Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng và hợp chất có hoạt tính sinh học từ một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ - Hoàng Văn Trung

2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lượng (ESI-MS), (HR- ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C- 5 NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tương của các hợp chất này được xác định các phương pháp phổ NMR. 2.1.4. Phuơng pháp thử hoạt tính sinh học Quá trình thử hoạt tính ở Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên được thực hiện theo phương pháp Skehan, Likhitwitayawuid, Vander, Vlietlinck, McKane. 2.2. Hóa chất và thiết bị 2.2.1. Hoá chất: Các dung môi để ngâm chiết mẫu nấm đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). 2.2.2. Thiết bị: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột (CC); sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC); phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (FT-IR); phổ khối lượng (MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR); điểm nóng chảy; độ quay cực riêng 2.3. Nghiên cứu thành phần các chất dinh dưỡng có trong các loài nấm lớn vùng Bắc Trung Bộ. 2.3.1. Xác định thành phần khoáng và các nguyên tố vi lượng. 2.3.1.1. Xử lý mẫu phân tích. Các mẫu xác định hàm lượng khoáng, nguyên tố vi lượng được tiến hành theo quy trình AOAC. 2.3.1.2. Điều kiện đo để định lượng khoáng và các nguyên tố vi lượng Chúng tôi lựa chọn các điều kiện và thông số máy đo ICP-MS Agilent 7500 để xác định Ge. Selen được xác định bằng phương pháp AAS sử dụng kỹ thuật nguyên tử hóa bằng hơi hiđrua (HG-AAS). Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa (F-AAS) 2.3.2. Xác định hàm lượng acid amin 2.3.2.1. Chuẩn bị và xử lí mẫu phân tích acid amin Mẫu nấm xay nhỏ và được bảo quản trong điều kiện thích hợp. Quy trình xử lý mẫu và phân tích theo Agilent. 2.3.2.2. Tiến hành phân tích trên máy HPLC − Cột sắc ký: cột C18 150  4,6mm, kích thước hạt 5μm. − Nhiệt độ cột: 400C. − Tốc độ dòng: 0,45ml/phút. − Pha động: Pha động A: Cân 1,36 0,025 g NaCH3COO.3H2O + 500 ml H2O + 90µl triethylamine (TEA). Điều chỉnh pH về pH = 7,2 0,05 bằng acid acetic 2%. Thêm 1,5 ml tetrahydrofuran (THF). Pha động B: Cân 1,36 0,025 g NaCH3COO.3H2O + 100 ml H2O. Điều chỉnh pH về pH = 7,2 0,05 bằng acid acetic 2%. Thêm hỗn hợp gồm 200 ml acetonitrin và 200 ml methanol. Detector: huỳnh quang (FLD) từ bước sóng λEx= 340, λEm= 455 nm 2.3.3. Xác định hàm lượng các vitamin A và E     6 2.3.3.1. Chuẩn bị và xử lí mẫu phân tích vitamin A và vitamin E Quy trình xử lý mẫu xác định vitamin A và vitamin E được thực hiện theo AOAC. 2.3.3.2. Tiến hành phân tích vitamin A trên máy HPLC - Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18 - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. - Pha động: 100% ACN - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng - Detector: UV bước sóng λ =325 nm. 2.3.3.3. Tiến hành phân tích vitamin E trên máy HPLC - Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18 - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. - Pha động: 1,4 dioxan: n-hexan 1,2 : 98,8 - Nhiệt độ cột: 300C - Detector: Đo huỳnh