Báo cáo Đề tài Tổng hợp nano curcumin từ củ nghệ vàng

rằng sự hiện diện cua liên kết đôi ở C3,4 và C3‟,4‟ và nhóm OH ở C8,8‟ trên vòng bezen tạo ra hoạt tính kháng viêm cho cur [12]. Chất kháng viêm có khả năng ngăn cản enzym cyclooxygenase và lipoxygenase – nhóm động của enzym sẽ làm giảm sản phẩm gây viêm từ sự chuyển hóa của arachidonic acid. Cur được dùng trong điều trị HIV nhờ khả năng chống lại virus [21]. Dịch trích cồn của nghệ còn có tác dụng kháng khuẩn. Dịch trích cloroform và eter của nghệ có khả năng kháng nấm gây viêm da. Hỗn hợp các cur, DCM và BDCM còn có thể kháng giun [17]. 1.3.3.Hoạt tính chống đông máu Sự kết tụ của các tiểu huyết cầu trong máu sẽ gây ra hiện tượng đông máu. Cur có khả năng ngăn cản hoạt động của enzym cyclooxyenase tạo thêm tiểu huyết cầu, nên cur có tác dụng chống đông máu [20]. Trang 12 1.3.4.Ngăn cản và điều trị ung thư Curcó khả năng ức chế sự tạo khối u, tác động đến hầu hết các giai đoạn của quá trình hình thành và phát triển khối u[21]. Hình 1. 14. Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin Trong giai đoạn đầu của bệnh, các tế bào bình thường bị tác động bởi các gốc tự do và bị biến đổi thành các tế bào ung thư. Cur có thể ngăn chặn quá trình này bằng cách bắt giữ các gốc oxy hóa khác nhau như: gốc hydroxyl OH+, gốc peroxyl ROO + , singlet oxygen, nitric oxide NO và peroxynitrite ONO - [18].Cur có khả năng bảo vệ lipid, hemoglobin và AND khỏi quá trình oxy hóa. Cur tinh khiết có hoạt tính kháng các ion oxy hóa mạnh hơn DMC và BDMC. Cur được chứng minh có khả năng chống di căn đối với một vài loại tế bào ung thư đồng thời ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Khả năng làm giảm quá trình di căn này còn phụ thuộc vào nguồn gốc và loại khối u ác tính [21]. 1.3.5.Trong công nghiệp thực phẩm Cur đã được các tổ chức FDA ở Mỹ, Canada và EU cho phép sử dụng làm chất màu (mã số E100) để tạo màu vàng hay vàng cam cho nước giải khát, pho mát, cà ri, mù tạt Liều lượng sử dụng cho phép là 0 ÷ 0.5mg/kg thể trọng. 1.3.6. Trong công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm Hiện nay, cur ở nhiều nước trên thế giới được coi như vừa là thuốc vừa là thựcphẩm chức năng giúp phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ung thư, viêm loét dạ dày tá tràng, giảiđộc gan, tăng sức đề kháng của cơ thể. Nó được dùng dưới Tế bào bình thường Tế bào ung thư Khối u tăng trưởng Khối u di căn Curcumin đột biến di chuyển phát triển Trang 13 nhiều dạng: bột, viên ép, viêncon nhộng, dạng trà, dạng thuốc tinh chất để tăng thêm việc tiêu hoá và chức năng gan, đểgiảm đau khớp và điều hoà kinh. Vì nghệ có nhiều ứng dụng trong y học nên nó đã đượcnhiều nhà sản xuất quan tâm và cho ra nhiều sản phẩm trên thị trường như Biocurmin củacông ty TNHH Dược phẩm Châu Á (Biocurmin là sự kết hợp giữa nghệ và tiêu giúp choviệc hấp thụ nghệ trong dạ dày nhanh hơn); sản phẩm Bách phụ khang của Công ty TNHHTM Mediproducts (đây là sự kết hợp giữa curvà trinh nữ hoàng cung giúp điều trịbệnh u xơ tử cung). 