0007 11,18 1377958 18,61 ± 0,184 1,86 3 Nam Định 1,0113 11,14 1022567 13,45 ± 0,160 1,35 4 Hải Dương 1,0032 7,65 1143549 14,69 ± 0,093 1,47 5 Hà Đông (HN) 1,0057 6,77 1048407 13,24 ± 0,030 1,32 6 Hà Nam 1,0266 8,00 1066353 13,36 ± 0,125 1,34 7 Thái Nguyên 1,0003 7,85 1067456 13,74 ± 0,173 1,37 Các mẫu lá vối 8 Bắc Giang 1,0020 9,30 3447931 4,661 ± 0,058 0,47 9 Bắc Ninh 1,0017 11,50 3158279 4,376 ± 0,053 0,44 10 Hà Đông (HN) 1,0028 11,10 3178280 4,377 ± 0,029 0,44 11 Hòa Bình 1,0180 15,10 3379762 4,792 ± 0,030 0,48 12 Phú Thọ 1,0066 8,70 3449983 4,625 ± 0,045 0,46 13 Quảng Ninh 1,0221 11,50 3312138 4,493 ± 0,023 0,49 14 Thái Bình 1,0380 10,90 3258986 4.327 ± 0,029 0,43 Kết quả định lượng các mẫu thu hái tại một số địa phương ở miền bắc Việt Nam cho biết hàm lượng CO-1 trong lá vối nằm trong khoảng 0,43 - 0,49%, thấp hơn nhiều so với hàm lượng trong nụ vối trong khoảng 1,32 – 1,86%. Kết quả nghiên cứu này gợi ý cho việc xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu nụ và lá vối để kiểm nghiệm chất lượng dược liệu vối sử dụng cho y học cổ truyền. 18 KẾT LUẬN 1. Đã phân lập được một flavonoid chính (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone) trong nụ vối làm chất đối chiếu trong xây dựng phương pháp định tính, định lượng flavonoid. Xác định được độ tinh khiết của flavonoid chính bằng HPLC (98,21%). 2. Đã xây dựng được phương pháp định tính flavonoid trong nụ và lá vối bằng các phản ứng hóa học, sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đã đưa ra các phản ứng định tính flavonoid trong nụ và lá vối gồm: phản ứng với các thuốc thử NH3, NaOH, (Mg + HCl), và FeCl3. Tìm ra được hệ dung môi định tính flavonoid trong sắc ký bản mỏng (TLC) gồm: Hệ 1: n-Hexan : EtOAc : Acid formic = 6:3:0,1 (v:v:v ) và hệ 2: Toluen : EtOAc : Acid formic = 6:4:1 (v:v:v). Định tính được flavonoid chính bằng HPLC thông qua thời gian lưu (tR = 9,3 phút) và so sánh với chất đối chiếu CO-1 được tách từ nụ vối. 3. Xây dựng được phương pháp định lượng flavonoid: a) Bằng phương pháp trắc quang Xây dựng được phương pháp định lượng flavonoid toàn phần theo chất đối chiếu CO- 1 (được tách từ nụ vối) và theo catechin. Xác định được khoảng tuyến tính và đường chuẩn xác định lượng flavonoid là ; Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phép đo nằm trong khoảng LOD = 0,77 mg/l, LOQ = 2,55 mg/l (theo chất đối chiếu CO-1) và LOD = 1,05 mg/l, LOQ = 3,51 mg/l (theo chất chuẩn catechin) ; Độ đúng, độ ổn định của phương pháp phù hợp. Đã xác định được hàm lượng flavonoid toàn phần trong 14 mẫu nụ và lá vối thu hái ở các tỉnh miền bắc Việt Nam. Kết quả cho biết hàm lượng trong các mẫu nụ là 25,791 – 30,995 mg/g, mẫu lá 15,443 – 22,418 mg/g (tính theo chất đối chiếu CO-1). Tính theo chất chuẩn catechin : mẫu nụ là 34,978 – 42,114 mg/g, mẫu lá 20,728 – 30,331 mg/g. Kết quả đã đánh giá được hàm lượng flavonoid trong nụ vối cao hơn trong lá vối có ý nghĩa thống kê. b) Bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Đưa ra được điều kiện, dung môi phù hợp chạy sắc ký trong việc định lượng flavonoid chính trong nụ và lá vối Xác định được khoảng tuyến tính (0,1 – 275 μg/ml) và lập đường chuẩn của flavonoid. Xác định được giới hạn phát hiện (LOD = 0,031 μg/ml) và giới hạn định lượng của phép đo (LOQ = 0,1023 μg/ml) . Đánh giá được sai số và độ lặp lại của phép đo. 19 Đã xác định được hàm lượng của 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone trong một số mẫu lá (4,3272 – 4,7924 mg/g) v