Luận án Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý rác hữu cơ phục vụ sản xuất nông nghiệp tỉnh Sóc Trăng - Mai Thi

Gram âm; (3): + tạo nội bào tử, - không tạo nội bào tử. 4.4.2.2 Đặc tính sinh hóa Tất cả 50 dòng vi khuẩn đều có phản ứng dương tính với thuốc thử H2O2, tức đều có khả năng sinh catalase. Tuy nhiên, theo đánh giá cảm quan, khả năng sinh catalase có sự khác biệt giữa các dòng vi khuẩn. Theo mức độ sủi 49 bọt thì có 35 dòng có hoạt tính yếu (70%) và 15 dòng có hoạt tính trung bình. Sự khác biệt cho thấy khả năng khử H2O2 và nhu cầu O2 của các dòng vi khuẩn là khác nhau (Bảng 4.9). Kết quả kiểm tra Methylred cho thấy có 19 dòng sinh acid mạnh khi đổi màu Methyl red sang đỏ chiếm 38%, 14 dòng sinh acid trung bình khi đổi màu Methyl red sang màu cam chiếm 28% và 17 dòng không sinh acid chiếm 34% (Bảng 4.9). Bảng 4.9: Đặc tính sinh hóa của 50 dòng vi khuẩn Dòng Catalase1 Methyl red2 Dòng Catalase1 Methyl red2 SC1 ++ Cam SC26 + Đỏ SC2 ++ Vàng SC27 + Cam SC3 + Đỏ SC28 + Đỏ SC4 ++ Vàng SC29 + Đỏ SC5 ++ Cam TC30 + Cam SC6 + Đỏ TC31 ++ Vàng SC7 + Cam TC32 + Cam SC8 ++ Vàng TC33 + ĐỏVàng SC9 + Đỏ TC34 + Vàng SC10 + Đỏ TC35 + Đỏ SC11 + Vàng TC36 + Cam SC12 + Cam TC37 + + Đỏ SC13 + Cam TC38 + Vàng SC14 + + Vàng TC39 ++ Cam SC15 + Đỏ TC40 + Đỏ SC16 + Đỏ TC41 + Đỏ SC17 + Cam TC42 + Cam SC18 ++ Vàng TC43 + + Cam SC19 + Đỏ TC44 + Vàng SC20 + Đỏ TC45 + + Cam SC21 + Vàng TC46 + Đỏ SC22 + Cam TC47 + Đỏ SC23 ++ Vàng TC48 + + Cam SC24 + Đỏ TC49 + Vàng SC25 + Đỏ TC50 + + Cam Ghi chú: (1) +: hoạt tính yếu, ++: hoạt tính trung bình; (2) Đỏ: sinh acid mạnh, Cam: sinh acid yếu, Vàng: không sinh acid. 4.2.3 Khả năng phân hủy CMC của các dòng vi khuẩn Hai mươi lăm dòng có khả năng phân hủy CMC với khả năng phân hủy (E) dao động từ 3 đến 23,8 mm thể hiện qua vòng sáng rõ rệt khi nhuộm với 50 thuốc thử lugol sau khi ủ ở 30oC trong 72 giờ (Hình 4.6). Trong đó, số dòng có khả năng phân hủy CMC được phân lập từ sùng đất là 15 dòng so với 10 dòng được phân lập từ trùn đất. Bốn dòng triển vọng dựa trên giá trị E giảm dần là SC12 (23,8 mm), SC5 (22,6 mm), TC42 (18,7 mm) và TC36 (17,9 mm) (Bảng 4.10). Khi thay cơ chất CMC bằng cơ chất bột giấy, bốn dòng SC12, SC5, TC42 và TC36 vẫn thể hiện khả năng phân hủy cao nhất với giá trị E tương ứng là 24,3; 23,0; 18,3 và 15,3 mm (Bảng 4.11). Dựa trên giá trị E, khả năng phân hủy CMC và khả năng phân hủy bột giấy nhìn chung không quá khác biệt. Hình 4.6: Vòng sáng phân hủy CMC Vòng sáng thể hiện khả năng phân hủy CMC (E) của các dòng vi khuẩn SC5 (a); SC12 (b), TC42 (a1), TC36 (b1). Hai dòng vi khuẩn SC3 (c) và TC33 (c1) không có khả năng phân hủy CMC. Bảng 4.10: Khả năng phân hủy CMC của các dòng vi khuẩn Dòng Khả năng phân hủy E (mm) Dòng Khả năng phân hủy E (mm) SC1 10,3f SC25 3,0k SC2 5,0i SC27 9,3g SC5 22,6b TC30 15,7e SC7 15,3e TC32 4,0j SC8 17,6d TC34 4,0j SC9 10,0fg TC36 17,9cd SC11 9,3g TC38 6,3h SC12 23,8a TC40 4,3ij SC13 6,0h TC42 18,7c SC15 4,7ij TC44 3,0k SC16 4,3ij TC47 3,7jk SC18 4,3ij TC49 3,0k SC23 3,0k 51 CV (%) = 6,29 Ghi chú: Giá trị trung bình theo sau có các mẫu tự giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (α = 0,05). Bảng 4.11: Khả năng phân hủy bột giấy của 10 dòng triển vọng Dòng Khả năng phân hủy E (mm) Dòng Khả năng phân hủy E (mm) SC12 24,3a TC30 10,3de SC5 23,0ab SC7 8,0ef TC42 18,3bc SC1 7,7ef TC36 15,3cd SC11 6,7ef SC8 14,0cd SC27 4,0f CV (%) = 16,34 Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau có các ký tự giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (α = 0,05). Những dòng có khả năng phân hủy CMC mạnh (hay có giá trị E cao) thì hoạt tính enzyme endoglucanase và exoglucanase cũng cao tương ứng. Bốn dòng SC12, SC5, TC42 và TC36 là những dòng đứng đầu dựa theo kết quả khảo sát hoạt tính enzyme. Cụ thể, hoạt tính endoglucanase của SC12, SC5, TC42 và TC36 lần lượt là 0,043 UI/mL, 0,037 UI/mL, 0,029 UI/mL và 0,023 UI/mL và hoạt tính enzyme exoglucanase tương ứng là 0,041 UI/mL, 0,036 UI/mL, 0,028 UI/mL và 0,025 UI/mL (Bảng 4.12). Bốn dòng này được chọn để giải trình tự đoạn gen 16S rRNA. Bảng 4.12: Hoạt tính endoglucanase và exoglucanase CV (%) = 5,04 Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau có các ký tự giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (α = 0,05). Dòng Hoạt tính endoglucanase (UI/mL) Hoạt tính exoglucanaase (UI/mL) SC12 0,043a 0,041a SC5 0,037ab 0,036b TC42 0,029bc 0,028c TC36 0,023cd 0,025d SC8 0,019d 0,019e TC30 0,019d 0,017ef SC7 0,017de 0,016f SC1 0,016de 0,015f SC11 0,015de 0,015f SC27 0,009e 0,009g 52 4.2.4 Kết quả định danh Sản phẩm PCR của dòng SC12, SC5, TC42 và TC36 đều có band ở vị trí khoảng 1500 bp nghĩa là quá trình PCR đã khuếch đại được đoạn gene 16S rRNA và sản phẩm của quá trình PCR được dùng để giải trình tự (Hình 4.7). Hình 4.7: Phổ điện di sản phẩm PCR của bốn dòng vi khuẩn triển vọng Phổ điện di bao gồm thang chuẩn 1500 bp (M), dòng SC12 (giếng 2 hình A), dòng SC5 (giếng 5 hình A), dòng TC42 (giếng 3 hình B) và dòng TC20 (giếng 5 hình B). Dòng SC12 tương đồng với Bacillus subtilis strain GX S-15 16S với độ đồng hình là 97% và dòng SC5 tương đồng với Bacillus subtilis strain CMST 03/13COR5 với độ đồng hình là 98% (Bảng 4.13). Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của chi Bacillus như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Nhiều dòng B. subtilis có khả năng phân hủy cellulose và đã được ứng dụng trong thực tiễn như đã thảo luận ở mục 4.1.4. Dòng TC42 tương đồng với vi khuẩn Bacillus megaterium strain F3-1- 10-16s với độ đồng hình là 96% và TC36 tương đồng với vi khuẩn Bacillus megaterim strain AU03-16s với độ đồng hình là 98% (Bảng 4.13). Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của chi Bacillus như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Một số nghiên cứu trên thế giới gần đây chứng minh có nhiều dòng B. megaterium phân hủy cellulose tốt, chẳng hạn như dòng Bacillus megaterium S3 trong nghiên cứu của Aftab (2013) có khả năng phân hủy cellulose và có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp như tác giả nhận định. Năm 2015, Ferbiyanto et al. (2015) cũng phân lập được dòng B. megaterium RU4 có khả năng phân hủy cellulose mạnh từ ruột loài Macrotermes gilvus. Bacillus megaterium đã được dùng như sản phẩm thúc đẩy quá trình hoai mục của cỏ rơm trong ủ phân hữu cơ (Ribeiro et al., 2016). 