quang (FLD) bước sóng λEx= 292nm, λEm= 330 nm 2.4. Xác định hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide 2.4.1. Chất chuẩn Các chất chuẩn ergosterol và ergosterol peroxide được phân lập từ loài Ganoderma lucidum. Cấu trúc của các chất này được xác định bằng các phổ 1H-, 13C-NMR, HSQC, HMBC, MS, UV và IR. 2.4.2. Chiết các sterol Phương pháp thử nghiệm được thực hiện theo quy trình được mô tả bởi Villares et al. với một số thay đổi nhỏ. Bột nấm khô (~ 2 g; độ ẩm 24%) được chiết với 20 mL hỗn hợp MeOH / MeCN (85:15, v / v) bằng cách khuấy trong bể siêu âm ở 4°C trong 30 phút. Sau đó, hỗn hợp được ly tâm ở tốc độ 3500 vòng / phút trong 10 phút. Phần còn lại được chiết hai lần, và các chất chiết được gộp lại. Các mẫu được lưu trữ (4°C trong bóng tối) cho đến khi phân tích HPLC. Trước khi phân tích HPLC, các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 μm. 2.4.3. Phân tích bằng sắc ký (HPLC) 2.4.3.1. Tiến hành phân tích ergosterol - Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18 - Dung dịch pha động MeOH : ACN (85 : 15 v/v ) - Nhiệt độ cột : 300C - Detector: UV bước sóng λ = 290 nm - Tốc độ dòng : 1,0 ml/phút 2.4.3.2. Tiến hành phân tích ergosterol peroxide - Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18 - Pha động: Me0H 100% - Nhiệt độ cột: 35cC - Detector: UV bước sóng λ = 290 nm - Tốc độ dòng: 1ml/ phút 7 2.5. Nghiên cứu các hợp chất từ loài nấm than (D. concentrica) 2.5.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được Quả thể nấm than (D. concentrica) (8,6 kg) được phơi khô, nghiền nhỏ, ngâm chiết 3 lần bằng dung môi methanol (10L x 3) ở nhiệt độ phòng, thu được dịch chiết được cất giảm áp suất bằng thiết bị quay cất chân không thu được cao methanol (180g). Cao methanol được hòa tan trong nước và chiết phân bố với dung môi ethylacetate, chưng cất chân không thu được hai phần: cao ethylacetate (105g) và dịch chiết nước. Cao ethylacetate được tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexane- acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 7:1; 5:1) và hệ dung môi CHCl3:CH3OH (100:0; 6:1; 3:1; 2:1; 1:1) thu được 7 phân đoạn chính (kí hiệu từ F1 đến F7) (sơ đồ 2.1). Phân đoạn F1 (8,6 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 5 cm) rửa giải bằng hệ dung môi hexane:acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 4:1), mỗi hệ dung môi sử dụng 250 ml, thu được 7 phân đoạn (kí hiệu từ F1.1 đến F1.7). Phân đoạn F1.4 (1,0 g) đã được sắc ký trên cột silica gel (200 gam, 60 x 5 cm) với hệ dung môi rửa giải hexane:acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 4:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 250 ml) thu được hợp chất DCM7 (153 mg). Phân đoạn F1.6 (0,3g) được tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải hexane:acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 4:1) thu được hợp chất DCM3 (5mg). Phân đoạn F1.7 (0,5 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP-18 (100 gam, 60x3cm) với hệ dung môi giải hấp CH3OH:H2O thu được DCM1 (134 mg). Phân đoạn F2 (2,3 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel (200 gam, 60x3 cm) với hệ dung môi rủa giải hexane:acetone (9:1 ; 6:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu được sáu phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F2.1 đến F2.6). Phân đoạn F2.6 (0,5 g) được tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 (50 gam, 60x3cm) được giải hấp với hệ dung môi CH3OH:H2O thu được hợp chất DCM6 (41 mg). Phân đoạn F3 (2,7 g) được sắc ký cột silica gel (200 gam, 60×3,2 cm) được rửa giải bằng hệ dung môi hexane:acetone (9:1; 6:1; 4:1; 1:1, mỗi hệ dung sử dụng 250ml) để thu được bốn phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F3.1 đến F3.4). Phân đoạn F3.2 (0,5 g) tiếp tục được sắc ký cột pha đảo RP -18 (100 gam, 60 x 3 cm) giải hấp bằng hệ dung môi CH3OH:H2O thu được hợp chất DCM2 (31 mg). Phân đoạn F4 (4,7 g) được phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 5cm) được rửa giải với hệ dung môi CHCl3:CH3OH (20:1; 10:1; 6:1; 4:1; 2:1, mỗi hệ sử dụng 200 ml) thu được 5 phân đoạn (ký hiệu từ F4.1 đến F4.5). Phân đoạn F4.1 tiếp tục được sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 3 cm) rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (19:1; 16:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu được hợp chất DCM4 (10 mg) và hợp chất DCM8 (21 mg). Phân đoạn F5 (1,5 g) được phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 3cm) được rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (9:1; 6:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu được hợp chất DCM9 (43 mg). 8 Phân đoạn F6 (1,2 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60x3 cm) rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (9:1; 6:1, mỗi hệ sử dụng 200 ml) thu được hợp chất DCM6 (13 mg). Sơ đồ 2.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm linh chi (D. concentrica) 2.5.2. Các dữ liệu vật lý 2.5.2.1. Hợp chất DCM1 Tinh thể không màu (CHCl3), đ.n.c.216-217 °C; HR-ESI-MS m/z 546.2834 [M+Na]+ (C31H41O6NNa, cal. m/z 546.2832); 1H-NMR (700MHz, Pyridine-d5) Bảng 3.14 2.5.2.2. Hợp chất DCM 2 Tinh thể không màu, (CHCl3), đ.n.c.216-217°C; HR-ESI-MS m/z 467.2669 [M]+ (C28H37O5N, cal. m/z 467.2672); bảng 3.15. 2.5.2.3. Hợp chất DCM 3 Tinh thể không màu,(CHCl3), đ.n.c.120-121°C; HR-ESI-MS m/z 451.2717 [M]+ (C28H37O4N, cal.m/z 451.2712); 2.5.2.4. Hợp chất DCM4 Tinh thể hình kim không màu, đ.n.c.182-184oC; EI-MS m/z (%): 220 (M+, C12H12O4); 1H-NMR (500MHz, CDCl3) (ppm): 6,20 (1H, s, H-3), 2,40 (3H, s, 2- 9 CH3), 2,22 (3H, s, 6-CH3), 2,13 (3H, s, 8-CH3); 13C-NMR (125MHz, CDCl3) (ppm). Bảng 3.16. 2.5.2.5. Hợp chất DCM5 Tinh thể hình kim không màu, đ.n.c.227-229oC; EI-MS m/z (%): 206 (M+, C11H10O4); 1H-NMR (500MHz, CDCl3) (ppm): 6,38 (1H, s, H-8), 6,00 (1H, s, H-3), 2,34 (3H, s, 2-CH3), 2,09 (3H, s, 6-CH3); 13C-NMR (125MHz, CDCl3) (ppm). 2.5.2.6. Hợp chất DCM6 Chất bột màu nâu nhạt, đ.n.c. 310-3110C ; 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) ( ppm): 10,98 (1H, br s), 10,81 (1H, br s), 7,37 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-6), 5,44 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5). 