Tổng quan về Enzyme protease

hợp gene đã được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E.coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa. 3.1.1.4. Phương pháp tải nạp Vật liệu di truyền (AND) được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ vai trò trung gian của thực khuẩn thể (phage). Trong quá trình tải nạp, các đoạn AND được chuyển từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp với AND của tế bào nhận. Do đó làm biến đổi tính chất di truyền của tế bào nhận. 3.1.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật. Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng, đã được kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệt lưư ý đến điều kiện bảo quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyển và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu. • Phương pháp cấy chuyển. Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi trường thạch (thạch nghiêng, hộp petri,…) với thành phần môi trường nuôi cấy và Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 17 điều kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3-400C và sau mỗi tuần phải cấy chuyển lại. Khi cấy chuyển chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc mà không nên lấy cả môi trường dinh dưỡng để đảm bảo không chuyển các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được). Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên giữ trong đất để khử trùng. Để kéo dài thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến 1 năm, người ta phủ 1 lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó. Cần lưu ý chỉ phủ lớp dầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chin sinh lý. Phương pháp cấy chuyển rất có hiệu quả để bảo quản các giống nấm men, vi khuẩn và rất hữu hiệu, dễ dàng triển khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn đến hư hỏng giống gốc. 3.2. Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch • Phương pháp làm khô Bằng cách giữ giống trên cát, đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều được khử trùng cẩn thận). Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục của giống khi bảo quản. Phương pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ khuẩn, một vài loại nấm men, vi khẩn thời gian giữ giống có thể được một nă. Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản, không cần dụng cụ đắt tiền. Tuiy nhiên giống như phương pháp cấy chuyển thời gian bảo quản tương đối ngắn. • Phương pháp đông khô Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và đượclàm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 18 số virut. Tuy nhiên phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật. • Phương pháp bảo quản lạnh sâu Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196oC -> -80oC). Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt đọ khác nhau như -20oC, -30oC, -40oC,-70oC, -140oC và -196oC. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30oC cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut. Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và các dòng tế bào động vật. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro nhue cháy nổ… Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô. 3.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease. Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng cso ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. trong thành Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 19 phần môi trường phải có đủ các chất bảo quản được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho khồng bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác. 3.3.1. Nguồn cacbon. Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tuỳ thuộc vào đặc tính của enzyme và nòi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp. Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp đối với nấm mốc sinh ra enzyme protease có hoạt lực cao. Các nguồn cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp proteinase cảu nấm mốc có thể theo thứ tự: Đối với Asp.flavus 74: fructoza → glucoza → sacaroza → ramnoza → manoza → galactoza → arabinora → lactoza. Đối với Asp. Awamori 200: fructoza → manit → sacaroza → arabinora → manoza → galactoza → lactoza. Đối với Asp. Oryzae 79: fructoza → sacaroza → maltoza → glucoza → manit → arabinora → galactoza. Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme Protease. Ví dụ: VI khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở môi trường tinh bột >8%. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 20 Nhiều xạ khuẩn ưu nhiệt, trong đó Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và sinh tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng đọ tinh bột từ 0,25 – 1,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzyme. Nếu tăng nồng độ tinh bột hơn nữa sẽ không thu được kết quả dương tính. Tỷ số giữa cacbon và nitơ cần phải là 4:1. trên môi trường có maltoza (0,5 – 2%) vi sinh vật phát triển bình thường, nhưng tổng hợp protease ngoại bào bị ức chế. Xạ khuẩn không phát triển được ở trên môi trường có các nguồn cacbon duy nhất là sacaroza, lactoza hoặc arabinoza. Glucoza, manoza,fructoza, xyloza có trong môi trường (0,2 – 5%) làm ức chế sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp enzyme. Ngoài ra, một số loại hydrocacbon cũng có nguồn cacbon có 125 chủng vi sinh vật. Chẳng hạn chủng Ps. Seruginosa có thể đồng hoá hydrocacbon và có khả năng sinh tổng hợp protease có hoạt lực cao trên môi trường n-parafin với 12, 14 và 16 nguyên tử cacbon, dầu nặng hoặc propylenglycol. Chúng khôgn chỉ đồng hoá đươch cả hydrocacbon béo mà còn đồng hoá cả hydrocacbon thơm. 3.3.2. Nguồn nitơ. Nguồn nitơ sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ. Đối với một số laòi nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger, A. flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp protease axit cao. Tren môi trường kzapek NaNO3 đwocj thay bằng cả cazein và bổ sung pepton hoạt lực enzyme tăng 6lần. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ. Cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme protease tăng 22 – 74%. Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp protease nói chung. Trong quá trình nuôi cáy vi khuẩn, trong đó có B. subtilis và B. mesentericus, các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ được dùng phối hợp trong môi Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 21 trường sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sinh tổng hợp protease. Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt hơn cả. Những muối khác NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO3, KNO3. Ca(NO3)2 làm giảm hoạt lực protease tới 30-50%, còn amylaza giảm 7-10 lần. Còn trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ hoạt lực protease và amylaza cũng thấp hơn trong môi trường đối chứng (NH4)2HPO4 và nước chiết đậu tương. Đối với xạ khuẩn ưu nhiệt Actynomyces Vulgaris U2 thì peptin là chất cảm ứng sinh tổng hợp enzyme protease là tốt nhất. Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh vật. Glỹin, alanin, metionin và lơxin cso tác dụng làm tăng hoạt lực protease cảu chủng đột biến A. oryzae 251-90 đến 6-9% và nguyên chủng A. oryzae 132-63 tới 7-24%. Nhiều axit amin có tcs dụgn ức chế đến sinh tổng hợp enzyme, Valin, Axit glutamic, izolỡin và valin ức chế tổng hợp enzyme ở B. megaterium 60%. Còn đối với B. subtilis các axít amin ức chế trong quá trình này là glyxin, metinonin, axit glutamic, alamin, lơxin,… Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đang kể sinh tổng hợp proteinza vi sinh vật. 3.3.3. Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sinh trưởng. Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật. Ion Mg2+ cso tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme cso hoạt tính ở nhiệt độ cao. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25-30oC. Trị số pH ban đầu cảu môi trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 22 Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy môi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi trường bề sâu (môi trường dịch thể), thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc thì việc này cực kỳ quan trọng). Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt. Khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định lượng sao chi quá trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất. Muốn vậy người ta có thể sử dụng một số phương pháp: Phương pháp tối ưu hoá quy hoạch thực hiện toàn phần. Phương pháp toán học môhình hoá thực nghiệm. 3.4. Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme. Có thể chia làm 2 loại: môi trường tổng hợp và môi trường tự nhiên. Môi trường tổng hợp: là môi trường bao gồm các chất với liều lượng xác định (qua tìm hiểu, nghiên cứu), chẳng hạn nguồn cacbon có thể là tinh bột, xenluloza, đường, axit, rượu, nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ. Loại môi trường này được sử dụng chomục đích nghiên cứu. Môi trường tự nhiên: thường dùng các loại phế liệu, nguyên liệu có chứa các nguồn cacbon, nitơ, khoáng, các yếu tố sinh tổng hợp trưởng. Mặt khác, các nguyên liệu này có sẵn, rẻ tiền nên được sử dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất các phế phẩm enzyme từ vi sinh vật. Các nguyên liệu để chuẩn bị làm môi trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép hoa quả, rau, khô dầu, bã rượu, rĩ đường, sản phẩm phân huỷ nấm, men bia, trấu, lõi ngô. Khi lựa chọn sử dụng môi truờng cần chú ý đến các chất cso tác dụng điều hoà sinh tổng hợp enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 23 Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25-30oC. Trị số pH ban đầu cảu môi trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật. 3.5. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật. • Nuôi cấy bề mặt: Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương (đậu tương lên men-misô) đã được nấu chín trộn hạt cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương). Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… cso chất phụ gia là trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mông, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc rượu.
Quy trình công nghệ: Làm nguội, tơi. Thanh trùng bằng nhiệt độ. Làm ẩm. trộn nguyên liệu. Nuôi cấy, theo dõi, xử lý. Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy. Gieo trồng vsv lý.
Ưu nhược điểm: Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Trong công nghiệp rượu muốn đường hoá 100kg tinh bột chỉ cần 5kg chế phẩm nấm mốc bề mặt nhưng phải cần đến 100lít nấm mốc chìm để lọc bã và tế bào vi sinh vật. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 24 Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp mà không cần khâu tách và làm sạch enzyme. Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện qui mô gia đình, trang trại cũng như qui mô đến 20T/ngày. Nuôi cấy trong điều kiện vô cùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy đều có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó. Tuy nhiên phương pháp bề mặt cso năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tự động hoá, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều. • Nuôi cấy chìm Vi sinh vật được nuoi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếu trong đa số trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vsv dùng nguồn cơ chất cacbon là đường glucoza, saccharoza. Thực tế, trong một số trường hợp đường hoá sơ bộ tinh bột trước khi thanh trùng. Khi đó đường maltoza được tạo thành là chất cảm ứng tốt, môi trường thường giảm độ nhớt nên dễ dàng cho quá trình khuấy trộn và sục khí. Phương pháp nuôi cấy bề sâu đồi hỏi phải được vô trùng tuỵet đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy. Các giai đoạn chính cảu quá trình nuôi cấy chìm 1 bước gồm: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất.
