Tóm tắt Luận án Nghiên cứu phát triển kỹ thuật Multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus Anthracis và Yersinia Pestis

h chính xác hơn bằng việc sử dụng cặp mồi thiết kế trên nhiễm sắc thể, đồng thời cũng sử dụng các cặp mồi để phát hiện các gen độc lực trên plasmid. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ Các chủng vi khuẩn, plasmid Chủng chuẩn B. anthracis 17JB (ký hiệu: Ba) và Y. pestis SVCM7 (ký hiệu: Yp) đầy đủ độc lực. Chủng chuẩn đối chứng âm: Bacillus cereus ATCC 6464, E. coli ATCC 25922, Y. enterocolitica ATCC 27729. Các chủng vi khuẩn phân lập nghi ngờ B. anthracis: gồm 23 chủng B. anthracis Ba1-Ba23; 2 chủng Y. pestis Yp1, Yp2. Plasmid pJET1.2-capA chứa toàn bộ trình tự gen capA (thuộc plasmid pXO1) của B. anthracis. Sinh phẩm, hoá chất, thiết bị: Sinh phẩm, hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm được đặt mua từ các hãng: Thermo Scientific, Integrated DNA Technologies- IDT, Qiagen, Norgen, bioMérieux, Biolabs, Gibco, Invitrogen. Các trang thiết bị Bộ môn Vi sinh y học, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y và Phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp thực nghiệm mô tả, phân tích trong phòng thí nghiệm và trên thực địa với các kỹ thuật vi sinh kinh điển và sinh học phân tử. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu gồm: 2.2.1. Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 2.2.2. Tách chiết DNA tổng số 2.2.3. Khuếch đại gen bằng PCR 2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose 2.2.5. Tinh sạch DNA 2.2.6. Thiết kế kỹ thuật mPCR xác định đồng thời gen đặc trưng và gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis 2.2.7. Tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis 2.2.8. Thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp của kỹ thuật mPCR 2.2.9. Tối ưu kỹ thuật mPCR chứa chứng nội tại 2.2.10. Thiết lập và đánh giá bộ mẫu chuẩn đánh giá độ nhạy, đặc hiệu và ổn định của kit mPCR 2.2.11. Xác định các chủng phân lập bằng nuôi cấy, định danh 2.2.12. Thử nghiệm kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập 2.2.13. Kiểm tra các chủng vi khuẩn bằng giải trình tự Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B. anthracis VÀ Y. pestis 3.1.1. Nghiên cứu thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho mPCR Kỹ thuật mPCR lý tưởng để xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis phải được thiết kế phát hiện đồng thời B. anthracis, Y. pestis và đánh giá đầy đủ các mức độ độc lực khác nhau của chúng trong tự nhiên. Trong đó, với B. anthracis cần 1 cặp mồi trên nhiễm sắc thể (lựa chọn gen vrrA) và 2 cặp mồi trên plasmid pXO1 và pXO2 tương ứng là gen pagA và capA. Tương tự, với Y. pestis, gen ypo2088 (trên nhiễm sắc thể), pla (pPCP1) và caf1 (pMT1) được lựa chọn. Như vậy, 6 cặp mồi đặc hiệu cho mPCR được thiết kế đảm bảo khuếch đại 6 gen đích kích thước khác nhau. Với gen vrrA, dựa vào trình tự tham chiếu trên NCBI, đã thiết kế được 5 cặp mồi cho khuếch đại một phần trình tự gen đích (Hình 3.2). Cặp mồi gen vrrA chưa được lựa chọn ngay bởi còn phụ thuộc vào kết quả thiết kế các cặp mồi cho 5 gen đích còn lại. Tương tự cho thiết kế các cặp mồi gen pagA, capA (B. anthracis) và ypo2088, pla, caf1 (Y. pestis). Sau khi kiểm tra về khả năng hình thành cấu trúc bậc 2 hay bắt cặp chéo giữa các mồi cũng như sự phù hợp về kích thước sản phẩm, 6 cặp mồi đã được lựa chọn. vrrA Hình 3. 