Bài giảng Sản xuất vaccin

cin bất hoạt (vaccin chết) Chứa các vi sinh vật độc đã được làm chết bằng các chất hóa học hoặc nhiệt độ, do đó không còn sinh sôi trong chủ thể được nữa Ưu: nói chung an toàn, nhưng không phải là tuyệt đối Các nội độc tố bề mặt trên vaccin ho gà bất hoạt đôi khi cảm ứng các đáp ứng DTH và virus cúm có gắn với các phản ứng tương tự Nhược: . Thường ít hiệu quả hơn vaccin sống giảm độc lực . Chỉ có khá năng cảm ứng miễn dịch thể dịch vì mầm bệnh chết không thể đi vào tế bào chủ  không tác dụng nếu là nhiễm nội bào . Cần nhiều liều hơn để cho bảo vệ lâu dài Ví dụ vaccin chống lại cúm, tả, ho gà, dại, dịch hạch, viêm gan A và vaccin bại liệt Salk 9Phân loại vaccin Vaccin sống giảm hoạt lực chứa các vi sinh vật sống được làm suy yếu độc lực hoặc vi sinh vật gần giống nhưng ít nguy hiểm hơn( BCG) Ưu: Kích thích kháng nguyên liên tục đủ lâu để sản xuất tế bào nhớ  tạo đáp ứng miễn dịch bền Nhược có thể chuyển lại thành dạng gây bệnh Ví dụ vaccin chống lại sốt vàng da, sởi, rubella, quai bị và vaccin bại liệt Sabin, BCG 10 Phân loại vaccin Vaccin độc tố chứa các độc tố đã bất hoạt không còn gây bệnh Ví dụ các vaccin độc tố uốn ván và bạch hầu, vaccin độc tố Crotalis atrox chống lại rắn chuông cắn dùng cho chó 11 Phân loại vaccin Vaccin dưới đơn vị Chứa một phần nhỏ của tác nhân gây bệnh sản xuất từ vi sinh vật an toàn hoặc tế bào nuôi cấy để gây ra đáp ứng miễn dịch. Bằng cách này, có thể tránh được các độc tố mạnh, hoặc loại bỏ được các vật liệu mơ hồ hoặc đáp ứng miễn dịch lấn át Ưu: . Ít tác dụng phụ hơn vaccin cổ điển . An toàn hơn Ví dụ vaccin Haemophilus influenza type b, vaccin chống lại HBV chỉ chứa các protein bề mặt của virus vaccin tiểu phần giống virus chống lại HPV chứa protein capsid chính của virus 12 Phân loại vaccin Một số vaccin mới Vaccin idiotyp Vaccin liên hợp Vaccin vector tái tổ hợp Vaccin DNA Vaccin tổng hợp 13 Vaccin kháng-idiotyp chứa kháng thể kháng idiotyp KN Anti-idiotype KT2 Iditotype KT1 Phân loại vaccin 14 Kháng thể epitop Virus Kháng thể có vị trí gắn của epitop Vaccin kháng-idiotyp Phân loại vaccin 15 kháng thể Tạo kháng thể kháng lại kháng thể idiotyp Kháng thể kháng- idiotyp Kháng thể kháng- idiotyp bắt chước epitop Vaccin idiotyp (tt) Phân loại vaccin 16 Kháng thể kháng-kháng-idiotyp Kháng thể cho kháng thể kháng-idiotyp Gắn và trung hòa virus Kháng thể kháng-idiotype Kháng thể kháng-kháng-idiotyp Kháng thể kháng-kháng-idiotyp Dùng như vaccin Vaccin idiotyp (tt) Dùng kháng thể kháng-idiotyp làm vaccin Phân loại vaccin 17 Vaccin liên hợp Vaccin polysacchride Vỏ ngoài polysacchrid là KN không phụ thuộc T- cell, tạo miễn dịch yếu ở trẻ nhỏ, không tạo hoặc ít trí nhớ miễn dịch, ảnh hưởng nhắc lại kém  liên kết các polysacchrid này với protein (độc tố)  KN protein . Vaccin chống viêm phổi do phế cầu chứa 23 loại polysaccharide từ nang của 23 chủng St. pneumoniae . Vaccin Haemophilus influenzae type B Phân loại vaccin 18 Vaccin vector tái tổ hợp Là kết hợp sinh lý của một vi sinh vật và DNA của vi sinh vật khác, để chống lại các bệnh có quá trình nhiễm phức tạp. Ví dụ Vaccin phòng một số bệnh do virus được làm bằng cách tái tổ hợp biến chủng virus đậu bò với các gen vô hại của virus gây bệnh, Giá mang Mycobacterium bovis (chủng BCG) Phân loại vaccin 19 Virus đậu bò thuộc họ Orthopoxvirus Sinh sản trong nhiều vật chủ Virus ADN gồm 150-200 gen , ADN xoắn kép có 187.000 cặp nucleotid bao bọc bởi vỏ lipid Loại trừ một phần hệ gen của virus đậu bò  không còn đặc tính gây bệnh nào nữa Vaccin tái tổ hợp dùng giá mang là virus đậu bò Phân loại vaccin 20 Tạo virus tái tổ hợp • ADN mã hóa các kháng nguyên virus gây bệnh được phân lập và biến đổi để gen thể hiện được trong ADN của virus đậu bò  Ghép với ADN của virus đậu bò  gen mã hóa ngưng kết hồng cầu tố của virus cúm  kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B  glycoprotein của virus herpes thông thường, virus dại, virus Epstein-Barr, virus HIV, virus gây viêm đường tiêu hóa dễ lây.. • Làm vaccin đa giá gồm 20 loại KN virus khác nhau Vaccin tái tổ hợp dùng giá mang là virus đậu bò Phân loại vaccin 21 Vaccin tái tổ hợp dùng giá mang là virus đậu bò Ưu điểm • Vaccin virus đậu bò có tác dụng miễn dịch kéo dài do ổn định về mặt di truyền • Có thể dùng bằng nhiều đường  chủng trên qui mô lớn các gia súc gia cầm, động vật hoang dại • Không khó bảo quản vaccin Phân loại vaccin 22 Vaccin ADN • 1796 Jenner: virus động vật • 1800’s Pasteur: virus suy yếu • 1996 vaccin AND Vaccin thế hệ thứ 3 Phân loại vaccin 23 plasmid Tế bào cơ Gene cho KN Tế bào cơ biểu hiện protein – tạo kháng thể Đáp ứng CTL Vaccin ADN Phân loại vaccin Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) 24 Vaccin ADN • Plasmid dễ sản xuất lượng lớn • ADN rất ổn định • ADN đề kháng với nhiệt độ tiện bảo quản và vận chuyển • Trình tự ADN dễ biến đổi trong phòng thí nghiệm  Ta có thể đối phó với các thay đổi của tác nhân nhiễm • Bằng cách dùng plasmid trong vaccin để mã hóa cho tổng hợp kháng nguyên, protein kháng nguyên được sản xuất được biến đổi hậu dịch mã theo cùng cách với protein của virus chống lại sự phòng vệ khi đi vào  Tạo kháng nguyên tốt hơn là protein tinh khiết Phân loại vaccin 25 Vaccin ADN • Có thể sản xuất vaccin phổ rộng nếu dùng hỗn hợp plasmid mã hóa cho nhiều đoạn protein từ một hay nhiều loại virus • Plasmid không sao chép và chỉ mã hóa các protein quan tâm • Không có thành phần protein nên sẽ không có đáp ứng miễn dịch chống lại vector • Cách trình diện này của kháng nguyên  Đáp ứng CTL trực tiếp chống lại bất cứ kháng nguyên nào của mầm bệnh. Đáp ứng CTL cũng phòng vệ các bệnh gây bởi các tác nhân nội bào bắt buộc (ví dụ M. tuberculosis) Phân loại vaccin 26 Vaccin ADN Các vấn đề có thể: • Sự tích hợp plasmid vào bộ gen chủ có thể gây