Ưu nhược điểm Phương pháp nuôi cấy hiện đậi dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất. Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến cso khả năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện vệ sinh, vô trùng. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 25 Tuy nhiên do thu được canh trường và nông độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn. 3.6 Tách và làm sạch chế phẩm enzyme. Một điều cần nói thêm nữa là enzyme thường chứa ở các tế bào vi sinh vật gọi là các enzyme trong tế bào (intracellular), nhuwnh nó cũng có thể được các vi sinh vật tiết ra môi trường sống. Đó là các enzyme ngoài tế bào (extracellular). Enzyme vi sinh vật thương chiết là enzyme ngoại bào. Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng tế bào và màng của các cấu tử của tế bào. Do đó có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch. Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cat thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa (homogenzizator). Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lí và hóa học khác nhau như sóng siêu âm. Dùng các dung môi hữu cơ như buthanol, aceton, glycerin, ethyl acetate… và chất detergent. Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ. Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc bằng các dung dịch muối trung tính. Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý. Trước hết đó là nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần thiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 5 oC). Các thao tác phải nhanh. Một số chất điện li làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl2, CaCl2. Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 26 Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường… là các tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Thẩm tích để loại muối (NH4)2SO4 trong kết tủa protein Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tử lượng cao khác người ta hay dung kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion) điện di, phương pháp lọc gel. Mục đích yêu cầu: Các chế phẩm enzyme được sử dụng ở các dạng khác nhau theo mức độ tinh khiết (hoạt độ riêng). Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất nếu chúng không gây ảnh hưởng đáng kể đến sản phẩm và qui trình công nghệ sau này( ví dụ: sản xuất rượu, nước chấm thực vật, da). Cũng có khi người ta cần sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học. Enzyme nói chung rất dễ giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài do đó khi tách và tinh chế enzyme để tránh sự biến hình protein ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp, độ pH thấp không có mặt các chất gây biến hình enzyme. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 27 3.6.1 Phương pháp kết tủa Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo % nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dung dịch enzyme. Các loại muối có thể được dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4… ngươi ta đã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme. Loại muối này lại rẻ và phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hào 767 g/l ở 25 0C). 3.6.2 Phương pháp sắc ký *Các kỹ thuật sắc ký cột Dịch chiết enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn chưa đảm bảo độ đồng nhất cần thiết. Do đó dịch chiết enzyme được tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột. - Phương pháp dùng chấ rây phân tử (lọc gel – gel filtration) Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra. Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme. Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yeus tố về cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước (hydrophyl). Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 28 - Phương pháp sắc ký trao đổi ion Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau điện tích tổng số của các protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao dổi ion. Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit. Đây là những chất giá trơ, không tan trong nước, có bản chát là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polystiron. Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa. Các chất trao dổi ion có chất giá là cellulose, sephadex, molselect thông thường được dùng để tách protein enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá là polystirol (ví dụ như Dowex, Amberlite) chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn. Anionit DEAE – cellulose (diethylamino – ethyl – cellulose) là dẫn xuất este của cellulose. C2H5 C2H5 Cellulose – O – CH2 – N C2H5 Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 29 Trong H2O nó được phân li: Cellulose – O – C2H4 – N – (C2H5) + H2O C2H5 Cellulose – O – C2H4 – N+ + OH C2H5 H Đây là chấ trao đổi anion Nếu chất giá là sephadex thì chúng ta có chất trao đổi ion sephadex. Đó là cacs loại DEAE – sephadex và CM – sephadex. Ưu điểm của loại này là vừa tách được protein enzyme về kích thước và về điện tích tổng số của các protein enzyme. Trường hợp CM – sephadex trên chất giá sephadex có gắn nhóm COO- - O – CH2 – COOH Phân ly COO – (mang điện tích) Đây là chất trao đổi cation. Ngoài ra, có các phương pháp : - Phương pháp dùng cháy phụ - Phương pháp dùng chất phụ đặc hiệu sinh học hay là phương pháp sắc ký ái lực (afinity chromatography). 3.6.3 Phương pháp tách hệ hai pha nước Cơ sở kỹ thuật này dựa vào sự phân bố khác nhau của hỗn hợp trong dung dịch hai pha không hòa tan vào nhau. Các hệ hai pha đặc trưng bằng cách trộn các hệ dung môi vào nhau đẻ tạo thành hai pha riêng biệt. Hệ dung môi được sử dụng trong phương pháp này có thể là polymer/polymer như: polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc heejpolymer/muối như PEG và potasium phosphate, sodium Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 30 phosphate , sodium sulphate… Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì vậy phương pháp pháp này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch protein. Hệ hai pha nước được xem là phương pháp tốt cho việc phân tách và tinh sạch các hỗn hợp, vì phân tách chất lỏng có mật độ khác nhau dễ dàng hơn phân tách các chất rắn ra khỏi các chất lỏng. So với các phương pháp tinh sạch khác thì hệ hai pha nước có một số ưu điểm hơn như: có độ hòa tan trong nước của hai pha lớn (70 – 80 5), đạt độ tinh sạch cao, hiệu suất cao, dễ dàng sử dụng ở quy mô lớn và đặc biệt polymer được tái sử dụng. Sự phân tách đạt hiệu quả cao tùy thuộc vào các thông số như khối lượng phân tử và điện tích của đối tượng nghiên cứu, nồng độ và khối lượng phân tử của các polymer, nhiệt độ, pH, thời gian, lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các loại muối đa hóa trị như phosphaste hoặc sulphate… PHẦN IV. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE 4.1 Quy trình công nghệ lên men tạo enzyme protease 4.1.1 Giới thiệu chung Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20, việc nuôi cấy vi sinh vật thường được thực hiện theo phương pháp bề mặt. Phương pháp này được phát triển rất rỗng rãi, không chỉ để thu nhận chế phẩm enzyme ma trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh và nột số quá trình lên men truyền thống. 4.1.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt. Phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh v