Bài giảng Kỹ thuật kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby- Bauer

KỸ THUẬT KHÁNG SINH ĐỒ THEO PHƯƠNG PHÁP KIRBY- BAUER * Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch (Kirby-Bauer). Là một phương pháp có thể tiến hành ở các phòng xét nghiệm hàng ngày, không cần nhiều trang thiết bị và máy móc. Nguyên lý: Dùng khoanh giấy có đường kính và độ dầy nhất định, vô trùng đã tẩm sẵn kháng sinh với một nồng độ nhất định (dựa vào hiệu lực của từng kháng sinh), đặt lên một đĩa môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn. Nồng độ vi khuẩn cũng đã được qui định trước. Để tủ ấm cho vi khuẩn mọc và đo đường kính vòng ức chế vi khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh, dựa vào đó xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn được thử với kháng sinh đó. VẬT LIỆU. 1.1.Môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy dùng để kiểm tra mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn phải là môi trường được chuẩn hóa cao để giúp cho hầu hết các vi khuẩn gây bệnh mọc tốt, như môi trường Muller-Hinton. Ở môi trường này hầu hết các cation trong giới hạn nên không ảnh hưởng nhiều đến các chất kháng khuẩn được thử. 1.2. Các chất tăng sinh: Các vi khuẩn khó mọc, đòi hỏi phải có thêm chất tăng sinh trong môi trường trên như máu hoặc các sản phẩm của máu, vitamin hoặc các yếu tố phát triển khác. 1.3. Đĩa petri: Các đĩa để đỗ môi trường có thể bằng chất dẻo hoặc thủy tinh trung tính, có đáy phẳng. Đường kính đĩa có thể là 9 Cm, 11 Cm hoặc lớn hơn. 1.4. Khoanh giấy thấm kháng sinh: Các khoanh giấy thấm kháng sinh phải được bảo quản từng loại riêng trong hộp kín tránh ẩm. Các khoanh dự trữ phải được giữ trong tủ lạnh – 200C, các khoanh làm hằng ngày được giữ ở 2 – 80C tùy theo chỉ dẫn của từng hãng sản xuất. Các khoanh này phải để ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi sử dụng. 1.5. Dung dịch đệm PBS (Phosphat Buffer Saline) hoặc nước muối sinh lý để pha huyền dịch vi khuẩn. 1.6. Thước đo vòng ức chế, pipet Pasteur, pipet 1 ml, tủ ấm Các chủng quốc tế: - Escherichia coli ATCC 25922 - Staphylococcus aureus ATCC 25923 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - Enterococcus faecalis ATCC 29212 - Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 - Haemophilus influenzae ATCC 49247 Hoặc ATCC 49766 - Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 Các chủng này phải thuần nhất và được tiến hành thử nghiệm song song với các chủng phân lập từ bệnh nhân, các chủng làm hằng ngày này được cấy chuyển trên các môi trường không có chất ức chế và tránh cấy chuyển nhiều lần. Các chủng dự trữ phải được đông khô và giữ trong tủ lạnh. Đối với từng mẻ môi trường hoặc từng mẻ thạch mới, phải dùng chủng Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 để kiểm tra nồng độ ion để kiểm tra nồng độ ion có mặt trong môi trường. Đô đục chuẩn McFarland 0,5: Độ đục này được chế bằng cách lấy 0,5 ml 0,48 M BaCl2 trộn đều với 99,5 ml 0,35 N H2SO4, rồi phân chia ra các ống có đường kính tương tự các ống nghiệm chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn. Các ống này phải được hàn kín, để ở chỗ tối trong tủ lạnh và có thể sử dụng được trong vòng 6 tháng. Độ đục này tương ứng với 108CFU/ ml (Colony Forming Unit- Đơn vị hình thành khuẩn lạc). LỰA CHỌN CÁC CHẤT KHÁNG KHUẨN THỬ NGHIỆM VÀ BÁO CÁO. 2.1. Lựa chọn các chất kháng khuẩn thích hợp nhất để thử nghiệm và báo cáo là bước quyết định nhất, vì mỗi phòng xét nghiệm lâm sàng có sự tham khảo của những đối tượng chuyên môn khác nhau (các nhà truyền nhiễm, các bác sĩ điều trị khác). Sự cân nhắc các tác nhân để thử nghiệm dựa trên hiệu quả lâm sàng, tỷ lệ kháng thuốc, giá cả, các khuyến cáo đã thống nhất hiện nay về việc lựa chọn thuốc ưu tiên và các thuốc thay thế. Các thuốc được thử cũng phải phù hợp với tình hình thực tế sử dụng ở từng bệnh viện. Thử nghiệm các tác nhân đã được lựa chọn mang lại lợi ích cho mục đích quản lý các bệnh nhiễm khuẩn. - Các thuốc cùng nằm trong một nhóm chỉ cần thử một loại, vì kết quả của chúng thông thường tương tự nhau và có thể so sánh được hiệu quả trên lâm sàng. Chúng hầu như giống nhau về phổ kháng khuẩn, cách tác động và kết quả kháng chéo. Báo cáo thường dựa trên thử nghiệm với bản thân chất kháng khuẩn, trừ khi các báo cáo này dựa trên các chất khác cho kết quả chính xác hơn. Các kết quả không mong đợi phải được báo cáo. 2.2. Lựa chọn báo cáo. Mỗi phòng xét nghiệm phải quyết định chất kháng khuẩn nào trong bảng để báo cáo hằng ngày (Loại A) và chất nào có lẽ chỉ báo cáo chọn lọc (Loại B) CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH. 3.1. Chuẩn bị môi trường. Môi trường được chuẩn bị theo hướng dẫn của từng hãng sản xuất: bằng cách cân chính xác lượng thạch Muller-Hinton khô và hòa tan vào trong nuớc cất trung tính, kiểm tra pH trước khi hấp tiệt khuẩn. Trong khi hấp, tránh để môi trường ở nhiệt độ cao và thời gian dài hơn sự cần thiết, vì điều đó sẽ làm giảm khả năng đệm và thay đổi pH của môi trường. Sau khi để nguội môi trường tới 50 – 600C (có pH khoảng 7,2 – 7,4) có thể thêm máu hoặc các sản phẩm của máu, lắc cho đều và đỗ vào đĩa petri đã vô khuẩn với độ dày 3,5 – 4,5 mm (có nghĩa 25 ml thạch cho một đĩa Petri đường kính 90 mm hoặc 40 ml thạch cho đĩa có đường kính 110mm v.v). Các đĩa này phải đặt trên mặt phẳng nằm ngang để đảm bảo cho độ sâu của thạch ở mọi vị trí trong đĩa bằng nhau. Để đĩa môi trường nguội ở nhiệt độ phòng rồi bảo quản trong túi nilon ở tủ lạnh 4 – 80C. Các đĩa thạch này được dùng trong vòng 7 ngày kể từ ngày chuẩn bị. Các đĩa thạch có máu hoặc chế phẩm của máu phải được kiểm tra vô khuẩn trong tủ ấm qua đêm mới được sử dụng. 3.2. Ria cấy vi khuẩn: Sau khi vi khuẩn thuần khiết được nuôi cấy qua đêm trên các môi trường không có chất ức chế, dùng que cấy lấy 5 – 10 khuẩn lạc (hoặc 3 vị trí khác nhau, nếu vi khuẩn ở trong ống) để tránh phải các vi khuẩn đột biến, nghiền vào một ống PBS (hoặc nước muối sinh lý) vô trùng, lắc đều bằng máy lắc Votex, so sánh với ống độ đục chuẩn Mc Farland 0,5 (nếu đục quá thì cho thêm PBS hoặc nước muối sinh lý; ngược lại nếu không đủ đục thì cho thêm vi khuẩn), ta được hỗn dịch vi khuẩn ≈ 108 CFU/ml. Dùng que tăm bông vô trùng nhún vào hỗn dịch vi khuẩn trên ép vào thành ống cho bớt nước, rồi ria đều khắp với những đường bắt chéo nhau 1200 lên mặt thạch đã được để trong tủ ấm cho khô (nhưng không quá 30 phút). 3.3. Chuẩn bị khoanh giấy kháng sinh: Lấy ống khoanh giấy kháng sinh từ tủ lạnh để ở nhiệt độ phòng 30 phút cho thăng bằng nhiệt độ giữa trong và ngoài ống. Đặt các khoanh giấy đã chọn lựa với từng vi khuẩn được thử sao cho mặt của khoanh giấy áp sát vào mặt môi trường, mép ngoài của khoanh giấy cách thành trong của đĩa 15 mm và khoanh nọ cách khoanh kia 20mm. Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút cho kháng sinh khuếch tán, rồi để môi trường trong tủ ấm 350C qua đêm. Các đĩa thử với các chủng H. influenzae, S. pneumoniae và N. gonorrhoeae phải để trong tủ ấm có 5 -10% CO2. 3.4. Đọc kết quả: Dùng thước đo đường kính vùng ức chế, dựa vào tiêu chuẩn của từng hãng sản xuất khoanh giấy kháng sinh, ta có mức độ nhạy cảm, trung gian và kháng của từng loại vi khuẩn.