1.4. Giới thiệu về nano curcumin 1.4.1. Công nghệ nano Theo Wikipedia: “Công nghệ nano là một ngành công nghệ liên quan đến thiết kế, phân tích, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước trên quy mô nanomet”. Nói cách khác công nghệ nano là một công nghệ được sử dụng để phân tích và tạo ra các sản phẩm với các phân tử có kích thước vào cỡ nanomet. Hiện nay, công nghệ nano được ứng dụng khá rộng rãi trong đời sống và hứa hẹn mở ra một cuộc sống hiện đại hơn. Công nghệ nano có tác dụng như một đòn bẩy để giảm thiểu tình trạng ô nhiễm môi trường, bảo vệ các nguồn tài nguyên tiến tới xây dựng một nền kinh tế „sạch‟ hơn. Việc sử dụng nano trong việc chế tạo và thiết kế ra các sản phẩm không chỉ giúp ích cho xã hội mà còn giúp người sử dụng tận dụng tốt các tác dụng của sản phẩm trong quá trình sử dụng. 1.4.2. Các phương pháp chế tạo vật liệu nano 1.4.2.1. Phương pháp hóa ướt Bao gồm các phương pháp chế tạo vật liệu dùng trong hóa keo, phương pháp thủy nhiệt, sol-gel, và kết tủa. Theo phương pháp này, các dung dịch chứa ion khác nhau được trộn với nhau theo một tỷ phần thích hợp, dưới tác động Trang 14 của nhiệt độ, áp suất mà các vật liệu nano được kết tủa từ dung dịch. Sau các quá trình lọc, sấy khô, ta thu được các vật liệu nano. Ưu điểm của phương pháp hóa ướt là các vật liệu có thể chế tạo được rất đa dạng, chúng có thể là vật liệu vô cơ, hữu cơ, kim loại. Đặc điểm của phương pháp này là rẻ tiền và có thể chế tạo được một khối lượng lớn vật liệu. Nhưng nó cũng có nhược điểm là các hợp chất có liên kết với phân tử nước có thể là một khó khăn, phương pháp sol-gel thì không có hiệu suất cao[5]. Phạm vi đồ án nàychỉ tìm hiểu về phương pháp vi nhũ tương. Vi nhũ tương là phương pháp khá phổ biến để tạo hạt nano. Với nhũ tương “nước- trong-dầu”, các giọt dung dịch nước bị bẫy bởi các phân tử chất hoạt động bề mặt trong dầu (các micell). Đây là một dung dịch ở trạng thái cân bằng nhiệt động trong suốt, đẳng hướng. Do sự giới hạn về không gian của các phân tử chất hoạt động bề mặt, sự hình thành, phát triển các hạt nano bị hạn chế và tạo nên các hạt nano rất đồng nhất. Kích thước hạt có thể từ 4 ÷ 12nm với độ sai khác khoảng 0.2 ÷ 0.3nm. Khi các hệ vi nhũ tương được hòa trộn với nhau, phản ứng hóa học tạo các chất mong muốn sẽ xảy ra. Ưu điểm: kích thước và hình dạng của sản phẩm cuối cùng có thể khống chế được với việc thay đổi tỷ lệ chất phản ứng, điều chỉnh kích thước hạt micell. Kích thước hạt nhỏ đồng đều. Không cần cung cấp thêm chất ổn định sau khi tạo xong sản phẩm. Dễ thực hiện. Nhược điểm: dễ bị ảnh hưởng bởi các thông số môi trường như nhiệt độ, pH. Hóa chất đắt tiền, độc hại. 1.4.2.2. Phương pháp cơ học Bao gồm các phương pháp tán, nghiền, hợp kim cơ học. Theo phương pháp này, vật liệu ở dạng bột được nghiền đến kích thước nhỏ hơn. Ngày nay, các máy nghiền thường dùng là máy nghiền kiểu hành tinh hay máy nghiền quay. Phương pháp cơ học có ưu điểm là đơn giản, dụng cụ chế tạo không đắt tiền và có thể chế tạo với một lượng lớn vật liệu. Tuy nhiên nó lại có nhược Trang 15 điểm là các hạt bị kết tụ với nhau, phân bố kích thước hạt không đồng nhất, dễ bị nhiễm bẩn từ các dụng cụ chế tạo và thường khó có thể đạt được hạt có kích thước nhỏ. Phương pháp này thường được dùng để tạo vật liệu không phải là hữu cơ như là kim loại. 1.4.2.3. Phương pháp bốc bay Gồm các phương pháp quang khắc chùm điện tử, bốc bay trong chân không vật lí, hóa học. Phương pháp bốc bay chùm điện tử: năng lượng của chùm tia điện tử được hội tụ trực tiếp lên vật liệu. Khi chùm tia điện tử năng lượng cao bắn lên vật liệu nguồn, toàn bộ động năng của chùm tia điện tử chuyển thành nhiệt năng làm hoá hơi vật liệu và sau đó lắng đọng trên đế. Chùm tia điện tử được gia tốc trong điện trường có năng lượng cao và được hội tụ vào vật liệu nguồn nhờ tác dụng của từ trường điều khiển, khi đó vật liệu được hoá hơi rồi lắng đọng lên đế. Do chùm tia điện tử có năng lượng rất lớn và diện tích hội tụ nhỏ vì vậy vật liệu gần như được hoá hơi tức thì. Chính đặc điểm này cho phép nó có thể tạo được màng mỏng của hầu hết các vật liệu, đặc biệt là đối với các vật liệu nhiều thành phần. Ưu điểm của bốc bay chùm điện tử: độ tinh khiết cao. Bốc bay được vật liệu khó nóng chảy. Dễ điều chỉnh áp suất, thành phần khí và nhiệt độ và dễ theo dõi quá trình lắng đọng. Có thể sử dụng rất ít vật liệu gốc nên tiết kiệm đáng kể nguồn vật liệu. Nhược điểm: khó chế tạo vật liệu là hợp kim. Màng phủ khó đồng đều. Phương pháp bốc bay hiệt trong chân không: là kỹ thuật tạo màng mỏng bằng cách bay hơi các vật liệu cần tạo trong môi trường chân không cao và ngưng tụ trên đế. Bốc bay nhiệt có ưu điểm là: màng lắng đọng ở tốc độ cao Nguyên tử bay hơi năng lượng thấp, ít nhiễm tạp, dễ thực hiện. Áp dụng được Trang 16 cho nhiều loại vật liệu. Nhược điểm: không thể tạo các màng quá mỏng. Khó khống chế độ dày của màng. Khó chế tạo màng đa lớp[5]. Các phương pháp này áp dụng hiệu quả để chế tạo màng mỏng hoặc lớp bao phủ bề mặt tuy vậy người ta cũng có thể dùng nó để chế tạo hạt nano bằng cách cạo vật liệu từ đế. Tuy nhiên phương pháp này không hiệu quả lắm để có thể chế tạo ở quy mô thương mại. 1.4.2.4. Phương pháp hình thành từ pha khí Gồm các phương pháp nhiệt phân, nổ điện, đốt laser, bốc bay nhiệt độ cao, plasma. Nguyên tắc của các phương pháp này là hình thành vật liệu nano từpha khí. Nhiệt phân là phương pháp có từ rất lâu, được dùng để tạo các vật liệu đơn giản như carbon, silicon. Phương pháp đốt laser thì có thể tạo được nhiều loại vật liệu nhưng lại chỉ giới hạn trong phòng thí nghiệm vì hiệu suất của chúng thấp. Phương pháp plasma một chiều và xoay chiều có thể dùng để tạo rất nhiều vật liệu khác nhau nhưng lại không thích hợp để tạo vật liệu hữu cơ vì nhiệt độ của nó có thể đến 9000C[5]. Phương pháp hình thành từ pha khí dùng chủ yếu để tạo lồng carbon hoặc ống carbon, rất nhiều các công ty dùng phương pháp này để chế tạo mang tính thương mại. 1.4.3. Nano curcumin Cur được biết đến là một hoạt chất có khả năng chống viêm, chống khuẩn, là chất sát trùng, chống oxi hóa và chống ung thư. Nhưng trên thực tế cho thấy khả năng hấp thu cur của cơ thể rất thấp, điều này được giải thích là do cur không tan trong nước (độ tan 0.001%), sinh khả dụng thấp. Vì vậy khi dùng theo đường