2. Thông tin các cặp mồi khuếch đại gen vrrA Bảng 3. 1. Thông tin 6 cặp mồi của mPCR xác định B. anthracis và Y. pestis Tên mồi Trình tự (5’-3’) Tổng số base Tm* Kích thước (bp) vrrAF1/R1 CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA-F CCTCGCGCACTTCTTTTTCT-R 20 59.76 59.13 222 pagAF1/R1 AAATGGAGCACGGCTTCTGA-F AGCCTGTATCCACCCTCACT-R 20 59.96 59.96 751 capAF1/R1 TGACGATGACGATGGTTGGT-F GCTTCCTGTCTAGGACTCGG-R 20 59.39 59.26 610 ypoF1/R1 GGATGAGATAACGCGGGTGT-F AGAGAATCGTGATGCCGTCC-R 20 59.90 59.90 103 plaF1/R1 CGGGATGCTGAGTGGAAAGT-F ATTACCCGCACTCCTTTCGG-R 20 60.04 60.11 438 cafF1/R1 CGCTTACTCTTGGCGGCTAT-F GCTGCAAGTTTACCGCCTTT-R 20 60.25 59.69 271 *Tm. Nhiệt độ nóng chảy 3.1.2. Nghiên cứu thiết kế kỹ thuật mPCR Kỹ thuật mPCR được thiết kế và đánh giá trên 2 chủng chuẩn có đầy đủ độc lực là B. anthracis Ba và Y. pestis Yp cùng đối chứng âm là B. cereus và E. coli, Y. enterocolitica. 3.1.2.1. PCR đơn mồi phát hiện gen vrrA, pagA, capA của B. anthracis Để có cơ sở cho thiết kế kỹ thuật mPCR phát hiện đồng thời 3 gen đích B. anthracis, PCR đơn mồi được thực hiện ban đầu giúp kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm và độ đặc hiệu từng cặp mồi. Hình 3. 8. Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích pagA, vrrA, capA của B. anthracis Ba bằng PCR đơn mồi ĐC(-). Đối chứng âm là nước khử ion; M. Marker 100 bp (Thermo Scientific) Các gen pagA (751 bp), vrrA (222 bp) và capA (610 bp) đều xuất hiện băng đặc hiệu và không có băng phụ (Hình 3.8). Như vậy, nồng độ các thành phần, chu trình nhiệt trong PCR đơn mồi này sẽ được sử dụng cho mPCR tiếp theo. 3.1.2.2. Kỹ thuật mPCR phát hiện đồng thời 3 gen vrrA, pagA, capA của B. anthracis Kỹ thuật mPCR đã khuếch đại đồng thời 3 gen đích của B. anthracis. 3.1.2.3. PCR đơn mồi phát hiện gen ypo2088, pla, caf1 của Y. pestis PCR đơn mồi cho Y. pestis được thực hiện tương tự, sản phẩm là pla (438 bp), caf1 (271 bp), ypo2088 (103 bp) (Hình 3.10). Hình 3. 10. Sản phẩm khuếch đại 3 gen đích pla, caf1, ypo của Y. pestis Yp bằng PCR đơn mồi ĐC(-). Đối chứng âm là nước khử ion; M. Marker 100 bp (Thermo Scientific) 3.1.2.4. Kỹ thuật mPCR phát hiện đồng thời 3 gen ypo2088, pla, caf1 của Y. pestis Kỹ thuật mPCR đã khuếch đại đồng thời 3 gen đích của Y. pestis. 3.1.2.5. Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và từng tác nhân Để kiểm tra các cặp mồi của tác nhân này có bắt cặp chéo với DNA tác nhân còn lại, kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 1 khuôn hoặc DNA B. anthracis hoặc Y. pestis được thực hiện. Đường chạy Yp với khuôn là DNA Y. pestis chỉ xuất hiện 3 băng đích của Y. pestis. Tương tự, đường chạy Ba chỉ xuất hiện 3 băng đích của B. anthracis (Hình 3.12). Như vậy, các cặp mồi đã được thiết kế đặc hiệu cho B. anthracis, Y. pestis và không có hiện tượng bắt cặp chéo. bp ĐC(-) Yp Ba M bp Hình 3. 12. Sản phẩm PCR với 6 cặp mồi, từng loại DNA khuôn ĐC(-). Đối chứng âm là nước khử ion; Yp. Sản phẩm mPCR với khuôn DNA Y. pestis; Ba. Sản phẩm mPCR với khuôn DNA B. anthracis; M. Marker 100 bp (Thermo Scientific) 3.1.2.6. Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 2 tác nhân Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi và 2 loại khuôn chỉ thu được 3 băng đích của Y. pestis. 3.1.3. Nghiên cứu tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis Cần tối ưu các thông số của mPCR để đảm bảo xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis như: nồng độ mồi, đệm, MgCl2, dNTPs cũng như các điều kiện về chu trình nhiệt để thu được đồng thời 6 băng sản phẩm đích đặc hiệu. Nồng độ các mồi Y. pestis 0,1 μM và B. anthracis 0,6 μM là tối ưu trong mPCR (Hình 3.14). Hình 3. 14. Tối ưu nồng độ mồi của mPCR M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1. 0,1 μM; 2. 0,2 μM; 3. 0,4 μM; 4. 0,6 μM Với nhiệt độ gắn mồi 56oC, nồng độ MgCl2 và dNTPs tối ưu tương ứng là 0,6 mM và 0,25 mM, phản ứng mPCR cho kết quả 6 băng đặc hiệu rõ nét nhất. Nồng độ dung dịch đệm được khảo sát ở 4 mức là (1; 1,2; 1,4; 1,5X), và nồng độ 1,2X được lựa chọn. 3.1.4. Nghiên cứu thiết kế chứng nội tại tái tổ hợp trong kỹ thuật mPCR Trong chẩn đoán phân tử, chứng nội tại (Internal amplification control - IC) là rất cần thiết để loại trừ các trường hợp âm tính giả do quá trình tách chiết không hiệu quả hay những chất ức chế ảnh hưởng đến kỹ thuật PCR. Do đó, song song với việc thiết kế mPCR, chúng tôi đã thiết kế IC cho mPCR, đảm bảo kết quả chẩn đoán là chính xác bằng con đường tái tổ hợp. Quá trình tạo dòng IC đạt được kết quả như sau: một đoạn gen lef (IC1) phân lập từ B. anthracis bằng cặp mồi IC1F-BamHI/R-NdeI, tạo dòng phụ trong vector pJET1.2-blunt, kiểm tra vector pJET1.2-IC1 tái tổ hợp bằng PCR khuẩn lạc (Hình 3.18). Cặp enzyme BamHI và NdeI được sử dụng cắt đồng thời các vector pJET1.2-IC1 và pJET1.2-capA. Đoạn IC1 (0,65 kb từ pJET1.2-IC1) và phần còn lại của vector pJET1.2-capA (~4 kb) được tinh sạch gel, nối ghép tạo thể tái tổ hợp pJET1.2-capA-IC1. Plasmid này được kiểm tra bằng enzyme giới hạn và giải trình tự. Plasmid này chứa trình tự nhận biết của cặp mồi capAF1/R1 nên cũng được khuếch đại trong mPCR, cho sản phẩm kích thước 1000 bp phân biệt với sáu sản phẩm của gen chẩn đoán. Hình 3. 18. Phân lập gen lef bằng cặp mồi IC1F-BamHI/R-NdeI và tạo dòng phụ trong vector pJET1.2/blunt a) Sản phẩm khuếch đại gen lef (IC1) trên gel agarose 1,2%; M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1. Sản phẩm khuếch đại gen lef. b) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1,2%, M. Marker 1 kb (Thermo Scientific); 1-3. Các dòng khuẩn lạc 1-3 chứa vector tái tổ hợp pJET1.2-IC1. Hình 3. 20. Kiểm tra mPCR bổ sung IC trong quá trình tách chiết DNA ở các nồng độ khác nhau với mẫu B. anthracis M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 109-103. Các mức nồng độ IC tương ứng. Để kiểm soát toàn bộ các công đoạn của xét nghiệm, IC được bổ sung vào trong quá trình tách chiết với một lượng tối thiểu có thể phát hiện được nhằm loại bỏ tối đa sự ảnh hưởng đến hiệu quả tách chiết cũng như mPCR. Kết quả trên cho thấy, băng chứng nội tại (1 kb) xuất hiện rõ ở các mức nồng độ plasmid từ 109-105 copy/ mẫu. Ở mức nồng độ IC là 106-105 copy/ mẫu xuất hiện đầy đủ 3 băng đích của B. anthracis và băng IC. Trong đó, băng IC xuất hiện rõ nét, không bị smear và quan trọng hơn, băng đích capA cũng xuất hiện. Còn mức nồng độ IC là 104 và 103 copy không còn xuất hiện băng IC (Hình 3.20). Qua quá trình tối ưu trên các mẫu B. anthracis, Y. pestis, mPCR-IC cho các băng đích rõ nét, tách biệt gồm 6 băng cho xác định B. anthracis và Y. pestis và 1 băng IC. Có thể thấy rằng, mức nồng độ IC 5x104copy/ mẫu cho các băng rõ nét nhất và đây chính là nồng độ được lựa chọn sau khi tối ưu lại nồng độ của cặp mồi capAF1/R1 (0,64 µM), các thông số khác của mPCR đã tối ưu ban đầu cơ bản vẫn giữ nguyên (Hình 3.21). Như vậy, đã thiết kế thành công kỹ thuật mPCR-IC tại xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis. Chu trình nhiệt: Biến tính 94oC/4 phút, 32 chu kỳ (94oC/1 phút; 56oC/45 giây; 72oC/50 giây), 72oC/10 phút. Hình 3. 21. Kiểm tra mPCR tối ưu có bổ sung IC ở các nồng độ 105 và 5x104 copy M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1, 2. Mẫu Y. pestis; 3, 4. Mẫu B. anthracis và Y. pestis; 5, 6. Mẫu B. anthracis. 3.1.5. Chế tạo kit mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis Sau khi xây dựng được quy trình kỹ thuật mPCR, chúng tôi đã tiến hành chế tạo master mix theo thành phần tối ưu. Bước đầu đã chế tạo 1000 test, 50 test/bộ, bảo quản ở điều kiện -20oC cho đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện, độ ổn định của kit mPCR theo thời gian và thử nghiệm trên các chủng phân lập (Ký hiệu kit BaYp-mPCR) (Hình 3.22). Hình 3. 22. Master mix mPCR được đóng gói kèm hướng dẫn sử dụng 3.2. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP 3.2.1. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn xác định độ nhạy của kit mPCR Ngưỡng nồng độ DNA tối thiểu có thể phát hiện được bằng PCR là thông số cần khảo sát trước khi xây dựng bộ mẫu chuẩn độ nhạy. Mẫu gốc DNA được tách chiết, tinh sạch đạt nồng độ 120 ng/µl, từ mẫu này pha loãng trong nước khử ion. B50 B51 B52 B53 B54 B55 B56 B57 B58 B59 M ĐC(-) Hình 3. 23. Xác định ngưỡng phát hiện B. anthracis M. Marker 50 bp; B50-B59. các mức nồng độ DNA; ĐC(-). Đối chứng âm Mẫu có nồng độ DNA thấp nhất còn cho khả năng phát hiện được là B55 (mã số gốc PBA19) (Hình 3.23), nồng độ 0,000092 ng/µl tương đương 81,5 copy/ phản ứng mPCR sử dụng 5 µl DNA. Với kết quả xác định ngưỡng của mPCR phát hiện B. anthracis như trên, tiến hành thiết lập bộ mẫu chuẩn độ nhạy 100 ống (50 µl/ống), bao gồm: 10 hàng (ký hiệu EB1 đến EB10) x 10 cột. Sử dụng 10 mức nồng độ ở bộ mẫu chuẩn xác định ngưỡng mPCR phát hiện B. anthracis từ PBA10 (0,046875 ng/µl) - PBA19 (0,000092 ng/µl) tương ứng ký hiệu EB1 - EB10. Tương tự, ngưỡng phát hiện của bộ mẫu chuẩn Y. pestis là 130,5 copy/ phản ứng. Bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định Y. pestis cũng được thiết lập gồm 100 ống (50 µl/ống), bao gồm: 10 hàng (ký hiệu EY1 đến EY10) x 10 cột. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu chẩn đoán của kit mPCR Các bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu mPCR đối với B. anthracis được thiết lập tương tự với các bộ mẫu chuẩn độ nhạy, sử dụng chủng B. cereus. Tương tự, sử dụng chủng E. coli và Y. enterocolitica cho Y. pestis. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis Để thuận tiện cho việc đánh giá nội bộ, sau khi thiết lập bộ mẫu chuẩn độ nhạy và đặc hiệu xác định từng tác nhân, chúng tôi tiến hành phối trộn các bộ mẫu chuẩn riêng rẽ tương ứng để tạo các bộ mẫu chuẩn hỗn hợp đồng thời B. anthracis và Y. pestis. Đánh giá kit mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis trên bộ mẫu chuẩn Khả năng phát hiện B. anthracis của bộ kit mPCR được kiểm tra trên 100 mẫu (từ mẫu EB1 đến EB10, mỗi mẫu lặp lại 10 lần) của bộ mẫu chuẩn độ nhạy với B. anthracis cho kết quả là 100% các mẫu đều phát hiện đầy đủ các gen đặc trưng của B. anthracis. Tương tự cho đánh giá độ nhạy của bộ kit mPCR đối với Y. pestis, đồng thời B. anthracis và Y. pestis đều cho kết quả 100%. Chúng tôi tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của kit BaYp - mPCR trên 100 mẫu (từ C1 đến C10 mỗi mẫu lặp lại 10 lần) của bộ mẫu chuẩn độ đặc hiệu đã thiết lập từ B. cereus. Kết quả 100% các mẫu không xuất hiện gen đặc trưng capA, pagA của B. anthracis nhưng 100% các mẫu dương tính với gen vrrA. Với Y. pestis, độ đặc hiệu của bộ kit mPCR là 100%. Các thành phần của kit BaYp-mPCR có sự ổn định trên 12 tháng bảo quản ở điều kiện -20oC (Hình 3.32). Hình 3. 32. Kiểm tra độ ổn định mPCR sau thời gian 12 tháng M. Marker 100 bp; 1-10. Các mẫu DNA EBY2 3.2.2. Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các chủng phân lập Kỹ thuật mPCR với 6 cặp mồi xác định đồng thời gen đặc trưng, gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis đã được thiết kế và tối ưu thành công trên chủng chuẩn. Việc đánh giá khả năng phát hiện của kỹ thuật mPCR trên các bộ mẫu chuẩn là trong điều kiện lý tưởng -điều kiện tiên quyết cho bất kỳ bộ kit nào trước khi đưa ra thử nghiệm lâm sàng. Với các chủng lâm sàng B. anthracis cũng như Y. pestis, đặc biệt là các mẫu phân lập ngoài môi trường hay lưu trữ thời gian dài trong phòng thí nghiệm, một số tính chất về kiểu hình, kiểu gen có thể bị biến đổi. Do đó, để khẳng định việc thiết kế thành công kỹ thuật mPCR, các chủng phân lập B. anthracis và Y. pestis sau khi được kiểm tra, xác định bằng nuôi cấy, được xác định bằng kỹ thuật mPCR. Kết quả xác định của mPCR được khẳng định bằng phân tích trình tự toàn bộ chiều dài một số gen tiêu biểu trên nhiễm sắc thể, các plasmid độc lực. Xác định chủng phân lập bằng nuôi cấy, định danh Các chủng nghi ngờ B. anthracis và chủng chuẩn B. anthracis Ba (đối chứng dương) được nuôi cấy trên môi trường thạch máu cừu ở 37oC/CO2 5%/ 24 giờ. Kết quả, tất cả các chủng cho khuẩn lạc dạng R, màu xám, trực khuẩn Gram dương, hình vuông hai đầu, xếp đôi, chuỗi, bào tử ở giữa và không làm biến đổi hình dạng vi khuẩn, trong đó 11 chủng không tan máu β trên môi trường thạch máu cừu - có 4 chủng hình thành vỏ (B. anthracis Ba, Ba1, Ba3, Ba4). 