Bài giảng Alcaloid & Dược liệu chứa alcaloid

se : 1. có độ phân cực trung bình  - alk. base tan / dmhcơ có độ ph.cực trung bình đến yếu; - nhưng khó tan / các dmhcơ quá kém ph.cực như EP, n6. - Áp dụng chiết & tinh chế (kiềm hóa, biến alk. muối  alk. base, chiết alk. base bằng Bz, DCM, Cf, Et 2 O...) 2. có tính kiềm  dễ bị kéo vệt trên bản si-gel pha thuận (Si-OH). khắc phục : thêm kiềm vào pha động, vết sẽ gọn. 3. kém bền (nhất là khi + t O )  nên chiết dưới dạng alkaloid muối (bền hơn) 86 alcaloid base : thường kém tan / nước dễ tan / dmhcơ kém phcực (trừ cafein, nicotin, coniin, colchicin, spartein tan / nước) alcaloid muối : dễ tan / nước kém tan / dmhcơ kém ph.cực ( ≠ EP) (trừ berberin clorid, berberin nitrat kém tan / nước reserpin.HCl lại tan / CHCl 3 ) alcaloid phenol : dạng base vẫn tan được / d.dịch kiềm (morphin, cephaelin) Độ tan của alkaloid 87 Strychnin - khó tan trong ether - dễ tan trong CHCl 3 . - rất dễ tan / hỗn hợp Et 2 O - CHCl 3 (1 : 1) Một số alcaloid (ephedrin, cafein)  có thể thăng hoa được ở áp suất thường   dùng pp thăng hoa để tinh chế  (trộn bột trà với vôi, đun / cát), 88 7.2. Hóa tính kiềm mạnh kiềm yếu kiềm rất yếu không kiềm acid yếu nicotin ĐA SỐ cafein codein piperin colchicin ricinin theobromin arecaidin* guvacin** isoguvacin alcaloid + acid  muối tương ứng alcaloid + muối kim loại nặng  muối phức  alcaloid + “thuốc thử chung”  tủa hay màu 7.2.1. Tính kiềm (*) (**) 89 Nếu alcaloid có 2 Nitơ (2 chức base) : - cả 2 N đều có tính kiềm : có thể tạo 2 loại muối. Ví dụ : Quinin  Q.HCl và Q. 2 HCl - 1 N có tính base quá yếu : chỉ có thể tạo 1 loại muối. Ví dụ : Strychnin  (Str) 2 SO 4 [alk muối] sẽ giải phóng ra [alk base] bởi Na 2 CO 3 , amoniac, M(OH) n [alk.H] + .X – + OH – [alk] + (X – /H 2 O) Lưu ý Alkaloid base có tính kiềm yếu hơn các kiềm vô cơ. 90 alcaloid (pKa) alcal o id (pKa) alcal o id (pKa) berberin 2.5 pilocarpin 7.0 morphin 9.2 & 7.9 caffein 3.6 vinblastin 7.4 ammoniac 9.3 acid acetic 4.8 heroin 7.6 Ψ - ephedrin 9.4 reserpin 6.6 scopolamin 7.7 ephed r in 9.6 quinin, brucin 7.8 amphetamin 9.9 quini d in, codein 7.9 atropin 10.2 strychnin 8.3 nicot i n 11.0 & 6.2 cocain 8.6 pKa của vài alkaloid 91 100% 50% pKa (pKa – 2) alcaloid muối alcaloid base alcaloid % ~ 99% là alc. muối ~ 99% là alc. base 50% là alc. muối 50% là alc. base ~ 75% ~ 25% ~ 90% ~ 10%     (pKa + 2) pH pKa 92 pH = pKa + log [base l.hợp] [acid] Henderson – Hasselbalch: [alk. base] = 100 [alk. muối] ở pH = pKa + 2 (> 99% ở dạng alk. base; nếu pH = pKa + 2) [alk. muối] = 100 [alk. base] ở pH = pKa – 2 (> 99% ở dạng alk. muối; nếu pH = pKa – 2) [alk. muối] + + H 2 O [alk. base] + H 3 O + Ka pH = pKa + log [alk. base] [alk. muối] 93 ở pH = pKa + 3  > 99.9% ở dạng alk. base ở pH = pKa – 3  > 99.9% ở dạng alk. muối nếu SKLM 1 alkaloid ở pH # pKa thì : # 50% mẫu ở dạng alk. base (kém phân cực; Rf cao) # 50% mẫu ở dạng alk. muối (phân cực hơn; Rf thấp) vết bị kéo dài, có thể tách thành 2 nhóm vết cần thêm kiềm đến pH = pKa + (2 – 3) 94 alk.base, kém phân cực hơn, bị kéo vệt. alk.muối, phân cực hơn, vết gọn hơn. SKLM alkaloid / Si-gel NP với pha động có pH << [pKa – 2] Ngoài “độ phân cực” của pha động, cần chú ý đến pH khi SKLM alkaloid ! 95 papaverin HCl codein phosphat eserin sulfat eserin salicylat ephedrin HCl caffein base quinin sulfat quinin HCl pH 3 4 5 6 pH 7 pH của một số dung dịch alkaloid 5.5 6.5 5 5 5.5 6 4 7 96 7.2.2. Phản ứng tạo tủa (Y/N) tủa vô định hình tủa tinh thể Valse-Mayer Bouchardat Bertrand (silico-tungstic) Reineckat Scheibler (ac. phospho-tungstic) Sonnenschein (ac. phospho-molybdic) - AuCl 3 - PtCl 3 - acid picric (Hager) - acid picrolinic - acid styphnic - ththử Marmé (CdI 2 -KI) Dragendorff acid tannic ththử Bouchardat = ththử Wagner (Iod / KI) 97 thuốc thử thành phần tạo tủa vô định hình màu Bouchardat KI + I 2 nâu , nâu đỏ Valse-Mayer KI + HgI 2 bông trắng  vàng ngà Dragendorff KI + Bi I 3 đỏ cam  đỏ Marmé KI + Cd I 2 trắng  vàng (có thể k’ tinh) Bertrand acid silicotungstic trắng  trắng ngà Tannin acid t annic trắng (tan / cồn, AcOH, NH 3 ) Phản ứng với các thuốc thử tạo tủa vô định hình 98 thuốc thử thành phần tủa vô định hình màu Reineckat ammoni tetrasulfocyanid diamin chromat III hồng, tan / aceton 50% (định lượng đo màu) có thể kết tinh ở dạng khá đặc trưng, mp rõ (định danh) Scheibler acid p hospho-tungstic trắng Sonnenchein acid phospho-molybdic trắng Cobalt thiocyanat Co(SCN)2 xanh Phản ứng với các thuốc thử tạo tủa vô định hình 99 Lưu ý đối với các thuốc thử tạo tủa vô định hình Độ nhạy thay đổi tùy loại thuốc thử, tùy loại alkaloid Thuốc thử kém bền / kiềm (ddịch thử: tr.tính  acid nhẹ) Tủa có thể tan lại trong - thuốc thử thừa, trong MeOH, EtOH : Marmé - thuốc thử thừa, trong MeOH, EtOH, AcOH : Mayer - MeOH, EtOH, AcOH, NH 4 OH : acid tannic Tủa có thành phần ổn định (  định lượng bằng ph.pháp cân gián tiếp) : Bertrand 100 (++) (+) (+++) Phản ứng với thuốc thử Dragendorff trên giấy lọc 101 Johann Georg No ë l Dragendorff (1836–1898) 102 Một hợp chất không-alkaloid sẽ (+) với thuốc thử Dragendorff khi tại nhóm chức Oxy và carbon-β (nối với oxy) có mật độ è cao. Vì vậy, ở các aldehyd, ceton, ether, epoxid, peroxid, ester, lacton - nếu tại carbon-β có nối đôi / có các nhóm alkyl tự do - thì sẽ phản ứng (+) với th’ thử Dragendorff. miễn là sự mật độ è tại nguyên