2.5.2.7. Hợp chất DCM7 Chất bột không màu, đ.n.c. 166-1680C; 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) ( ppm): 4,40 (2H, d, J = 5,0 Hz, 2,5-OH), 4,31 (2H, t, J = 5,5 Hz, 1,6-OH), 4,12 (2H, d, J = 7,0 Hz, 3,5-OH), 3,61 (2H, m, H-1b, -6b), 3,53 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-3,-4), 3,45 (1H, m, H-2,-5), 3,37 (2H, dd, J = 6,0, 11,5 Hz, H-1a, -6a); 2.5.2.8. Hợp chất Ergosterol DCM8 Chất bột màu trắng; đ.n.c: 165-1670C; Phổ UV (MeOH) max nm: 211, 285; IR (KBr) max (cm-1): 3433, 2959, 1726, 1090; EI-MS m/z 396 [M]+; Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3) ( ppm); Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3) ( ppm): bảng 3.17 2.5.2.9. Hợp chất Ergosterol peroxide DCM9 Bột màu trắng (CHCl3); đ.n.c: 172-174°C ; [α]D25 -14.4 (c = 0.08, CHCl3); EI-MS (rel. int.): m/z 396 ([M]+, 100); IR (KBr) νmax: 3417, 2954, 1458 cm-1; 1H- NMR (400 MHz, CDCl3) (δ ppm); bảng 3.18 2.6. Nghiên cứu các hợp chất từ nấm cổ linh chi (Ganoderma applanatum) 2.6.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất Quả thể nấm linh chi (G. applanatum) (3,0 kg) được phơi khô, nghiền nhỏ, ngâm chiết 3 lần bằng dung môi methanol (10Lx3) ở nhiệt độ phòng, sau đó lọc và dịch lọc được cất giảm áp suất bằng thiết bị quay cất chân không thu được cao methanol (128,0g). Sau đó cao thô được hòa tan trong nước và chiết phân bố với dung môi, chưng cất chân không thu được: ethyl acetate (32g), butanol (33g) và dịch chiết nước (55g). Cao chiết ethyl acetate được tiến hành trên sắc ký cột silica gel rửa giải gradient với hệ dung môi hexane và acetone tăng dần độ phân cực (từ 100:0 đến 2:1) thu được các phân đoạn nhỏ, sử dụng TLC gộp được 10 phân đoạn (Frs. G1- G10). Tinh chế phân đoạn G1 (1.2g) bằng sắc ký cột silica gel rửa giải với hexane và acetone (15:1) thu được hợp chất 1 (123 mg). Phân đoạn G3 (2.6g) cũng được tiến hành trên silica gel với hệ dung môi hexane và ethyl acetate (15:1) thu được chất 4 (38 mg). Phân đoạn G4 (2,5g) đã được sắc ký cột silica gel rửa giải với hỗn hợp hexane và acetone (9: 1) thu được hợp chất 2 (10 mg) và 3 (31 mg). G6 (2,9g) đã được sắc ký cột silica gel giải hấp với cloroform và hỗn hợp dung môi methanol (10: 1) và tiếp tục kết tinh lại để thu được hợp chất 5 (30 mg). 10 Sơ đồ 2.2. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm linh chi (G. applanatum) 2.6.2. Các dữ kiện vật lý và phổ 2.6.2.1. Ergosterol (GAM1) Hợp chất GAM1 có cấu trúc giống với hợp chất DCM8 số liệu phổ và biện luận cấu trúc như trình bày ở mục 2.5.2.8 đã chứng minh được đây là ergosterol. 2.6.2.2 Ergosterol peroxide (GAM2) Hợp chất GAM2 có cấu trúc giống với hợp chất DCM9 số liệu phổ và biện luận cấu trúc như trình bày ở mục 2.5.2.9 đã chứng minh được đây là ergosterol peroxide . 2.6.2.3 Ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3) Tinh thể không màu; (CHCl3); [α]D20 -5 (c = 0.85, CHCl3); đ.n.c.185.5-187°C ; EI-MS (rel. int.): m/z 398([M]+, 4), 217(8), 255(9), 107(15), 69(24), 43(100); IR (KBr) νmax: 3341, 2951, 2928, 2870, 1663, 1458, 1377, 1044, 970 cm-1 ; 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) (δ ppm), 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) (δ ppm) 2.6.2.4. Lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4) Tinh thể không màu; đ.n.c. 171-1720C. EI-MS m/z 440 [M]+; EI-MS m/z 412 [M-H2O]+ (13), 397(6), 394(19), 383(10), 379(21), 376(15), 269(15), 251(57), 69(100); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (δ ppm),13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (δ ppm). bảng 3.22 2.6.2.5. Acid 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic (GAM5) Tinh thể hình kim; đ.n.c 243-244oC; ESI-MS m/z 453 [M-H]- ; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (δ ppm): 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (δ ppm). Bảng 3.23. 2.7. Phương pháp thử hoạt tính Thử hoạt tính sinh học gây độc tế bào với SW480: Ung thư đại tràng ở người (human colon adenocarcinoma), SK-LU-1: ung thư phổi ở người (human lung carcinoma); Hep3B: ung thư tế bào gan ở người (human hepatocellular 11 carcinoma); HepG2: Ung thư tế bào gan ở người (human hepatocellular carcinoma); MCF7: Ung thư vú ở người (human breast carcinoma). CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác định hàm lượng các chất dinh dưỡng của một số loài nấm 3.1.1. Thành phần khoáng và các nguyên tố vi lượng 3.1.1.1. Xây dựng đường chuẩn Để định lượng các thành phần khoáng và các nguyên tố vi lượng, chúng tôi đã sử dụng phương pháp ICP – MS để đo Ge, phương pháp AAS-HG để đo Se, phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa (F-AAS) để đo Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn. Các thông số của máy ICP – MS, AAS thể hiện trong bảng 2.2 và 2.3. Các phương trình đường chuẩn thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa tín hiệu đo với nồng độ các ion kim loại đã được xây dựng. Kết quả thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Phương trình đường chuẩn Chất chuẩn Phương trình hồi quy R2 Ge (ppb) Y = 3,685.103X + 1,719.103 1,00 Na (ppm) Y = 1,15002X + 0,1600 0,99943 K (ppm) Y = 0,60203X + 0,0085 1,00 Ca (ppm) Y = 0,5192X + 0,0129 0,9998 Mg (ppm) Y = 0,22055X + 0,00048 0,9998 Se (ppb) Y = 0,0085X - 0,0018 0,9996 Fe (ppm) Y = 0,0669X + 0,0086 0,9978 Cu (ppm) Y = 0,1079X + 0,0031 0,9999 Zn (ppm) Y = 0,4624X + 0,0005 0,9996 3.1.1.2. Kết quả xác định hàm lượng Ge, Na, K, Ca, Mg trong các mẫu nấm lớn Sử dụng quy trình chuẩn bị mẫu như mục 2.3.1.1, các điều kiện ghi đo thể hiện trong bảng 2.2, bảng 2.3 và đường chuẩn xây dựng được trong mục 3.1.1.1, chúng tôi tiến hành định lượng các nguyên tố nghiên cứu trong 08 mẫu nấm lớn. Kết quả phân tích và tính toán được thể hiện trong bảng 3.2, bảng 3.3 Bảng 3.2. Kết quả xác định hàm lượng Ge, Na, K, Ca, Mg trong 08 mẫu nấm ST T Mẫu nấm (kí hiệu) Hàm lượng Ge (µg/g) ICP-MS Hàm lượng Na, K, Ca, Mg (µg/g) theo phương pháp AAS Na K Ca Mg 1 Mush 01 0,020 36,892 1324,173 354,284 382,762 2 Mush 02 0,031 41,225 162,142 317,375 128,559 3 Mush 03 0,070 32,644 2932,645 436,423 352,374 4 Mush 04 0,077 29,156 1452,548 400,111 260,836 5 Mush 05 0,074 39,726 101,879 2226,421 790,324 6 Mush 06 0,048 21,721 18,371 341,513 386,358 7 Mush 07 0,029 16,894 572,571 1246,247 347,515 8 Mush 08 0,035 45,265 128,783 634,675 1372,692 12 Bảng 3.3. Kết quả xác định Se, Fe, Cu, Zn trong trong 08 mẫu nấm lớn ST T Mẫu nấm (kí hiệu) Hàm lượng Se, Fe, Cu, Zn (µg/g) theo phương pháp AAS Se Fe Cu Zn 1 Mush 01 0,885 12,916 18,221 18,702 2 Mush 02 1,014 79,173 69,657 49,126 3 Mush 03 0,187 106,847 24,502 46,246 4 Mush 04 3,982 18,341 28,516 61,237 5 Mush 05 0,348 148,447 2,983 17,701 6 Mush 06 1,025 14,423 4,604 20,863 7 Mush 07 0,716 249,962 16,102 45,572 8 Mush 08 0,883 84,576 23,254 37,016 3.1.2. Hàm lượng các acid amin trong các mẫu nấm 3.1.2.1. Xây dựng đường chuẩn Để tiến hành xây dựng đường chuẩn chúng tôi chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn của acid amin nồng độ: 10pmol, 25pmol, 100pmol. Kết quả đo trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) như bảng 3.4. Bảng 3.4. Phương trình đường chuẩn xác định acic amin TT Axit amin Phương trình đường chuẩn ( Y = aX +b) Hệ số tương quan (R2) 1 Aspatic Y = 50,892x + 268,560 0,9991 2 Glutamic Y = 0,760x + 5,416 0,9990 3 Serin Y = 0,869x – 0,972 1 4 Histidin Y = 0,575x + 0,115 1 5 Glycin Y = 0,872x - 5,387 0,9992 6 Threonin Y = 0,845x – 1,787 1 7 Alanin Y = 0,884x – 0,590 1 8 Arginin Y = 0,882x + 4,068 1 9 Tyrosin Y = 0,825x + 2,598 0,9997 10 Cys-ss-cys Y = 1,036x – 3,803 0,9990 11 Valin Y = 0,946x – 5,502 1 12 Methionin Y = 0,947x – 5,071 1 13 Phenillalanin Y = 0,844x – 1,449 1 14 Isoleucin Y = 0,913x – 3,033 1 15 Leucin Y = 0,911x – 0,4 1 16 Lysin Y = 1,614x – 7,681 1 17 Prolin Y = 0,547x – 0,774 0.9995 3.1.2.2. Kết quả hàm lượng các acid amin thủy phân trong các mẫu nấm Sau khi tìm được các điều kiện tối ưu cho quá trình xử lý mẫu phân tích acid amin trong mẫu nấm. Đánh giá thống kê quy trình phân tích acid amin đều đạt trong giới hạn cho phép, chúng tôi tiến hành áp dụng phân tích mẫu thực tế gồm 8 mẫu nấm: Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02), 13 Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) và Trametes gibbosa (Mush 08). Mẫu nghiên cứu gồm 08 loại nấm được xử lý theo mục 2.3.2.1. Quy trình phân tích thể hiện ở mục 2.3.2.2. Kết quả phân tích cụ thể hàm lượng các acid amin trong 1,00g mẫu nấm được chỉ ra ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Hàm lượng acid amin thủy phân trong nấm nghiên cứu (μg/g) TT Acid amin Mẫu nấm (ký hiệu) Mush 01 Mush 02 Mush 03 Mush 04 Mush 05 Mush 06 Mush 07 Mush 08 1 Threonin 123,53 50,34 40,47 110,32 323,15 34,64 51,11 156,98 2 Valin KPH 54,83 42,47 139,15 249,20 24,18 55,30 200,35 3 Methionin 119,84 13,37 8,74 64,41 110,9 KPH 12,75 156,95 4 Isoleucin 103,84 KPH 24,43 3,41 381,90 KPH KPH 39,19 5 Leucin 253,34 74,47 47,00 187,35 320,65 40,17 74,98 315,36 6 Phenyllal anin 272,43 96,66 6,39 346,02 KPH 43,50 98,65 630,49 7 Lysin 324,95 57,00 64,18 253,32 276,10 22,30 70,21 602,31 8 Histidin KPH 19,98 235,13 35,00 4,35 KPH 19,28 51,20 Tổng axit amin thiết yếu (EAA) 1197,93 468,81 366,65 1138,98 1666,25 164,79 382,28 2152,83 9 Aspatic 276,29 112,09 69,14 274,20 KPH 46,99 119,15 298,33 10 Glutamic 398,70 209,81 96,26 533,97 766,75 56,30 213,08 450,94 11 Serin 114,63 55,99 54,52 113,49 203,90 27,88 58,54 126,18 12 Glycin 213,56 63,03 KPH 181,36 27,30 57,47 80,23 235,11 13 Cys – ss – Cys 296,19 75,88 96,17 271,74 276,20 72,64 88,48 637,38 14 Alanin 226,89 116,26 64,54 226,73 290,80 118,08 65,22 248,67 15 Arginin 190,09 86,078 69,55 