uống, cur hòa tan một phần rất nhỏ vào các dịch thể của ống tiêu hóa, chỉ 7 ÷ 10% Cur được hấp thụ vào máu, lại bị chuyển hóa nhanh qua gan, làm cho sinh khả dụng thực tế của cur chỉ đạt 2 ÷3% [19]. Trang 17 Để tăng tối đa hấp thu tinh chất cur đầy tiềm năng, rất nhiều phương pháp đã được áp dụng như nano hóa, bổ sung các chất phụ trợ bioperin, tổng hợp đồng phân, tạo phức chelat của cur với các kim loại... Trong đó công nghệ nano mang lại hiệu quả vượt trội hơn cả trong việc nâng cao độ tan và hấp thu của cur, đồng thời tạo ra một số lợi ích như cải thiện sự hấp thu của tế bào, giảm chuyển hóa tại gan, giữ ổn định nồng độ trong máu, tăng cường dược tính của cur[19]. Tài liệu nghiên cứu đầu tiên về nano cur ứng dụng trong y học được xuất bản vào năm 2005, từ đó đến nay nano cur đã trở thành tâm điểm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới với 254 bằng phát minh sáng chế của các quốc gia có nền y tế kĩ thuật phát triển như Mỹ, Anh, Đức, Nhật, Hàn Quốc... Trong đó bằng phát minh có liên quan đến ứng dụng nano curcho bệnh nhân ung thư chiếm tỉ lệ lớn nhất (24%), bệnh tim mạch đứng ở vị trí thứ hai với tỉ lệ là 13% [19]. 1.4.4. Đặc điểm của nano curcumin Bằng công nghệ Nano, các phân tử cur được cố định trong chất liệu polymer, tạo thành các hạt tiểu phân Nano có kích thước cỡ 30nm ÷ 100nm. Với kích thước siêu nhỏ giúp nano curphân tán tốt trong nước, độ tan 7.5%, tăng gấp 7500 lần so với cur (0.001%). Trong nước cất có màu vàng sáng, trong nước thường có màu vàng nâu. Mặc khác với kích thước nano cũng giúp nano cur thẩm thấu vào máu nhanh chóng để phát huy hiệu quả điều trị tại hầu hết các cơ quan khác nhau trong cơ thể [19]. Độ hấp thu của nano cur đạt tới 95%, hiệu quả điều trị gấp 40 lần so với cur thông thường (Theo kết quả nghiên cứu của nhóm chuyên gia của trường Đại học Dược, bang Ohio, Hoa kỳ, thực hiện năm 2012 đăng trên Pubmed). Trang 18 1.5. Tình hình nghiên cứu về curcumin 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Người đầu tiên nghiên cứu về chiết xuất cur là ông Taguchi (Nhật Bản). Ông đã dùng phương pháp siêu âm để chiết xuất cur, xác định được các thông số tối ưu: dung môi cồn 700, pH = 3, chiết trong 15 phút. Ông nhận thấy chiết bằng phương pháp siêu âm cho hiệu suất cao và chất lượng cur tốt hơn [15]. Cấu trúc của Cur được Lampe xác định vào năm 1910, Roughley và Whiting công bố vào năm 1973 [1]. Cur tan trong dầu mỡ và các dung môi hữu cơ. Độ bền màu của cur bị ảnh hưởng bởi oxi, tia tử ngoại, môi trường kiềm và các công nghệ tách chiết. Đa số các công trình đều tập trung nghiên cứu hoạt tính sinh học của cur và nghiên cứu ứng dụng các hoạt tính này để điều trị bênh ở người. Khoa Hóa và Sinh hóa Ứng dụng thuộc Đại học Kumamoto, Nhật Bản (2000) đã dùng carbon dioxyt siêu tới hạn để chiết dầu nghệ [3]. Năm 2007, Phòng thí nghiệm Nghiên cứu Dược liệu thuộc Đại học Banaras Hindu (Ấn Độ) đã tiến hành chiết cur sử dụng lò vi sóng để hiệu suất chiết cur cao hơn. Aceton được chọn làm dung môi chiết bởi vì nó có thể hòa tan tốt cur. Điều kiện chiết xuất (tần số bức xạ vi sóng sử dụng, thời