13 chủng còn lại tan máu β. Định danh cho 11 chủng là B. anthracis, còn lại là B. cereus (ID > 90%). Chủng Y. pestis Yp1, Yp2 cho kết quả mọc các khuẩn lạc kích thước 1 - 2 mm dạng S, màu xám đục, bờ đều, bề mặt nhẵn, trung tâm lồi giống hình trứng oplet và không tan máu, là trực khuẩn Gram âm nhỏ, oxydase (-). Định danh là Y. pestis với ID Yp1, Yp2 lần lượt là 98,6 và 96,4%. Thử nghiệm kỹ thuật mPCR Kỹ thuật mPCR được thử nghiệm trên các mẫu nghiên cứu B. anthracis, Y. pestis và các mẫu đối chứng âm là B. cereus, E. coli. Mẫu hỗn hợp được tạo ra bằng cách trộn lẫn chủng B. anthracis và Y. pestis sau đó tiến hành tách DNA tổng số. Ở tất cả các mẫu đối chứng và mẫu thử nghiệm đều xuất hiện băng chứng nội tại IC, điều này chứng tỏ quá trình tách chiết DNA và mPCR đảm bảo, theo đó các kết quả xác định là đáng tin cậy (minh họa ở Hình 3.36). Mẫu đối chứng âm chỉ xuất hiện băng có kích thước khoảng 220 bp - tương ứng với gen vrrA, ngoài ra không xuất hiện thêm băng nào khác. Điều này là phù hợp, vì đối chứng âm sử dụng chủng B. cereus, gen vrrA có mặt trong các loài nhóm “B. cereus”. Còn mẫu đối chứng dương xuất hiện cả 6 gen đích đối với cả 2 tác nhân (Hình 3.36a), hoặc xuất hiện 3 gen đích đối với từng tác nhân (Hình 3.36b). (+) (-) M Ba3 Ec (+) (-) M BY2 Yp1 Yp2 Ba4 M Ba5 Ba6 a) b) M. Marker 100 bp (Thermo Scientific); a) (+). Đối chứng dương là hỗn hợp B. anthracis và Y. pestis; (-). Đối chứng âm là hỗn hợp B. cereus và E. coli; BY2. Mẫu thử nghiệm hỗn hợp B. anthracis Ba4 và Y. pestis Yp2; Yp1. Y. pestis Yp1; Yp2. Y. pestis Yp2; Ba4. B. anthracis Ba4; Ba5. B. anthracis Ba5; Ba6. B. anthracis Ba6; b) (+). Đối chứng dương là mẫu B. anthracis Ba; (-). Đối chứng âm B. cereus; Ba3. B. anthracis Ba3; Ec. E. coli Hình 3. 36. Xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis bằng kỹ thuật mPCR tối ưu chứa chứng nội tại IC Kết quả thử nghiệm kỹ thuật mPCR cho thấy, khi chỉ xuất hiện 1 băng có kích thước tương ứng với gen đích vrrA (mẫu Ba5 Hình 3.36a) hay không xuất hiện băng đích nào (mẫu Ec Hình 3.36b), được xác định là mẫu âm tính với B. anthracis và Y. pestis gây bệnh (tương ứng là mẫu B. anthracis Ba5 và E. coli). Cụ thể, kết quả Hình 3.36a, đường chạy ký hiệu BY2 xuất hiện đầy đủ 6 băng đích có kích thước đúng với mẫu đối chứng dương, được xác định là mẫu dương tính đồng thời với B. anthracis và Y. pestis có đầy đủ độc lực. Mẫu ký hiệu Yp1, Yp2, Ba4 (Hình 3.36a) và mẫu Ba3 (Hình 3.36b) xuất hiện đầy đủ 3 băng của các gen đích cho từng đối tượng, được xác định lần lượt là chủng Y. pestis và B. anthracis gây bệnh. Trong khi đó, đáng chú ý trên Hình 3.36a, mẫu Ba6 chỉ xuất hiện 2 băng có kích thước tương ứng với 2 gen đích là pagA và vrrA, không xuất hiện băng chỉ thị gen capA. Đây là mẫu B. anthracis bị thiếu plasmid pXO2, không đầy đủ độc lực (chủng B. anthracis Ba6). Như vậy, trong 10 chủng phân lập B. anthracis, bằng kỹ thuật mPCR đã xác định được 3 chủng B. anthracis đầy đủ độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4), 1 chủng giảm độc do thiếu gen capA thuộc plasmid pXO2 (chủng B. anthracis Ba6), 6 chủng còn lại là B. anthracis không độc. Đồng thời với Y. pestis, kỹ thuật mPCR đã xác định được 2/2 chủng Y. pestis có đầy đủ gen độc lực. Để khẳng định kết quả, băng điện di đặc hiệu cho các gen đích chẩn đoán được tinh sạch gel và giải trình tự. Kết quả, tất cả các trình tự đều thuộc các gen đích tương ứng của B. anthracis và Y. pestis. Như vậy, kỹ thuật mPCR đã được thử nghiệm thành công trên chủng chuẩn và chủng phân lập. Phân tích trình tự gen đặc trưng và gen độc lực của B. anthracis và Y. pestis Kỹ thuật mPCR được phát triển ở trên chứa 6 cặp mồi xác định các đoạn ngắn trình tự bảo thủ của gen đích tương ứng. Tuy nhiên, mỗi gen đích có chiều dài khác nhau và phân bố ở các vị trí khác nhau. Cụ thể, với B. anthracis, gen đặc trưng vrrA thuộc nhiễm sắc thể, gen độc lực pagA, capA thuộc plasmid pXO1, pXO2. Với Y. pestis, gen đặc trưng ypo2088 thuộc nhiễm sắc thể, gen độc lực pla, caf1 thuộc plasmid pPCP1, pMT1. Để đánh giá kỹ thuật mPCR được phát triển, đồng thời nghiên cứu trình tự các gen đặc trưng và gen độc ở các chủng phân lập được ở Việt Nam có sự giống và khác nhau như thế nào với các chủng quốc tế, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự toàn bộ chiều dài gen độc lực và gen đặc trưng của B. anthracis và Y. pestis. Phân lập toàn bộ chiều dài gen đặc trưng và gen độc lực Đối với B. anthracis, 7 gen vrrA, pagA, cya, lef, capA, capB, capC đã được nhân dòng cho xác định toàn bộ trình tự. Các gen này đã khuếch đại thành công, sản phẩm PCR có kích thước lần lượt là 551, 2323, 2544, 2580, 1325, 1439 và 561 bp đúng với lý thuyết. Đối với Y. pestis, gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể là ypo2088 và 2 gen trên plasmid pPCP1 và pMT1 tương ứng là pla và caf1 cho sản phẩm kích thước là 645, 1019 và 654 bp. Nghiên cứu tạo dòng toàn bộ chiều dài gen đặc trưng và gen độc lực a) b) Sản phẩm khuếch đại các gen đích được tinh sạch và tạo dòng trong vector pJET1.2/blunt. Chúng tôi lựa chọn một số enzyme giới hạn để cắt kiểm tra các dòng plasmid tái tổ hợp, BglII được sử dụng trong tất cả các trường hợp bởi nằm trên vùng đa điểm cắt. Ngoài ra, trong một số trường hợp, chúng tôi sử dụng thêm một số enzyme khác có trình tự nhận biết ở trên vector và trong trình tự gen đích. Quá trình cắt kiểm tra bằng các enzyme giới hạn được minh họa với vector tái tổ hợp pJET1.2-pagA (Hình 3.39). Hình 3. 39. Tạo dòng gen pagA trong vector pJET1.2/blunt a) Sơ đồ biểu hiện quá trình cắt kiểm tra vector pJET1.2-pagA bằng BglII; b) Cắt kiểm tra vector pJET1.2-pagA trên gel agarose 1,2%. Sử dụng enzyme giới hạn BglII, cặp enzyme XbaI và EcoRI, chúng tôi đã chọn được các dòng tế bào mang plasmid chứa gen pagA cho sản phẩm kích thước khoảng 4,0 và 1,2 kb (cắt bằng XbaI và EcoRI) và khoảng 2,8; 2,4 kb đối với BglII. Như vậy, các gen đích đã được tách dòng thành công. Phân tích trình tự các gen đích đặc trưng và gen độc lực Phân tích trình tự gen vrrA trên 10 chủng B. anthracis phân lập cho thấy, gen vrrA giống nhau hoàn toàn, độ tương đồng từ 99-100% so với chủng tham chiếu. Phân tích trình tự gen pagA của 3 chủng B. anthracis độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4) xác định được 3 đột biến điểm (T®C), trong đó 1 đột biến đồng nghĩa (T®C)195, 2 đột biến sai nghĩa là (T®C)1693 và (T®C)1799 khi so sánh với chủng B. anthracis Vollum-USA. Nghiên cứu trình tự gen cya và lef (pXO1), chỉ xác định được 1 đột biến đồng nghĩa (T®C)600 trên gen cya chủng B. anthracis Ba3 và Ba4, còn gen lef có mức độ tương đồng 100% so với chủng tham chiếu. Một đột biến sai nghĩa hoàn toàn mới (A®G)1048 ở gen capA chủng B. anthracis Ba1 làm thay đổi axit amin lysine thành glutamic (Hình 3.43). Hai gen còn lại là capB, capC có tính bảo tồn cao, không xảy ra đột biến ở bất cứ điểm nào. Các gen này đã được đăng ký trên Genbank với mã số: KP213102-7; KP759885-93. Hình 3. 