212,58 368,50 26,65 98,89 271,10 16 Tyrosin 116,61 27,69 24,56 87,81 115,75 8,43 25,35 222,21 17 Prolin 146,42 134,10 513,78 135,20 378,60 88,28 117,79 163,55 Tổng acid amin không thiết yếu(NEAA) 1979,38 988,52 881,26 2037,08 2427,8 502,72 866,73 2653,47 Tổng (TAA) 3177,31 1457,33 1247,91 3176,06 4094,05 667,51 1249,01 4806,30 %(EAA/TAA) 37,70% 32,17% 29,38% 35,86% 40,70% 24,69% 30,61% 44,79% Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, trong 08 loại nấm thì nấm Mush 08 có tổng hàm lượng các acid amin cao nhất (4806,30 μg/g), sau đó là nấm Mush 05 (4094,05 μg/g) thấp nhất là Mush 06 (667,51 μg/g). Hiệu suất thu hồi phản ánh độ đúng của các kết quả định lượng. Hiệu suất thu hồi được xác định bằng thực nghiệm, khi sử dụng mẫu thêm chuẩn, tiến hành phân tích như mẫu thật. 14 Bảng 3.6. Hiệu suất thu hồi của acid amin trong nấm cổ linh chi (G. applanatum) TT Acid amin Cso+mẫu (ppm) Cmẫu (ppm) Cso (ppm) H (%) 1 Asp KPH KPH 1,33 - 2 Glu 16,593 15,335 1,47 85,60 3 Ser 5,048 4,078 1,05 92,38 4 His 1,435 0,087 1,55 86,97 5 Gly 1,224 0,546 0,75 90,40 6 Thr 7,648 6,463 1,19 99,58 7 Ala 6,699 5,816 0,89 99,21 8 Arg 9,157 7,370 1,74 102,70 9 Tyr 4,011 2,315 1,81 93,74 10 Cys – ss – Cys 6,661 5,524 1,21 93,97 11 Val 6,137 4,984 1,17 98,55 12 Met 3,513 2,218 1,49 86,92 13 Phe 1,560 KPH 1,65 94,55 14 Ile 8,890 7,638 1,31 95,57 15 Leu 7,689 6,413 1,31 97,40 16 Lys 6,934 5,522 1,46 96,71 17 Pro 8,659 7,572 1,15 94,52 3.1.3. Hàm lượng các vitamin trong các mẫu nấm 3.1.3.1 Vitamin A 3.1.3.1.1. Xây dựng đường chuẩn vitamin A Dãy dung dịch chuẩn vitamin A được khảo sát có nồng độ: 1ppm; 5ppm; 10 ppm; 100ppm. Phân tích các chuẩn nói trên và xác định phương trình đường chuẩn dựa vào diện tích các peak bảng 3.7. Bảng 3.7. Diện tích peak của vitamin A tương ứng với từng nồng độ chuẩn Nồng độ chuẩn (ppm), x Diện tích peak m b R2 Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 192,126 192,119 192,497 150,202 195,87 0,9994 5 976,267 976,204 976,296 10 2053,859 2053,883 2053,794 100 15180,6 15180,44 15180,76 3.1.3.1.2. Kết quả phân tích Chúng tôi tiến hành xử lý 08 mẫu nấm, đồng thời để đánh giá độ đúng của kết quả chúng tôi khảo sát 01 mẫu thêm chuẩn 10 ppm theo sơ đồ 2.2 và định lượng theo điều kiện chạy máy HPLC tại mục 2.3.2.2. Kết quả hàm lượng vitamin A trong các mẫu nấm được trình bày trong bảng 3.8. 15 Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng vitamin A trong nấm TT Mẫu (ký hiệu) Thể tích mẫu (ml) C(μg/g) 1 Mush 01 3,0 1,093 2 Mush 02 3,0 0,361 3 Mush 03 3,0 0,446 4 Mush 04 3,0 0,927 5 Mush 05 3,0 0.541 6 Mush 06 3,0 0,285 7 Mush 07 3,0 0,738 8 Mush 08 3,0 1,208 Kết quả bảng 3.8 cho thấy hàm lượng vitamin A của 08 mẫu nghiên cứu dao động từ 0,285 – 1,208 μg /g. Hiệu suất thu hồi của phương pháp được thực hiện với mẫu nấm Mush 01 thêm chuẩn là 98,71%. Kết quả hiệu suất thu hồi cao phản ánh độ đúng cao của các kết quả định lượng vitamin A trong các mẫu nấm. 3.1.3.2. Vitamin E 3.1.3.2.1. Xây dựng đường chuẩn của vitamin E Dãy dung dịch chuẩn vitamin E được khảo sát có nồng độ như sau: 10ppm; 20ppm; 50 ppm. Đo các chuẩn nói trên và xác định phương trình đường chuẩn dựa vào diện tích