53 Bảng 4.13: Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI Dòng vi khuẩn Kết quả so sánh với dữ liệu NCBI Đoạn gen giải trình tự (nu) Mức độ đồng hình (%) Accession number SC12 Bacillus subtilis strain GX S-15 16S 1512 97 KU904297.1 SC5 Bacillus subtilis strain CMST 03/13COR5 1023 96 KX533937.1 TC42 Bacillus megaterium strain F3-1-10-16s 1222 95 KX349998.1 TC36 Bacillus megaterium strain AU03-16s 1150 97 GU384689.1 4.3 Vi khuẩn phân hủy tinh bột từ rác và nước rỉ rác 4.3.1 Kết quả phân lập Sau 72 giờ nuôi, những đĩa trải vi khuẩn từ 3 mẫu rác và 3 mẫu nước rỉ rác (được thu ở các huyện Trần Đề, huyện Kế Sách và thị xã Ngã Năm, tỉnh Sóc Trăng) trên môi trường thạch tinh bột 1% đã xuất hiện khuẩn lạc với những đặc điểm rõ rệt. Mỗi dạng khuẩn lạc đều được tách ròng và có tất cả 30 vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột đã được phân lập. Vi khuẩn phân hủy tinh bột từ bãi rác được ký hiệu là RB1, RB2, ...RB30. 4.3.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa 4.3.2.1 Đặc điểm hình thái a) Đặc điểm khuẩn lạc Khuẩn lạc của mỗi dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột được phân lập từ bãi rác có đặc điểm riêng thể hiện qua hình dạng, độ nổi, dạng bìa, màu sắc và đường kính khuẩn lạc (Hình 4.8). Về hình dạng, 23 (76,7%) dòng có khuẩn lạc dạng hình tròn gấp ba lần số dòng có khuẩn lạc dạng không đều (7 dòng hay 23,3%). Hơn một nữa số dòng có độ nổi khuẩn lạc lài (17 dòng chiếm 56,7%), hơn 1/3 số dòng có độ nổi mô (11 dòng chiếm 36,7%) và chỉ 2 (6,6%) dòng có khuẩn lạc phẳng. Hai mươi ba dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng bìa nguyên (76,7%), ba dòng vi khuẩn có dạng bìa răng cưa (10%) và bốn dòng vi khuẩn có dạng bìa gợn sóng (13,3%). Khuẩn lạc có màu trắng trong, màu trắng sữa và màu vàng nhạt chiếm lần lượt 36,7% (11 dòng), 50% (15 dòng) và 13,4% (4 dòng). Đối với khuẩn lạc dạng hình tròn, đường kính dao động từ 0,5 đến 2,5 mm và từ 2,5x1,5 đến 3,8x1,5 mm đối với khuẩn lạc có hình dạng không đều (Bảng 4.14). 54 Hình 4.8: Khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột Hình khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn RB8(A), RB4 (B), RB19 (C) và RB2 (D) Bảng 4.14: Đặc điểm khuẩn lạc của 30 dòng vi khuẩn Dòng Hình dạng Dạng bìa Độ nổi Màu sắc Đường kính (mm) RB1 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 2 RB2 Tròn Nguyên Lài Trắng sữa 2 RB3 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 1 RB4 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 0,5 RB5 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 2 RB6 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 1,5 RB7 Không đều Răng cưa Lài Vàng nhạt 3×1,5 RB8 Tròn Nguyên Phẳng Trắng trong 1,5 RB9 Tròn Nguyên Phẳng Vàng nhạt 1 RB10 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 1,5 RB11 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 RB12 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 2,5 RB13 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 2,5 RB14 Tròn Nguyên Phẳng Trắng sữa 1,5 RB15 Không đều Gợn sóng Lài Trắng sữa 3,8×1,5 RB16 Không