tử Oxy và tại carbon-β này không bị giảm đi (do hiệu ứng rút điện tử hoặc do nối cầu hydro) Phản ứng dương tính giả với thuốc thử Dragendorff 103 alkaloid Valse-Mayer Bouchardat Dragendorff quinin 8 ppm morphin 400 ppm caffein 100 ppm 1700 ppm Độ nhạy với vài thuốc thử alkaloid 104 Alkaloid Dragendorff Zaffaroni * Morphin 50 μ g 10 μ g Apomorphin 20 μ g 10 μ g Papaverin, Thebain Codein, Heroin, Dionin 10 μ g 10 μ g Narcotin 10 μ g 20 μ g Narcein (kém nhạy) 50 μ g 50 μ g *(thuốc thử Zaffaroni = Kali Iodo-Platinat) Giới hạn phát hiện alkaloid 105 thuốc thử thành phần tạo tủa kết tinh Vàng clorid AuCl 3 . HCl có màu thay đổi tùy loại alkaloid Platin clorid PtCl 4 . 2 HCl acid picric 2,4,6-trinitrophenol có màu vàng  đỏ cam có hình dạng đặc trưng có điểm chảy xác định acid styphnic 2,4,6 - trinitroresorcin acid p icrolonic Δ ’ của p-nitrobenzen Phản ứng với các thuốc thử tạo tủa kết tinh 106 acid picric acid styphnic acid picrolonic + alkaloid Phản ứng với các thuốc thử tạo tủa kết tinh - màu vàng  đỏ cam - hình dạng đặc trưng - điểm chảy xác định tinh thể có định danh alkaloid 7.2.3. Phản ứng với thuốc thử đặc hiệu (định danh) thuốc thử thành phần Alkaloid sẽ cho màu Erdmann acid sulfo-nitric Conessin vàng  xanh  lục Frohde acid sulfo-molybdic Morphin tím Mandelin acid sulfo-vanadic Strychnin tím xanh  đỏ Merke acid sulfo-selenic Codein xanh ngọc Marquis sulfo-formol Morphin tím đỏ Wasicky sulfo-PDAB Indol xanh tím đến đỏ HNO 3 acid nitric đđ. Brucin đỏ máu thường kết hợp với SKLM // alcaloid chuẩn 108 Lưu ý đối với các thuốc thử đặc hiệu Tác nhân: các chất có tính oxy-hóa mạnh (acid sulfuric đđ., acid nitric đđ., sulfochromic...) Môi trường thực hiện : thường là khan. Cho sản phẩm màu khá chuyên biệt, giúp định danh alk. Màu thường kém bền (quan sát nhanh) Màu thay đổi tùy các điều kiện phản ứng (t O , pH và nhất là mức độ tinh khiết của mẫu alkaloid). 109 a. Dao động dãn N-H (3500 - 3300 cm -1 , thường yếu). Amin I (RNH 2 ) cho 2 band Amin II (R 2 NH ) thường chỉ cho 1 band. Nếu có nối cầu hydro, band này sẽ thấp hơn nữa (nhưng sự dịch chuyển không nhiều, cường độ cũng không mạnh như trường hợp nhóm –OH; do liên kết NH--:N yếu hơn liên kết OH--: O) b. Dao động uốn N-H : # 1600 cm -1 , mạnh. c. Dao động C-N (#1300 cm -1 ) yếu, ít giá trị phân tích, trừ trường hợp ở các arenamin (band này mạnh) 7.3. Phổ IR của alkaloid 110 dãn N – H uốn N – H Phổ IR 111 dãn N – H uốn N – H dãn C – N (arenamin) Phổ IR 112 7.4. Phổ UV của alkaloid Đa số alkaloid : λ max 250 – 310 nm. một số alkaloid : λ max trong vùng khả kiến λ max thay đổi theo pH m.trường (dạng alk muối / base) được ứng dụng trong định tính, định lượng. λ max UV của một số alkaloid - berberin : 263 nm 345 nm. - colchicin : 350 nm - morphin : 285 ± 2 (pH 4); 298 ± 2 nm (pH 11) - quinin : 281 ± 2 và 331 ± 2 nm 113 Phổ UV của morphin & codein (pH 4) ; morphin (pH 11) 114 8. Chiết xuất alcaloid 8.1. Nguyên tắc chung Alk là các base yếu, trong cây có thể ở dạng - alk. muối với acid hữu cơ, vô cơ (dễ chuyển dạng) - alk. phức hợp bền với tannin (khó chuyển dạn g ) cần dùng kiềm (tr.bình / mạnh) để tạo phản ứng : [alk.H] + .X – + OH – [alk] + (X – /H 2 O) Nếu muốn chiết dưới dạng alk. base : Nếu muốn chiết ngay dưới dạng alk. muối : Chiết trực tiếp [Alc.H] + .X – với dung môi thích hợp 115 8. Chiết xuất alcaloid 116 8.2. Các phương pháp chiết xuất alkaloid 8.2.1. Chiết dạng alcaloid base - xay bột dược liệu (không quá mịn) - làm ẩm vừa đủ với kiềm thích hợp (mạnh, yếu) - chiết bằng dmôi hcơ kém ph.cực (DCM, Cf, Bz) - thu hồi dung môi; tinh chế (loại tạp); kết tinh Khi làm ẩm, tránh để dược liệu “ướt nhẹp” tránh đun nóng (cô ) dịch alkaloid base (không bền). thích hợp khi thao tác nhanh (định tính, định lượng). không sử dụng cho chiết xuất (ngấm kiệt lâu / kiềm). 117 8.2.2. Chiết dạng alcaloid base bay hơi - xay bột dược liệu (không quá mịn) - làm ẩm vừa đủ với kiềm thích hợp - chiết bằng phương pháp sục hơi nước - thường dùng cho định tính, định lượng ngay. 118 dược liệu + kiềm hơi nước sôi nhiệt kế và bộ tiếp nước Alk base ngưng tụ dung dịch acid loãng Bộ chưng cất lôi cuốn theo hơi nước 119 8.2.3. Chiết các alcaloid base thăng hoa - xay bột dược liệu - làm ẩm vừa đủ với kiềm thích hợp - đun nóng bằng nhiệt khô (cách cát) - thu tinh thể alc. base vừa thăng hoa - tinh chế, kết tinh Ví dụ : Chiết Cafein từ bột Trà cám, trà vụn. 120 8.2.4. Chiết dạng alcaloid muối - xay bột dược liệu (không quá mịn) - làm ẩm vừa đủ với dung môi chiết, nạp vào bình - chiết bằng dung môi (cồn / cồn acid / nước acid ) - cô thu hồi bớt cồn. - tinh chế (loại tạp + chuyển dạng); kết tinh Phương pháp này có thể áp dụng cho sản xuất với quy mô trung bình  lớn. 121 - Alkaloid muối : tan / ROH, không t an / E t 2 O . - Alkaloid base : tan / Et 2 O. (trừ morphin base). 1. Chiết lấy alkaloid muối bằng ROH / acid. 2. Rửa dịch [ROH / acid] với Et 2 O để loại tạp kém phân cực. 3. Trung hòa dịch [ROH / acid] với soda (natri carbonat).4. Lắc lấy phần tan trong E t 2 O ; cô E t 2 O , thu alkaloid base. PHƯƠNG PHÁP STAS-OTTO (1850) 122 PP. STAS – OTTO (1850) cồn - acid tartric  tạp bằng nước dmhc là Et 2 O, CHCl 3 ban đầu : hiện nay : acid thay đổi loại tạp = dmhc / H + dmhc thay đổi 123 9.1. Loại bỏ tạp màu bằng than hoạt tính cần thăm dò tỷ lệ C* để ít mất alkaloid. 