đột biến chèn • Cảm ứng đáp ứng tự miễn (ví dụ các kháng thể kháng-ADN mầm bệnh) • Cảm ứng dung nạp miễn dịch (ví dụ nơi biểu hiện kháng nguyên trong chủ thể có thể có đáp ứng không đặc hiệu với kháng nguyên đó) Phân loại vaccin 27 Vaccin ADN Các vaccin ADN gây sinh sôi tế bào nhiễm virus Cho: • Đáp ứng miễn dịch phổ rộng • Đáp ứng CTL kéo dài Ưu điểm của vaccin ADN cho cúm: Đáp ứng CTL có thể chống lại protein nội sinh Ở chuột vaccin ADN nucleoprotein có hiệu quả chống lại nhiều virus có hemagglutinin khác nhau Phân loại vaccin 28 Phân loại vaccin Vaccin tổng hợp Chứa các peptid, các carbohydrat hoặc các kháng nguyên tổng hợp phần chính hoặc toàn phần Vaccin peptid tổng hợp vi khuẩn Trung hòa độc tố Vaccin peptid tổng hợp độc tố bạch hầu và tả Vaccin peptid tổng hợp virus Các vùng không biến đổi Các vaccin peptid tổng hợp cho các protein và glycoprotein HIV đang được phát triển Vaccin peptid tổng hợp ký sinh trùng vaccin peptid tổng hợp cho các epitop bào tử ký sinh trùng sốt rét 29 Một số tên phân loại vaccin khác Vaccin hấp phụ: Vaccin DPT được hấp phụ trên “giá đỡ” gel nhôm hydroxyt. Vaccin khác chủng: Vaccin có tác dụng chống lại vi sinh vật khác với loài dùng để chế nó. Ví dụ: vaccin từ đậu bò để phòng đậu người. Vaccin đa giá: Vaccin chứa các kháng nguyên bảo vệ của nhiều chủng thuộc về một loài vi khuẩn gây bệnh. Ví dụ: TAB. Vaccin hỗn hợp: Vaccin gồm nhiều kháng nguyên của các loài vi sinh vật khác nhau, để phòng nhiều bệnh nhiễm trùng. Ví dụ: DPT, Priorix. Phân loại vaccin 30 Phương pháp sản xuất vaccin 31 ĐÓNG GÓIBÀO CHẾPHẦN CHÍNH Kháng nguyên 1 Kháng nguyên 2 Kháng nguyên 3 Tá chất ĐÓNG ỐNG Quy trình sản xuất vaccin điển hình 32 1. Hệ thống giống 2. Sản xuất vi khuẩn và các thành phần vi khuẩn của vaccin vi khuẩn 3. Sản xuất virus và các thành phần virus của vaccin virus 4. Phối trộn 5. Đóng ống và làm khô 6. Kiểm soát chất lượng Phương pháp sản xuất vaccin 33 1. Hệ thống giống . Phân lập vi sinh vật thích thích hợp . từ các nhiễm trùng ở người . thao tác và chọn lọc thêm . Làm lô giống (seed lot) . nhân vi sinh vật thích thích hợp lên . phân vào ống . bảo quản ở -700C hoặc đông khô . Kiểm tra độ an toàn và hiệu quả thử lâm sàng. Khi các kết quả thử lâm sàng đạt công nhận, lô giống được dùng thường qui cho sản xuất vaccin Phương pháp sản xuất vaccin 34 2. Sản xuất vi khuẩn và các thành phần vi khuẩn của vaccin vi khuẩn Lên men Thu vi khuẩn Phương pháp sản xuất vaccin 35 Lên men vi khuẩn Phương pháp sản xuất vaccin - Hoạt hóa giống vi khuẩn từ -700C /đông khô - Cấy chuyển một hoặc vài lần vào môi trường nhân giống  đủ lượng - Cấy chuyển giống vào môi trường lên men khuấy liên tục, theo dõi và điều chỉnh pH và thế oxy hóa khử của môi trường suốt quá trình nuôi - Thời gian: 1 ngày - 2 tuần  Thu hoạch 36 Sản phẩm lên men: tế bào vi khuẩn, các sản phẩm chuyển hóa và môi trường cạn kiệt Phương pháp sản xuất