đều Răng cưa Lài Vàng nhạt 3,8×1,5 55 Dòng Hình dạng Dạng bìa Độ nổi Màu sắc Đường kính (mm) RB17 Tròn Răng cưa Lài Trắng trong 2 RB18 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 RB19 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 1,5 RB20 Không đều Gợn sóng Lài Trắng sữa 3,8×1,5 RB21 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 RB22 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 1,5 RB23 Không đều Gợn sóng Lài Trắng sữa 2,5×1,5 RB24 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 RB25 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 1,5 RB26 Tròn Nguyên Lài Trắng sữa 2 RB27 Tròn Nguyên Lài Trắng sữa 2 RB28 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 RB29 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 1,5 RB30 Không đều Gợn sóng Lài Trắng sữa 3,8×1,5 b) Đặc điểm tế bào Số dòng vi khuẩn có tế bào dạng que ngắn chiếm đa số với 26 dòng (86,7%) so với 4 dòng dạng que dài (13,3%). Tất cả 30 dòng vi khuẩn đều có khả năng di động khi nuôi trong môi trường thạch LB. Chiều dài của tế bào vi khuẩn dao động trong khoảng 0,87-3,74 µm và chiều dài ngang dao động trong khoảng 0,52-1,39 µm. Số tế bào vi khuẩn có Gram dương là 21 dòng (70%) và số tế bào Gram âm là 20 (30%). Có 21 dòng có khả năng tạo nội bào tử và những dòng này đều có tế bào dạng que và Gram dương (Bảng 4.15). Bảng 4.15: Đặc điểm tế bào của 30 dòng vi khuẩn Dòng Hình dạng Kích thước (µm) Di động1 Gram2 Bào tử3 Chiều dài Chiều rộng RB1 Que ngắn 1,22 0,52 + + + RB2 Que ngắn 1,39 0,87 + + + RB3 Que dài 4,39 1,87 + + + RB4 Que ngắn 0,87 0,52 + + + RB5 Que ngắn 1,39 0,87 + - - RB6 Que ngắn 1.22 0,87 + - - RB7 Que ngắn 1,39 0,69 + + + RB8 Que ngắn 2,50 0,90 + + + RB9 Que ngắn 1,04 0,52 + - - RB10 Que ngắn 0,87 0,52 + + + RB11 Que ngắn 1,39 0,87 + + + RB12 Que ngắn 2,09 1,39 + + + RB13 Que ngắn 1,39 0,87 + + + RB14 Que ngắn 1.45 0,87 + - - RB15 Que ngắn 2,39 0,52 + + + RB16 Que ngắn 1,87 0,52 + + + RB17 Que dài 3,00 0,8 + + + RB18 Que ngắn 1,39 0,87 + + + RB19 Que ngắn 1,74 1,22 + + + RB20 Que ngắn 2,09 1,39 + - - 56 Dòng Hình dạng Kích thước (µm) Di động1 Gram2 Bào tử3 Chiều dài Chiều rộng RB21 Que ngắn 2,39 0,87 + + + RB22 Que ngắn 1,39 0,69 + + + RB23 Que ngắn 1,22 0,7 + + + RB24 Que dài 3,33 1,22 + - - RB25 Que ngắn 1,39 0,87 + - - RB26 Que ngắn 1,87 0,87 + - - RB27 Que dài 3,74 1,22 + + + RB28 Que ngắn 1,39 0,87 + - - RB29 Que ngắn 0,87 0,52 + + + RB30 Que ngắn 1,39 0,87 + + + Ghi chú: (1): + di động, - không di động; (2): + Gram dương, - Gram âm; (3): + tạo nội bào tử, - không tạo nội bào tử. 4.3.2.2 Đặc điểm sinh hóa Tất cả 30 dòng vi khuẩn đều có phản ứng dương tính với thuốc thử H2O2, tức đều có khả năng sinh catalase. Tuy nhiên, theo đánh giá cảm quan, khả năng sinh catalase có sự khác biệt giữa các dòng vi khuẩn. Theo mức độ sủi bọt thì có 13 (43,3%) dòng có hoạt tính yếu, 15 (50%) dòng có hoạt tính trung bình và 2 (6,7%) dòng có hoạt tính mạnh. Sự khác biệt cho thấy khả năng khử H2O2 và nhu cầu O2 của các dòng vi khuẩn có thể khác nhau (Bảng 4.16). Kết quả kiểm tra Methylred cho thấy có 12 dòng sinh acid mạnh khi đổi màu Methyl red sang đỏ chiếm 40%, 10 