gian chiếu xạ, kích thước hạt nguyên liệu) đã được tối ưu hóa. Cur chiết ra được định lượng bằng phương pháp HPLC và sắc ký bản mỏng. Các điều kiện chiết cur tối ưu như sau: 20% năng lượng vi sóng, 4phút chiếu xạ. Việc chiết cur nhờ sự hỗ trợ của vi sóng cho hiệu suất chiết cao hơn và giảm đáng kể thời gian chiết trong điều kiện chiết tối ưu khi so sánh với phương pháp chiết thông thường [20]. Nhiều nghiên cứu đã đưa ra các phương pháp nhằm phân lập cur, DMC và BDMC trong hỗn hợp bột curcuminoid thô ban đầu: Trang 19 Rasmussen và các đồng sự đã đưa ra phương pháp tách các curcuminoid đơn giản và hiệu quả sử dụng sắc kí lớp mỏng (TLC) silica gel đã được tẩm dihydrogen phosphate. Tuy phương pháp này có thể tách và xác định các curcuminoid thành phần nhưng vẫn còn hạn chế do không định lượng được hàm lượng mỗi curcuminoid có trong hỗn hợp[14]. Marsin [7] đã đưa ra phương pháp HPLC CO2 siêu tới hạn với pha động là hệ đệm acetonitrile/acetate [7]. Một phương pháp khác của Xian-Guo He là tách và xác định cur sử dụng cột Supelcosil LC-18 với pha động là ammonium acetate/acetic acid và acetonitrile [8]. Taylor và McDowell đã tách được ba thành phần curcuminoid sử dụng cột polymer non-silica với pha động là dung dịch acetonitrile 55%. Opa Vajragupta và các đồng sự [16] đã tách hỗn hợp curcuminoid ra các thành phần đơn lẻ bằng phương pháp sắc kí cột. Bột curcuminoid truước tiên được hòa tan trong aceton, sau đó được tách bằng sắc kí silica gel với hệ dung môi rửa giải CHCl3:MeOH:AcOH (98:5:2). Theo phương pháp này, cur được rửa giải trước, sau đó là hỗ hợp của cur với DMC, kế đó là BDMC tinh. DMC tinh khiết được tách lần thứ hai cũng bằng phương pháp sắc kí với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2:MeOH (95:5). Độ tinh khiết của các thành phần được kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng TLC, các phổ cộng hưởng từ NMR, phổ hồng ngoại IR, khối phổ ion nguyên tử ESI-MS và phân tích nguyên tố EA. Guddadarangavvanahally K.Jayaprakasha và các đồng sự [7] đã tách ba thành phần của curcuminoid bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC. Các curcuminoid được tách từ oleoresin sử dụng cột sắc kí silicagel sau khi rửa với hexan để loại béo. Đầu tiên tinh dầu nhựa nghệ thương phẩm (CRIO) được hấp thụ lên silica gel, sau đó được nạp lên cột sắc kí silica gel và rửa với dung môi hexan. Tiếp đó, cột được rửa với benzene và ethyl acetate với độ phân cực tăng dần. Cur thu được với hệ dung môi benzene:EtOAc (82:18 v/v), trong khi Trang 20 DMC và BDMC được rửa tương ứng bằng các hệ benzene:EtOAc (70:30 v/v), benzene:EtOAc (58:42 v/v). Các phân đoạn thu được qua cột được cô chân không và kết tinh lại. Hiệu suất tách tương ứng của các chất cur, DMCvà BDMC tương ứng đạt 4.46%, 3.4%, 2.2%. Tháng 7/2011, Sheng Peng Wang (Đài Loan) và các cộng sự đã nghiên cứu và công bố công trình ứng dụng kĩ thuật nano cho cur trên Journal of Nanomaterials. Công trình đã mang đến một hướng tiếp cận mới cho việc sử dụng cur trong y học. 