vaccin Vaccin sống giảm hoạt lực . tách vi khuẩn không độc ra . hòa vào dung môi thích hợp, có thể đông khô Quá trình thu vi khuẩn 37 Thu vi khuẩn là tác nhân gây bệnh, nguy hiểm 1 Giết chết 2 Tách 3 Phân đoạn 4 Khử độc tố 5 Hấp phụ 6 Kết hợp Phương pháp sản xuất vaccin 38 Thu vi khuẩn là tác nhân gây bệnh, nguy hiểm 1. Giết chết Dùng nhiệt và chất tẩy uế. Bordetella pertusis làm vaccin ho gà - dùng đun nóng /hoặc formalin Vibrio cholerae trong vaccin tả và Salmonella typhi trong vaccin thương hàn - dùng phenol Phương pháp sản xuất vaccin 2. Tách dùng ly tâm Thu tế bào và hòa vào hỗn hợp muối hoặc Thu dịch lỏng, bỏ tế bào 39 Thu vi khuẩn là tác nhân gây bệnh, nguy hiểm 3. Phân đoạn . Chiết các thành phần từ tế bào hoặc từ môi trường nuôi vi khuẩn . Tinh chế bằng dung môi thích hợp và kết tủa . Làm khô thành bột, bảo quản và hợp nhất vào vaccin Phương pháp sản xuất vaccin 4. Khử độc tố chuyển độc tố của vi khuẩn thành độc tố không hại . dùng Formalin khử độc tố của C. diphthe và C. tetani . Tiến hành trên dịch nuôi cấy trong nồi lên men hoặc trên độc tố tinh khiết sau khi phân đoạn 40 Thu vi khuẩn là tác nhân gây bệnh, nguy hiểm 5. Hấp phụ Chất hấp phụ: tá chất khoáng, nhôm hydroxid, nhôm phosphat và canxi phosphat  tăng tính kháng nguyên và giảm độc tính tại chỗ và hệ thống của vaccin. Vaccin bạch hầu và vaccin bạch hầu/uốn ván/ho gà Phương pháp sản xuất vaccin 6 Kết hợp . Để tăng cảm ứng đáp ứng miễn dịch . Polysaccharide nang của H. influenzae Type b + độc tố bạch hầu và uốn ván + protein màng ngoài của Neisseria meningitidis 41 3. Sản xuất virus và các thành phần virus của vaccin virus Nuôi virus Thu virus Phương pháp sản xuất vaccin 42 . Nuôi virus trong phôi gà, vịt hoặc nuôi cấy mô - Chọn mô thích hợp cho virus - Cần tuyệt đối vô trùng trong quá trình nuôi cấy, kiểm nghiêm ngặt động vật tuyệt đối KHÔNG được để nhiễm virus lạ vào phôi . Trứng gà có phôi Virus cúm tích tụ trong dịch túi niệu của trứng Virus sốt vàng da tích tụ trong hệ thống thần kinh của phôi Phương pháp sản xuất vaccin Nuôi virus Nuôi cấy chìm 43 Vaccin cúm: ly tâm dịch túi niệu  huyền trọc virus tinh khiết một phần và đậm đặc  xử lý với ete hoặc với tác nhân phá vỡ khác để cắt virus thành các thành phần của nó nếu muốn có vaccin virion hoặc kháng nguyên bề mặt. Vaccin sốt vàng da: đồng hóa phôi gà trong nước thành bột nhuyễn chứa virus  ly tâm kết tủa hầu hết mảnh vỡ của phôi và virus sốt vàng da Phương pháp sản xuất vaccin Thu virus Lọc và thu dịch có chứa virus 44 . Không có giai đoạn bất hoạt vì hầu hết vaccin làm từ nuôi cấy tế bào chứa virus sống suy yếu Ngoại trừ 2 trường hợp Vaccin virus bại liệt bất họat được bất hoạt với formalin loãng hoặc  3-propiolactone  hấp phụ và rửa Vaccin dại được bất hoạt với  3-propiolactone  siêu lọc . Khi hoàn tất, khối nguyên liệu được bảo quản ở nhiệt độ -700C đến khi trộn thành vaccin cuối Phương