dòng sinh acid trung bình khi đổi màu Methyl red sang màu cam chiếm 33,3% và 8 dòng không sinh acid chiếm 26,7% (Bảng 4.16). Bảng 4.16: Đặc điểm sinh hóa 30 dòng vi khuẩn Dòng Catalase1 Methyl red2 Dòng Catalase1 Methyl red2 RB1 ++ Cam RB16 + Đỏ RB2 ++ Vàng RB17 ++ Cam RB3 + + Đỏ RB18 + + Đỏ RB4 ++ Vàng RB19 + + Đỏ RB5 ++ Cam RB20 + + Cam RB6 + Đỏ RB21 + Vàng RB7 + Cam RB22 + + Cam RB8 ++ Vàng RB23 + ĐỏVàng RB9 ++ Đỏ RB24 + Vàng RB10 + Đỏ RB25 + Đỏ RB11 + Vàng RB26 + Cam RB12 + + + Cam RB27 + + Đỏ RB13 + Cam RB28 + Vàng RB14 + + Vàng RB29 ++ Cam RB15 + Đỏ RB30 +++ Đỏ 57 Ghi chú: (1) +: hoạt tính yếu, ++: hoạt tính trung bình; +++: hoát tính mạnh.; (2) Đỏ: sinh acid mạnh, Cam: sinh acid yếu, Vàng: không sinh acid. 4.3.3 Khả năng phân hủy tinh bột của các dòng vi khuẩn Tất cả 30 dòng vi khuẩn đều tạo vòng sáng xung quanh khuẩn lạc trên môi trường tinh bột 1% sau 72 giờ ủ ở 30oC khi nhuộm với thuốc thử lugol (Hình 4.9). Khả năng phân hủy tinh bột (E) của các dòng vi khuẩn dao động trong khoảng 1,57 đến 23,5 mm. Dòng RB8 phân hủy tinh bột mạnh nhất với giá trị E 23,5 mm; kế đến là dòng RB17 tương ứng với E 21,47 mm (Bảng 4.17). Hoạt tính enzyme amylase của RB8 và RB17 tương ứng là 22,2 và 15,6 UI/mL (Bảng 4.18). Dựa theo khả năng phân hủy tinh bột, hai dòng này đã được chọn để giải trình tự đoạn gene 16S rRNA và định danh. Bảng 4.17: Khả năng phân hủy tinh bột của 30 dòng vi khuẩn Dòng Khả năng phân hủy E (mm) Dòng Khả năng phân hủy E (mm) RB8 23,50a RB27 10,27hi RB17 21,47b RB5 9,90ij RB30 20,50c RB18 9,87ij RB29 20,43c RB12 9,87ij RB24 20,10c RB10 9,73ij RB23 16,63d RB1 9,27jk RB22 16,63d RB11 8,97k RB21 16,37d RB26 8,10l RB25 15,20e RB14 7,77l RB28 13,57f RB16 6,90m RB3 13,50f RB20 6,87m RB2 13,37f RB19 6,83m RB9 11,90g RB15 6,43m RB13 10,77h RB7 2,90n RB6 10,30hi RB4 1,57o CV (%) = 3,73 Ghi chú: Giá trị trung bình theo sau có các mẫu tự giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (α = 0,05). 58 Hình 4.9: Vòng sáng phân hủy tinh bột Vòng sáng thể hiện khả năng phân hủy bột của các dòng vi khuẩn RB8 (b), RB17 (a), RB30 (d) và dòng vi khuẩn không có khả năng phân hủy tinh bột (c). Bảng 4.18: Hoạt tính enzyme amylase của hai dòng triển vọng STT Vi khuẩn Hoạt tính amylase (UI/mL) 1 RB8 22,2 2 RB17 15,6 4.3.4 Kết quả định danh Giếng 20 (dòng RB8) và giếng 21 (dòng RB17) có band ở vị trí khoảng 1500 bp (Hình 4.10) nghĩa là quá trình PCR đã khuếch đại được đoạn gene 16S rRNA của vi khuẩn RB8 và RB17 và sản phẩm của quá trình PCR này đã được dùng để giải trình tự gen. Hình 4.10: Phổ điện di sản phẩm PCR của hai dòng vi khuẩn triển vọng Phổ điện di bao gồm thang chuẩn 3000 bp, Đối chứng dương (giếng +), đối chứng âm (giếng -), dòng RB8 (giếng 20) và dòng RB17 (giếng 21). Dòng RB8 có độ tương đồng 96% với vi khuẩn Bacillus flexus gene 16S rRNA khi so sánh trình tự gen 16S rRNA của dòng này với trình tự gene 16S rRNA trên ngân hàng dữ liệu NCBI (Bảng 4.19). Theo (Zhao et al., 2008) và 59 Pal et al. (2014) thì Bacillus flexus là một loài vi khuẩn Gram (+), hình que, di động, sử dụng được O2 và có khả năng tạo nội bào tử. Quá trình khảo sát của luận án cũng cho thấy dòng RB8 là vi khuẩn Gram (+), hình que (dài), di động và có thể sống trong môi trường hiếu khí. Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy Bacillus flexus là vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột và có tiềm năng ứng dụng cao. Theo nghiên cứu của (Zhao et al., 2008) thì Bacillus flexus là loài vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột rất tốt trong môi trường kiềm. Năm 2013, (Chen et al., 2013) đã nghiên cứu sử dụng Bacillus flexus để xử lý nước thải có nồng độ COD cao với kết quả 81,04% COD được loại bỏ. Dòng RB17 có độ tương đồng 99% với vi khuẩn Bacillus subtilis strain NG3-5 16S (Bảng 4.19). Kết quả này phù hợp với các đặc điểm hình thái và sinh hóa của dòng RB17 như Gram dương, hiếu khí, que dài, di động và tạo nội bào tử (Bergey et al., 1957). Khả năng phân hủy tinh bột của loài vi khuẩn Bacillus subtilis đã được tìm thấy ở nhiều nghiên cứu chẳng hạn như nghiên cứu của Panneerselvam và Elavarasi (2015) phân lập được dòng B. subtilis từ đất có khả năng sinh enzyme α-amylase phân hủy tinh bột. Năm 2012, Vijayalakshmi et al. cũng đã phân lập được dòng B.subtilis KC3 từ đất có khả năng phân hủy tinh bột mạnh cũng như khả năng sản sinh α-amylase cao với hoạt tính 25 UI/mL. Bảng 4.19: Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI Dòng vi khuẩn Kết quả so sánh với dữ liệu NCBI Đoạn gen giải trình tự (nu) Mức độ đồng hình (%) Accession number RB8 Bacillus flexus gene for 16S rRNA 1377 96 LC189347.1 RB17 Bacillus subtilis strain NG3-5 16S 1286 99 KR999939.1 4.4 Vi khuẩn phân hủy tinh bột từ ruột sùng và trùn đất 4.4.1 Kết quả phân lập Sau 72 giờ nuôi, từ những đĩa trải vi khuẩn từ ruột 3 mẫu con sùng và 3 mẫu con trùn đất trên môi trường thạch tinh bột 1%, 28 dòng vi khuẩn được phân lập; trong đó 14 dòng vi phân lập từ ruột con sùng và 14 dòng vi khuẩn phân lập từ ruột con trùn đất trên môi trường tinh bột 1%. Những dòng vi khuẩn từ ruột trùn đất được ký hiệu là TB1, TB2,TB14 và những dòng vi khuẩn từ ruột sùng đất được ký hiệu là SB15, SB16,SB28. 60 4.4.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa 4.4.2.1 Đặc điểm hình thái a) Đặc điểm khuẩn lạc Sau 72 giờ nuôi, khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển đầy đủ và khác nhau ở một hoặc nhiều các đặc điểm bao gồm màu sắc, hình dạng, dạng bìa, đường kính và độ nổi (Hình 4.11). Cụ thể, 9 dòng có khuẩn lạc màu trắng trong chiếm 32,1%; 12 dòng có khuẩn lạc trắng sữa chiếm 42,90% và 7 dòng có màu vàng nhạt chiếm 25%. Khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng hình tròn và dạng không đều; trong đó khuẩn lạc dạng tròn là 25 dòng (89,3%) lớn hơn nhiều lần so với số khuẩn lạc dạng không đều là 3 dòng (10,70%). Khuẩn lạc có độ nổi lài chiếm 42,90% (12 dòng) thấp hơn so với số khuẩn lạc có độ nổi mô (16 dòng hay 57,10%). Số khuẩn lạc bìa nguyên là 20 dòng (71,40%); 5 dòng vi khuẩn bìa răng cưa (17,90%) và 3 dòng vi khuẩn có dạng bìa gợn sóng (10,70%). Đường kính khuẩn lạc dao động từ 0,7 đến 2,5 mm đối với vi khuẩn dạng tròn và từ 2x1,5 đến 3x1,5 mm đối với vi khuẩn dạng không đều (Bảng 4.20). Hình 4.11: Khuẩn lạc của hai dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột Hình khuẩn lạc của hai dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột TB1 (A) và SB19 (B) Bảng 4.20: Đặc điểm khuẩn lạc của 28 dòng vi khuẩn Dòng Hình dạng Dạng bìa Độ nổi Màu sắc Đường kính (mm) TB1 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 1 TB2 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 1,7 TB3 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 1,5 TB4 Tròn Nguyên Mô Vàng nhạt 1 TB5 Tròn Răng cưa Lài Trắng sữa 2 TB6 Không đều Gợn sóng Mô Trắng sữa 1,5x2 TB7 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 1,5 TB8 Tròn Nguyên Mô Vàng nhạt 1 61 Dòng Hình dạng Dạng bìa Độ nổi Màu sắc Đường kính (mm) TB9 Tròn Răng cưa Lài Trắng sữa 2 TB10 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 1 TB11 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 0,7 TB12 Không đều Gợn sóng Lài Trắng ngà 1,5x2,6 TB13 Tròn Răng cưa Lài Trắng sữa 1 TB14 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 2 SB15 Tròn Nguyên Mô Vàng nhạt 1,5 SB16 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 2,5 SB17 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 1 SB18 Tròn Nguyên Lài Trắng sữa 2 SB19 Tròn Nguyên Lài Vàng nhạt 2 SB20 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 1,5 SB21 Tròn Nguyên Mô Vàng nhạt 2 SB22 Tròn Nguyên Mô Trắng trong 1,5 SB23 Tròn Nguyên Mô Trắng sữa 1,7 SB24 Không đều Gợn sóng Lài Trắng sữa 1,5x3 SB25 Tròn Nguyên Lài Trắng trong 2 SB26 Tròn Nguyên Lài Trắng sữa 1,7 SB27 Tròn Răng cưa Lài Trắng sữa 1,5 SB28 Tròn Răng cưa Lài Vàng nhạt 2 b) Đặc điểm tế bào Tất cả 28 dòng vi khuẩn đều có khả năng di động và tế bào dạng que; trong đó que ngắn là 26 dòng chiếm 92,90% và que dài là 2 dòng chiếm 7,1%. Số dòng vi khuẩn Gram dương là 15 dòng chiếm 53,60% trong khi số vi khuẩn Gram âm là 13 dòng (46,40%). Tất cả những dòng vi khuẩn Gram dương đều có khả năng tạo nội bào tử. Chiều dài của tế bào dao động từ 1,2 đến 3 µm và chiều rộng dao động từ 0,8 đến 1,5 µm (Bảng 4.21). Bảng 4.21: Đặc điểm tế bào của 28 các dòng vi khuẩn Dòng Hình dạng Kích thước (µm) Di động1 Gram2 Bào tử3 Chiều dài Chiều rộng TB1 Que ngắn 1,2 1,0 + + + TB2 Que ngắn 2,5 1,2 + - - TB3 Que ngắn 1,2 1,0 + + + TB4 Que ngắn 1,2 1,0 + - - TB5 Que ngắn 1,2 1,0 + - - TB6 Que ngắn 2,5 1,5 + + + TB7 Que ngắn 2,5 1,0 + + + TB8 Que ngắn 2,5 1,0 + + + TB9 Que ngắn 2,2 1,2 + - - TB10 Que ngắn 1,2 1,0 + + + TB11 Que ngắn 2,5 0,8 + - - TB12 Que ngắn 2,5 1,0 + + + TB13 Que dài 3,0 1,0 + - - TB14 Que ngắn 2,5 1,0 + + + SB15 Que ngắn 2,5 1,0 + + + 62 Dòng Hình dạng Kích thước (µm) Di động1 Gram2 Bào tử3 Chiều dài Chiều rộng SB16 Que dài 3,0 1,0 + + + SB17 Que ngắn 2,5 1,0 + - - SB18 Que ngắn 2,5 0,9 + - - SB19 Que ngắn 2,5 0,8 + + + SB20 Que ngắn 1,2 0,8 + - - SB21 Que ngắn 1,2 1,0 + + + SB22 Que ngắn 1,2 0,8 + - - SB23 Que ngắn 1,2 1,0 + - - SB24 Que ngắn 2,5 1,0 + + + SB25 Que ngắn 2,5 0,9 + + + SB26 Que ngắn 2,5 1,0 + + + SB27 Que ngắn 2,5 1,0 + - - SB28 Que ngắn 1,2 0,8 + - - Ghi chú: (1): + di động, - không di động; (2): + Gram dương, - Gram âm; (3): + tạo nội bào tử, - không tạo nội bào tử. 4.4.2.2 Đặc điểm sinh hóa Tất cả 30 dòng vi