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Nghiên cứu cơ bản về cur gồm: nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu nghệ và chuyển hóa ar-tumeron của Phan Tổng Sơn; nghiên cứu về phản ứng acetyl hóa nhóm hydroxyl của cur và phản ứng amin hóa β-diceton của cur của Đào Hùng Cường; nghiên cứu về tinh thể cur và tính chất điện hóa trong nước muối NaCl 1% ở pH = 9 của Nguyễn Thị Thu. Nghiên cứu chiết tách cur từ củ nghệ vàng của Phạm Đình Tỵ năm 1989, Trần Thị Việt Hoa; từ củ nghệ trắng Cao Bằng của Lưu Thị Huế năm 2003. Nghiên cứu tạo phức cur với một số kim loại hay với các chất tạo huyền phù của Trần Thanh Lương [3]. Nguyễn Đức Hạnh, Nguyễn Minh Đức, Đặng Văn Giáp (2010) [21] đã dùng phần mềm FormRules 3.3 (Intelligensys, Ltd., 2007) để nghiên cứu liên hệ nhân quảvà INForm 3.7 (Intelligensys, Ltd, 2008) để tối ưu hóa đa biến điều kiện chiết cur từ nghệ bằng ethyl acetat sử dụng phương pháp đun hồi lưu. Dịch chiết được cô để thu được cao nghệ và loại bớt tạp tan trong nước. Hàm lượng cur I được xác định bởi thiết bị HPLC Waters 2695. Một số công trình khoa học đã công bố [1]: Đào Hùng Cường, Nguyễn Đình Anh, Phạm Thị Thùy Phương (2005), “Điều kiện tối ưu để chiết tách cur từ củ nghệ vàng bằng phương pháp chưng Trang 21 ninh”, Tuyển tập báo cáo khoa học 30 năm xây dựng và phát triển trường Đại học sư phạm – Đại học Đà Nẵng 1975-2005, trang 99 ÷ 103. Đào Hùng Cường, Nguyễn Đình Anh (2005), “Nghiên cứu chiết curthô từ củ nghệ vàng bằng dung dịch xà phòng”, Tạp chí Hóa Học & Ứng dụng, số 9 (69)/2007, ISSN 0866-7004, trang 42 ÷ 44. Lê Văn Hoàng, Đào Hùng Cường, Nguyễn Đình Anh (2007), “Ảnh hưởng của điều kiện sấy đến hàm lượng cur của củ nghệ vàng”, Tạp chí Hóa học & Ứng dụng, số 7 (67)/2007, ISSn 0866-7004, trang 48 ÷ 49. Đào Hùng Cường, Nguyễn Đình Anh (2007), “Phẩm màu tự nhiên và ứng dụng của nó trong thực phẩm”, Tạp chí Khoa học & Phát triển, số 129/2007, ISSN 1859-1438, trang 15 ÷ 18. Đào Hùng Cường, Nguyễn Đình Anh (2008), “Nghiên cứu ứng dụng curtrong phối màu thực phẩm”, Tạp chí Hóa học và Ứng dụng, số 7 (79)/2008, ISSn 9866-7004, trang 40 ÷ 41. Năm 2013, trong báo cáo khoa học hằng năm của viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã có báo cáo về việc chế tạo thành công hạt nanocurbằng kĩ thuật mi-xen polyme với kích thước từ 50 ÷70nm và cho ra đời sản phẩm thương mại Curmagold. Hình 1. 15. Sản phẩm Curcumargold và ảnh chụp SEM của nanocurcumin Trang 22 CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ THUYẾT 2.1. Phƣơng pháp tách biệt và tinh chế curcumin 2.1.1. Phương pháp chiết 2.1.1.1. Định nghĩa Phương pháp chiết dùng để tách chất ra khỏi hỗn hợp chất rắn hoặc dung dịch huyền phù bằng dung môi thích hợp ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ sôi của dung môi.Cơ sở vật lý của phương pháp là dựa vào định luật phân bố Nernst [2], [4]: Khi thêm một cấu tử thứ ba vào hệ dung dịch có hai cấu tử không tan hoàn toàn vào nhau hoặc tan có giới hạn thì sự hòa tan của cấu tử này vào hai cấu tử theo một tỉ lệ nhất định ở nhiệt độ không đổi, gọi là hằng số Nernst K: C1, C2 là nồng độ của các cấu tử trong dung môi S1, S2 là độ tan của hai cấu tử K càng lớn