pháp sản xuất vaccin Thu virus 45 6. Kiểm soát chất lượng . Nhằm để đảm bảo về hiệu quả và độ an toàn của mỗi lô sản phẩm . Thực hiện theo ba cách: (1) kiểm soát trong quá trình; (2) kiểm soát sản phẩm cuối và (3) yêu cầu phù hợp cho mỗi nguyên liệu sản xuất ban đầu, trung gian, sản phẩm cuối và các phương pháp xử lý. Các kết quả kiểm tra kiểm soát chất lượng luôn được ghi chi tiết. Kiểm tra độ an toàn gồm các kiểm tra tổng quát là: (1) Độ vô trùng, (2) Không có độc tố bất thường, (3) Sự hiện diện của nhôm và calci, (4) Formalin tự do và (5) Nồng độ phenol 46 Phương pháp sản xuất vaccin Ví dụ 47 Nhân giống Nuôi cấy Làm bất hoạt Kiểm tra độ tinh khiết và đáp ứng miễn dịch Bào chế Nuôi Salmonella typhi trên thạch / 18 giờ Hòa 5x108 vi khuẩn /1ml NaCl đẳng trương Môi trường lỏng casein Cấy giống 5%-10% V Nuôi cấy liên tục có hệ thống khuấy 180-300 vòng/1 phút Sục khí vô trùng 1lít/1phút; Thêm dung dịch glucose 40% pH 7,6-7,8 10-12h Trộn sinh khối với EtOH 960 lần 1- 1:4 , lần 2- 1:10 Đưa dung dịch về điểm đẳng điện bằng NaCl có chứa 0,25% phenol, 1ml vaccin cồn chứa 5x109 vi khuẩn. Đóng ống và đông khô ở -40  -500C Đóng gói 6x1010 vi khuẩn/ 1ml Sản xuất vaccin vi khuẩn thương hàn 48 Nuôi cấy Làm khô sinh khối bằng cồn Chiết bằng nước cất (3 lần) Tủa bằng cồn Lần 1: cồn + NaCl bão hòa Lần 2: cồn pH 3,5 – 3,8 Lần 3: cồn 46-52% Đông khô Bào chế Hòa kháng nguyên Vi trong NaCl đẳng trương 40 g/ml Sản xuất kháng nguyên Vi (vỏ) tinh khiết từ vi khuẩn thương hàn Salmonella typhi Kháng nguyên Vi dùng ở dạng mono vaccin hoặc chung với vaccin vi khuẩn hoặc phối hợp với antigen O (= màng) Vi = virulence 49  Giống Clostridium tetani  Nuôi cấy Môi trường lỏng casein + dịch men bia thủy phân Nuôi cấy kỵ khí  Thu exotoxin hấp phụ với Al(OH)3  Làm bất hoạt formalin exotoxcin anatocin  Tinh khiết hóa hấp phụ lại với Al(OH)3  Kiểm tra độ tinh khiết và đáp ứng miễn dịch  Bào chế 1 ml vaccin chứa 20 đơn vị ngưng kết, pH 6,8-7,6 Vaccin ngừa uốn ván 50 Sản xuất vaccin chống viêm gan B Nguyên nhân: HBV, truyền qua đường tiêm chích, tình dục Mỹ: 200.000 người nhiễm/năm, trong đó 20.000 người mang mầm bệnh và 1/5 số này chết do xơ gan, 1/20 bị ung thư gan 1963: phát hiện kháng thể HBV trong máu bệnh nhân ưa chảy máu 1968: HBsAg nuôi HBV trên tế bào gan - KHÓ 1970: huyết thanh người nhiễm HBV mãn 51 Nguyên tắc: trích kháng nguyên bề mặt HBsAg của virus từ máu người bị nhiễm virus hepatitis B mãn tính Không dùng phương pháp nuôi cấy mô được đây là virus ái gan mà tế bào gan nguyên thủy lại khó nuôi cấy LÂU NHẤT, ĐẮT TIỀN NHẤT Sản xuất vaccin chống viêm gan B Các bước chính Máu người nhiễm viêm gan siêu vi B mãn tính Bất hoạt bằng permalin, To và hydroxyt nhôm hoặc pepsin, urease và formalin Tinh chế kháng nguyên Thử độc tính và đáp ứng miễn dịch Thử độc tính trên tinh tinh / 65 tuần cho mỗi lô vaccin Thử hoạt tính kháng nguyên của vaccin trên c