khuẩn đều dương tính trong khảo sát hoạt tính catalase. Trong đó, 18 dòng có hoạt tính catalase yếu chiếm tỷ lệ 64,3% và 10 dòng có hoạt tính catalase trung bình chiếm tỷ lệ chiếm 35,7%. Sự khác biệt cho thấy khả năng khử H2O2 và nhu cầu O2 của các dòng vi khuẩn có thể khác nhau (Bảng 4.22). Kết quả kiểm tra Methylred cho thấy có 7 dòng sinh acid mạnh khi đổi màu Methyl red sang đỏ chiếm 25%, 12 dòng sinh acid trung bình khi đổi màu Methyl red sang màu cam chiếm 32,1% và 9 dòng không sinh acid chiếm 32,1% (Bảng 4.22). Bảng 4.22: Đặc tính sinh hóa 30 dòng vi khuẩn Dòng Catalase1 Methyl red2 Dòng Catalase1 Methyl red2 TB1 + Vàng SB15 + Cam TB2 + Vàng SB16 + Cam TB3 + + Đỏ SB17 + Cam TB4 ++ Vàng SB18 + + Đỏ TB5 + Cam SB19 + + Đỏ TB6 + Cam SB20 + + Cam TB7 + Cam SB21 + Vàng TB8 + Cam SB22 + + Cam TB9 ++ Đỏ SB23 + Vàng TB10 + Đỏ SB24 + Vàng TB11 + Vàng SB25 + Cam TB12 + + Đỏ SB26 + Cam TB13 + Cam SB27 + + Đỏ TB14 + + Vàng SB28 + Vàng 63 Ghi chú: (1) +: hoạt tính yếu, ++: hoạt tính trung bình; (2) Đỏ: sinh acid mạnh, Cam: sinh acid yếu, Vàng: không sinh acid. 4.4.3 Khả năng phân hủy tinh bột của các dòng vi khuẩn Dựa vào vòng sáng phân hủy khi nhuộm với thuốc thử lugol (Hình 4.12), có 27 dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột với giá trị E dao động từ 5,7 mm đến 23,4 mm. Ba dòng SB25, TB6 và SB16 có vòng sáng phân hủy tinh bột lớn nhất với giá trị E tương ứng là 23,4 mm, 21,7 mm và 21,57 mm (Bảng 4.23). Khi khảo sát hoạt tính enzyme amylase, mặc dù dòng SB25 có vòng sáng phân hủy tinh bột lớn nhất nhưng hoạt tính enzyme amylase lại thấp nhất với 13,64 UI/mL, trong khi hoạt tính amylase cao nhất được ghi nhận ở dòng TB6 (Bảng 4.24). Sự khác biệt đó có thể do thành phần dinh dưỡng của môi trường xác định khả năng phân hủy cơ chất và môi trường xác định hoạt tính enzyme khác nhau. Bảng 4.23 Khả năng phân hủy tinh bột của 27 dòng vi khuẩn Dòng Khả năng phân hủy E (mm) Dòng Khả năng phân hủy E(mm) SB25 23,43a TB4 13,27f TB6 21,70b TB14 12,97g SB16 21,57b SB21 12,97g TB5 21,23b SB22 11,70g TB2 18,77c TB7 11,60h TB3 18,10cd SB24 10,63h TB11 17,87d TB8 10,37i TB9 17,77d SB23 9,37i TB12 16,10e SB20 8,70j TB1 15,73e SB26 8,23jk TB13 15,50e SB17 8,23k TB10 14,70e SB19 6,50l SB27 14,70f SB15 5,70m SB28 14,10f CV (%) = 3,25 Ghi chú: Giá trị trung bình theo sau có các mẫu tự giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (α = 0,05). 64 Hình 4.12: Vòng sáng phân hủy tinh bột Vòng sáng phân hủy tinh bột của hai dòng vi khuẩn SB16 (a) và TB6 (b) Bảng 4.24: Hoạt tính enzyme amylase các dòng vi khuẩn Vi khuẩn Hoạt tính amylase (UI/mL) TB6 33,71 SB16 22,92 SB25 13,64 4.4.4 Kết quả định danh Dựa theo vòng sáng phân hủy (giá trị E) và hoạt tính enzyme amylase, ba dòng vi khuẩn SB25, TB6 và TB16 được chọn để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA. Giếng 2 (dòng SB25), giếng 3 (dòng TB6) và giếng 4 (dòng TB16) đều có band ở vị trí khoảng 1500 bp nghĩa là quá trình PCR đã khuếch đại được đoạn gene 16S rRNA của các dòng vi khuẩn đó và sản phẩm của quá trình PCR đã được dùng để giải trình tự (Hình 4.13). Hình 4.13 Phổ điện di sản phẩm PCR của các dòng vi khuẩn triể