khi càng lớn thì việc lấy chất rắn ra rất khó khăn, phải dùng dung môi chiết nhiều lần. Cùng một lượng dung môi chiết, cần phải chia nhiều lần chiết. Có thể tính được lượng chất còn lại sau lần chiết thứ n dựa vào hằng số Nernst: ( ) Gn: Lượng chất còn lại sau n lần chiết. G0: Lượng chất ban đầu có trong thể tích V. S: Số ml thể tích dung môi cho vào. Trang 23 Như vậy, muốn Gn càng nhỏ thì n phải lớn, S phải nhỏ, nghĩa là chất định chiết ra còn lại trong dung dịch càng nhỏ thì cùng một lượng dung môi cần phải chiết nhiều lần. 2.1.1.2. Lựa chọn dung môi khi chiết Dung môi chiết phải đảm bảo các yêu cầu sau [2]:  Dung môi chiết phải hòa tan chất định chiết.  Dung môi này dễ tách ra khi tinh chế lại và ít có khả năng tạo nhũ tương và ít độc. Khi lựa chọn dung môi chiết phải chú ý đến độ tan của chất vào dung môi. Độ tan của chất phụ thuộc vào bản chất của chất tan, bản chất của dung môi, nhiệt độ và bề dày mặt tiếp xúc giữa chất tan và dung môi. Các dung môi thường dùng để chiết là: cồn, axeton, acetat etyl, và hệ dung môi acetat etyl/aceton[2]. Bản chất của dung môi ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất chiết chất màu curcuminoid trong bột nghệ. Hiệu suất càng cao khi curcuminoid hòa tan trong dung môi chiết càng tốt. Tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất chiết được tiến hành như sau [2]: Tiến hành: Cân 0.1g bột nghệ cho vào ống nghiệm. Thêm 5ml dung môi (aceton,etanol, acetat etyl, acetat etyl/aceton 5:1, v/v), bịt kín, siêu âm 10 phút ở nhiệt độ 300C Sau đó, lọc lấy dịch chiết. Dùng micropipet hút 0.1 ml dịch lọc pha loãng thành 10 ml bằng etanol rồi đem đo quang ở 425 nm [2]. Xác định hiệu suất chiết curcuminoid (H%) theo công thức: H% = x100% Trong đó: lượng cur chiết được và cur tổng sốđược xác định bằng phươngpháp đo quang UV-Vis. Trang 24 Hình 2. 1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn dung môi chiết Tính lượng Cur tổng số và chiết được theo UV-Vis: Cân chính xác khoảng 0.1 g bột nghệ cho vào ống nghiệm. Thêm 4 ml etanol. Thêm 4 ml etanol tuyệt đối, bịt kín ống nghiệm và siêu âm trong 20 phút. Lọc lấy dịchlọc. Lặp lại quá trình chiết với bã còn lại đến khi dịch chiết không màu. Gộp tất cả các dịchchiết lại. Lấy 1 ml dịch chiết pha loãng bằng etanol thành 100 ml. Đo độ hấp thụ củadung dịch thu được ở 425nm với cuvet 1cm (dùng etanol làm dung dịch so sánh)[2]. 0.1g bột nghệ + 5ml dung môi Siêu âm 10 phút Lọc lấy dịch chiết Đo quang – tính hiệu suất chiết Chọn dung môi chiết Aceton Etanol 70% Etanol tuyệt đối Acetat etyl Acetatetyl/aceton 5/1 Trang 25 Hàm lượng curcuminoid tổng số trong mẫuđược tính bằng công thức: Curcuminoid (mg/kg) = Trong đó: A: Độ hấp thụ của dung dịch. V: Tổng thể tích dịch chiết ; D: hệ số pha loãng (D = 100). 1607: Hệ số hấp thụ riêng của dung dịch chứa 1% cur trong etanol đo vớicuvet 1cm. W : Khối lượng mẫu thử. Tiến hành tương tự với mẫu cur chiết được. Hình 2. 2. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất chiết Từ biểu đồ cho thấy các dung môi dung môi trên có hiệu suất gần như nhau, nhưng cồn tuyệt đối và hệ dung môi chiết acetat etyl:aceton (5:1) cho hiệu suất cao hơn. Nguyên nhân là do chúng phân cực nên hòa tan tốt các hợp chất curcuminoid (tương đối phân cực). Còn cồn 700 cho hiệu suất chiết thấp nhất do dung môi này có độ phân cực khá cao nên khó thẩm thấu vào nền nguyên liệu khô. Trang 26 2.1.1.3. Chọn tỷ lệ dung môi/nguyên liệu Tiếp tục tiến hành khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liệu theo các bước như sau [2]: 20/1 40/1 60/1 80/1 100/1 120/1 Hình 2. 3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỉ lệ dung môi/nguyên liệu Tiến hành: Lấy 6 ống nghiệm, mỗi ống chứa 0.1g bột nghệ. Thêm lần lượt vào từng ống nghiệm 2; 4 ; 6; 8; 10; 12ml dung môi thích hợp đã chọn, bịt kín ống nghiệm. Siêu âm ở 300C trong 10phút. Lọc lấy dịch chiết và xác định hiệu suất chiết như thí nghiệm trước để chọn tỉ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp, thu được kết quả như Hình 2.4 [2]. 0.1g bột nghệ tươi + dung môi thích hợp Thay đổi tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) Siêu âm 10 phút Lọc Đo quang – tính hiệu suất chiết Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp Trang 27 Hình 2. 4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hiệu suất chiết Từ biểu đồ Hình 2.3 ta thấy cho thấy khi tỉ lệ dung môi/nguyênliệu càng tăng thì hiệu suất chiết càng tăng. Khi tăng tỉ lệ dung môi từ 20/1 đến 40/1 (v/w) thì hiệu suất chiết tăng đáng kể (35.92 ÷ 63.61%) nhưng với các tỉ lệ lớn hơn thì hiệusuất chiết tăng rất ít. Do đó, để tiết kiệm chi phí dung môi, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu thích hợp nhất để chiết là 40/1 (v/w). 2.1.1.4. Xác định điều kiện chiết Trong phòng thí nghiệm thường chiết bằng bộ Soklet để chiết liên tục. Chất rắn định chiết đã nghiền nhỏ được gói trong giấy lọc (túi vải) đặt vào phần hình trụ trên bình cầu của bộ chiết. Cho dung môi vào bình cầu (tùy lượng chất chiết mà cho lượng dung môi, khoảng ½ thể tích bình cầu), lắp ống sinh hàn hồi lưu ở trên rồi đun cho sôi dung môi (ở 800C). Hơi dung môi bay lên và hòa tan chất rắn trong bọc giấy lọc rơi xuống bình cầu trong ống dẫn hơi ngưng tụ. Cứ như vậy nồng độ của chất tan trong dung môi tăng dần theo thời gian đun hồi lưu.Chiết cho đến khi dịch chiết trút xuống bình cầu hết màu. Theo dõi quá trình chiết và ghi lại thời gian của một lần chiết và số lần chiếttổng cộng. Trang 28 Sau khi kết thúc quá trình chiết, lọc lấy dịch chiết. Tráng rửa bình cầu và gộp nướcrửa vào dịch chiết. Kết quả theo dõi các thông số khi tiến hành chiết curcuminoid từ nghệ bột ở 800Cbằng hệ thống Soxhlet như sau [2]: – Thời gian chiết: 1h/lần chiết. – Số lần chiết : 9 lần. – Lượng curcuminoid chiết được: 51.424 mg/kg, đạt hiệu suất 90.56%. 2.1.2. Phương pháp kết tinh lại 2.2.2.1. Mục đích  Làm sạch cur, loại bỏ một số tạp chất, các chất nhựa còn tồn tại trong nguyên liệu.  Thu bột cur đã kết tinh có hàm lượng cur cao và nước cái dưới lọc có hàm lượng BMC, BDMC cao. 2.2.2.2. Nguyên tắc Đây là phương pháp quan trọng nhất để tinh chế các chất rắn. Cơ sở lý thuyết của phương pháp là dựa vào sự khác nhau về độ tan của các chất trong một