các peak bảng 3.9. Bảng 3.9. Diện tích peak của vitamin E tương ứng với từng nồng độ chuẩn Nồng độ chuẩn (ppm) Diện tích peak m b R2 Lần 1 Lần 2 Lần 3 10 120,31485 120,29823 120,30126 10,61397 7,62161 0,9996 20 223,86580 223,66126 223,86985 50 535,42377 535,19625 535,42485 3.1.3.2.2. Kết quả phân tích Chúng tôi tiến hành xử lý các mẫu nấm theo sơ đồ 2.2 và định lượng theo điều kiện chạy máy HPLC tại mục 2.3.2.3. Kết quả hàm lượng vitamin E trong các mẫu nấm được trình bày trong bảng 3.10 1 Bảng 3.10. Kết quả phân tích hàm lượng vitamin E trong nấm TT Mẫu (ký hiệu) Thể tích mẫu (ml) C(μg/g) 1 Mush 01 3,0 70,565 2 Mush 02 3,0 16,959 3 Mush 03 3,0 14,881 4 Mush 04 3,0 35,544 5 Mush 05 3,0 23.772 6 Mush 06 3,0 45,613 7 Mush 07 3,0 36,704 8 Mush 08 3,0 49,331 16 Kết quả bảng 3.10 cho thấy hàm lượng vitamin E của 08 mẫu nghiên cứu dao động từ 14,881 – 70,565 μg /g. Hiệu suất thu hồi của phương pháp được thực hiện với mẫu nấm Mush 01 thêm chuẩn là 97,85%. Kết quả hiệu suất thu hồi cao phản ánh độ đúng cao của các kết quả định lượng vitamin E trong các mẫu nấm. 3.2. Hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide 3.2.1. Xây dựng đường chuẩn của ergosterol và ergosterol peroxide Chuẩn bị dãy chuẩn ergosterol được khảo sát có nồng độ như sau: 25ppm; 50ppm; 1000 ppm Chuẩn bị dãy chuẩn ergosterol peroxide được khảo sát có các nồng độ như sau: 2.5ppm; 5ppm; 10ppm. Tiến hành đo trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với điều kiện đo của ergosterol theo mục 2.4.3.2, và ergosterol peroxide theo mục 2.4.3.1. Kết quả thu được trong bảng 3.11 và hình 3.20, hình 3.21. Bảng 3.11. Diện tích peak của ergosterol và ergosterol peroxide ứng với từng nồng độ chuẩn Nồng độ chuẩn Ergosterol (ppm) Diện tích peak Nồng độ chuẩn Ergosterol (ppm) Diện tích peak 50 127,12099 2,5 23,05513 100 283,43860 5,0 46,45211 1000 2531,40381 10,0 91,85735 3.2.3. Kết quả phân tích Bảng 3.12. Hàm lượng của ergosterol trong 8 mẫu nấm (μg/kg) TT Mẫu (ký hiệu) ergosterol ergosterol peroxide 1 Mush 01 7,01 0,03 2 Mush 02 1,86 0,14 3 Mush 03 7,73 0,17 4 Mush 04 7,11 0,04 5 Mush 05 4,71 0,04 6 Mush 06 5,45 0,07 7 Mush 07 30,61 2,37 8 Mush 08 4,49 0,03 Kết quả phân tích trên cho thấy ergosterol và ergosterol peroxide được xác định có hàm lượng cao trong mẫu (Fomitopsis dochmius) . Hàm lượng của ergosterol và ergosterol peroxide trong mẫu (Fomitopsis dochmius) có sự khác biệt đáng kể. Hiệu suất thu hồi được thực hiện với mẫu nấm Mush 01 thêm chuẩn là 98,02% đối với ergosterol và 97,52% đối với ergosterol peroxide. Hiệu suất thu hồi cao đối với phép xác định hàm lượng ergostero và ergosterol peroxide chứng tỏ các kết quả định lượng 2 chất này trong các mẫu nấm cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao, độ đúng đảm bảo. 17 3.3. Nấm than (D. concentrica) 3.3.1. Kết quả phân lập hợp chất. Bảng 3.13. Các hợp chất được tách ra từ nấm than (D. concentrica) Ký hiệu hợp chất Tên chất Khối lượng (mg) DCM1 [11]-cytochalasa-18-acetoxy-6(12),13-diene-1,21- dione-7,18-dihydroxy-16,18-dimethyl-19- methoxy-10-phenyl-(7S*,13E, 16S*,18S*,19R*) 134 DCM2 [11]-cytochalasa-6(12),13-diene-1,21-dione- 7,18,19-trihydroxy-1