43. So sánh trình tự axit amin của protein được mã hóa bởi gen capA 3 chủng B. anthracis Ba1, Ba3 và Ba4 với 12 chủng tham chiếu Với Y. pestis, gen ypo2088 và caf1 của 2 chủng Y. pestis Yp1, Yp2 có mức độ tương đồng 100% so với chủng tham chiếu. Chỉ có 1 đột biến điểm được xác định ở gen pla (T®C)836 khi so sánh với chủng Y. pestis Angola. Trình tự phân tích các gen được đăng ký trên Genbank với mã số KM880025-7. Như vậy, kỹ thuật mPCR được thiết kế xác định đồng thời B. anthracis, Y. pestis và thử nghiệm dựa trên các chủng phân lập trong nước hoàn toàn có thể chẩn đoán cho các chủng từ các khu vực khác trên thế giới. 3.2.3. Kiểm định bộ kit BaYp-mPCR chẩn đoán B. anthracis và Y. pestis Kỹ thuật mPCR xác định nhanh, đồng thời B. anthracis và Y. pestis được phát triển thành kit BaYp-mPCR, kiểm định tại Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm, Bộ Y tế cho kết quả đạt tiêu chuẩn cơ sở, độ nhạy, độ đặc hiệu 100% trên panel mẫu chuẩn. Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1. THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B. anthracis VÀ Y. pestis Kỹ thuật mPCR cho phép tiết kiệm thời gian, kinh phí và đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán phân tử. Thực tế, việc nghiên cứu thiết kế mPCR tối ưu đòi hỏi nhiều công đoạn hơn so với PCR thông thường. Các thành phần tham gia trong phản ứng cũng như chu trình nhiệt cần được đánh giá, tối ưu. Đồng thời, việc nghiên cứu, thiết kế mồi trong mPCR có vai trò rất quan trọng. Đối với 2 tác nhân B. anthracis và Y. pestis, cần chỉ ra được chủng gây bệnh (có đầy đủ độc lực) hay không. Với B. anthracis, gen pagA (pXO1) được WHO khuyến cáo sử dụng bởi khi chủng B. anthracis thiếu gen này sẽ không thể gây độc. Ngoài ra, gen capA (pXO2) được lựa chọn nhiều trong chẩn đoán (Skottman, 2007; Kurosaki, 2009). Một gen đích nữa được sử dụng để phát hiện tất cả các chủng vi khuẩn than là vrrA nằm trên nhiễm sắc thể - có tính ổn định cao và bền vững. Trong xác định Y. pestis, pla, caf1, ypo2088 là các gen đích thường được sử dụng, cho phép chẩn đoán chính xác Y. pestis. Như vậy, cần thiết kế 6 cặp mồi trong mPCR cho xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis. Khi thực hiện mPCR với nhiều cặp mồi, xác suất tạo sản phẩm không đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa các mồi tăng lên. Do đó, sau khi nghiên cứu thiết kế mồi, tối ưu mPCR là điều kiện tiên quyết để hạn chế tối đa những tương tác lẫn nhau giữa các cặp mồi cũng như việc tạo thành các sản phẩm phụ. Cho đến trước nghiên cứu này, có rất ít công trình phát triển kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B. anthracis và Y. pestis cũng như các tác nhân truyền nhiễm khác có kết hợp các cặp mồi chẩn đoán xác định cả gen đặc trưng trên nhiễm sắc thể và gen độc lực trên plasmid cùng chứng nội tại để xác minh kết quả. Hầu hết các công trình chỉ lựa chọn một trong các gen đích độc lực trên pla