9.2. Chuyển dạng alk muối  alk base chọn loại kiềm NH 4 OH, Na 2 CO 3 , NaOH, Ca(OH) 2 chọn pH thích hợp (pH = pKa +2) chọn dmhcơ Bz, Et 2 O, DCM, Cf, Cf – Et 2 O (3 : 1) 9.3. Chuyển dạng alk base  alk muối chọn loại acid (sulfuric, HCl, AcOH, tartric) chọn pH thích hợp (pH = pKa – 2) chọn dung môi (EtOH, MeOH, HOH) 9. Tinh chế & phân lập alcaloid 124 Lưu ý khi tinh chế - alk. base bậc IV (berberin) - alk. phenolat (morphin) - nicotin base, cafein base tan được trong nước Đối với hỗn hợp {alk kiềm yếu + alk kiềm mạnh}: có thể - kiềm hóa lần 1 với NH 3 , lắc với dmhc (thu alk kiềm yếu) - kiềm hóa lần 2 với NaOH, lắc dmhcơ (thu alk kiềm mạnh) cách phân lập chuyên biệt 9. Tinh chế & phân lập alcaloid 125 9.4. Phương pháp SKLM chế hóa (p-TLC) vùng phun thuốc thử (A) (B) (C) cạo (A), (B), (C) (vùng không có th.thử) để lấy alcaloid vùng không phun thuốc thử vùng phun thuốc thử 126 9.5. Phương pháp sắc ký cột (SKC) a. SKC hấp phụ chất h’phụ : Si-gel (15-40 hay 40-63 μ m ) có thể nhồi Si-gel với d.dịch đệm kiềm mẫu nạp : alcaloid base ∑ (ít tạp); k ~ 30 – 60 khai triển : hay dùng CHCl 3 – MeOH (x : y) sao cho Rf ~ 0,30 / SKLM 1 lần theo dõi : SKLM / UV 254 nm hay / Dragendorff thu phân đoạn tinh khiết, kết tinh  alcaloid base. 127 9.5. Phương pháp SKC b. SKC rây phân tử Thường sử dụng pha tĩnh là Sephadex LH-20 Mẫu thử : alk. base toàn phần còn lẫn tạp / (Cf – MeOH) Khai triển với MeOH, MeOH – CHCl 3 - các hợp chất có MW lớn sẽ ra trước - các hợp chất có MW nhỏ sẽ ra sau. 9. Tinh chế & phân lập alcaloid 128 9. Tinh chế & phân lập alcaloid c.1. với cột Cationit alcaloid muối alcaloid base (pH acid) 9.5. Phương pháp SKC c. SKC trao đổi ion 129 c.2. với cột Anionit alcaloid muối alcaloid base alcaloid kiềm yếu sẽ ra trước alcaloid kiềm mạnh bị giữ lại trên cột, ra sau 9. Tinh chế & phân lập alcaloid 130 9. Tinh chế & phân lập alcaloid 9.5. Phương pháp SKC d. SKC phân bố đảo Thường dùng pha tĩnh Diaion HP-20 (Mitsubishi). Mẫu : “alk. muối toàn phần” còn ít tạp / (MeOH – H 2 O) Khai triển cột với (H 2 O – MeOH) (100 : 0  0 : 100) - các hợp chất phân cực mạnh hơn : ra trước - các hợp chất phân cực yếu hơn : ra sau 131 9.6. Phương pháp chiết pha rắn (SPE) Thường dùng để chuẩn bị mẫu cho HPLC, GC. Dụng cụ : cột SPE chứa 100 – 1000 mg pha tĩnh (NP, RP) Lượng mẫu nạp SPE = 5% lượng pha tĩnh. Khai triển bằng dmôi thích hợp (tùy NP, RP) để - giữ tạp lại trên cột SPE, chỉ cho alkaloid ra - loại tạp ra trước, alkaloid sẽ ra sau 9.7. Phương pháp HPLC điều chế thường dùng để phân lập, tinh chế 1 lượng mẫu nhỏ (nghiên cứu cấu trúc, mẫu chuẩn) 132 10. Định tính alcaloid 10.1. Trên vi phẫu (phản ứng hóa mô) vi phẫu rửa bằng cồn tartric rồi + thuốc thử Bou