Chuyên đề Tổng quan về chitosan và ứng dụng trong bảo quản thịt

gây thối có enzyme hỗn hợp Loài vi sinh vật thuộc nhóm này có khả năng phân hủy không chỉ protit mà còn phân hủy cả gluxit và lipit. Thông thường các loài vi sinh vật có enzyme hỗn hợp thường phát triển và phân hủy các thành phần dinh dưỡng trên thịt trước. sau đó là sự phát triển của các vi sinh vật khác. các loài vi sinh vật gây thối có enzyme đơn Loài vi sinh vật thuộc nhóm này chỉ có khả năng sinh tổng hợp một vài loại enzyme riêng biệt và chỉ có thể thực hiện một vài phản ứng riêng rẽ. chúng thường phát triển và thực hiện các phản ứng gây thối sau khi nhóm các loài vi sinh vật có enzyme hỗn hợp phát triển. Bảng vi sinh vật gây thối Nhóm vi sinh vật Dạng phân hủy Kiểu gây thối Kỵ khí Hiếu khí Nhóm vi sinh vật có enzyme đơn Phân hủy protein Bacillus putrificus Bacillus Histolytics Bacillus coligenes Bacillus pyocyaneum Bacillus mensenterucus Phân hủy peptit Bacillus Ventriculosus Bacillus orbiculus Phân hủy axit amin Bacillus faccalis Alcaligenes Proteus zenkirii Nhóm vi sinh vật có enzyme hỗn hợp Phân hủy protein B. perfrigenes B. sporogenes Streptococus Straphylococcus Proteus vulgaris Phân hủy peptit B. bifidus B. acidophilus B. butyricus Phân hủy axit amin B. lactic aerogenes B. aminophilus B. coligenes 1.4.4.2 Diễn biển của quá trình gây thối [2] Giai đoạn gây thối Vi sinh vật tham gia Hiện tượng chuyển hóa Giai đoạn đầu (0 giờ - 24 giờ ) Thịt nhiễm rất nhiều loại khác nhau. Trong đó đáng kể nhất là: Diplococcus Streptococcus Staphylococcus Coli paracoli Sinh khối vi sinh vật bắt đầu tăng Giai đoạn 2 (sau 24 giờ) Streptococcus và staphylococcus có nhiều hơn cả Gluxit bị phân hủy nen môi trường trở nên axit Giai đoạn 3 (đến ngày thứ 3) E.coli phát triển mạnh khống chế các vi sinh vật khác Hình thành nhiều amoniac, pH được chuyển sang trung tính. Cuối giái đoạn này lại thấy sự phát triển của nhiều vi sinh vật,xuất hiện khuẩn lạc vi khuẩn rất rõ Bắt đầu giai đoạn hóa peptone. Thịt mềm, nhớt, pH trở về trung tính và kiềm, bắt đầu có mùi thối Giai đoạn 4 (đến ngày thứ 5) Giai đoạn phát triển nhiều vi khuẩn kỵ khí. Trong đó thấy B. perfrigenes phát triển rất nhiều Thịt có mùi ammoniac hydrosulfua rất rõ. Gluxit bị phân hủy, lipit bị xà phòng hóa protit phân hủy mạnh làm tăng pepton Giai đoạn 5 (tuần lễ thứ 2) Vi sinh vật phát triển mạnh là B. putrificus, Proteus vulgari Bắt đầu quá trình thối rữa. Hàm lượng peptone và axit amin đều tăng. Ngoài ra còn thấy có NH3, axit béo tự do, phenol, indol, skatol mercaptan. Giai đoạn 6 (tuần lễ thứ 3) Vi khuẩn kỵ khí chuyển thành nha bào Hiện thượng thịt thối ở mức độ cao nhất. Amoniac tạo thành ức chế nhiều loài vi sinh vật. Khối thịt trở nên nhão 2 Chitosan 2.1. Khái niệm và lịch sử phát hiện Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với cellulose. Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo... Chitin có cấu trúc thuộc họ polysaccharide, hình thái tự nhiên ở dạng rắn.Do đó, các phương pháp nhận dạng chitin, xác định tính chất, và phương pháp hoá học để biến tính chitin cũng như việc sử dụng và lựa chọn các ứng dụng của chitin gặp nhiều khó khăn.[6] Còn chitosan chính là sản phẩm biến tính của chitin, là một chất rắn,xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ thành các kích cỡ khác nhau. Chitosan được xem là polymer tự nhiên quan trọng nhất. Với đặc tính có thể hoà tan tốt trong môi trường acid, chitosan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm ... Giống như cellulose, chitosan là chất xơ, không giống chất xơ thực vật, chitosan có khả năng tạo màng, có các tính chất của cấu trúc quang học…Chitosan có khả năng tích điện dương do đó nó có khả năng kết hợp với những chất tích điện âm như chất béo, lipid và acid mật. Chitosan là polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và có tính tương thích về mặt sinh học. Trong nhiều năm qua, các polymer có nguồn gốc từ chitin đặc biệt là chitosan đã được chú ý đặc biệt như là một loại vật liệu mới có ứng dụng đặc biệt trong công nghiệp dược ,y học, xử lý nước thải và trong công nghiệp thực phẩm như là tác nhân kết hợp, gel hóa, hay tác nhân ổn định… Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng,chitin - chitosan chiếm khá cao đao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô. Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin - chitosan.[5] Hình: 1)Chitin; 2) Chitosan; 3) Xellulose Như hình vẽ trên, thì sự khác biệt duy nhất giữa chitosan và cellulose là nhóm amin (-NH2) ở vị trí C2 của tritosan thay thế nhóm hydroxyl (-OH) ở cellulose. [10] Chitosan tích điện dương do đó nó có khả năng liên kết hóa họcvới những chất tích điện âm như chất béo, lipid, cholesterol, protein và các đại phân tử. Chitin và chitosan rất có lợi ích về mặt thương mại cũng như là một nguồn vật chất tự nhiên do tính chất đặc biệt của chúng như tính tương thích về mặt sinh học, khả năng hấp thụ, khả năng tạo màng và giữ các ion kim loại. 2.2. Cấu trúc hoá học, tính chất lý hoá của chitosan 2.2.1 Cấu trúc hoá học của chitosan Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế. Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần dung môi, hóa chất độc hại, đắt tiền. Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến đổi nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2. Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% gọi là chitin [10] Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-D- glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit. Công thức cấu tạo của chitosan Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; poly(1-4)-2- amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose. Công thức phân tử: [C6H11O4N]n Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n Qua cấu trúc của chitin và chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt động là -OH (H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là -OH, -NH2, do đó chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn chitin. Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp.[10] 2.2.2 Tính chất lý hoá của chitosan Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạng vảy, không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 - 3110C. Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hoà tan được trong dung dịch axit hữu cơ loãng như: axit acetic, axit fomic, axit lactic…, tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt. Chitosan hoà tan trong dung dịch axit acetic 1 - 1.5%. Độ nhớt của chitosan trong dung dịch axit loãng lien quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polyme) Chitosan kết hợp với aldehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzyme. Chitosan phản ứng với axit đậm đặc, tạo muối khó tan. Chitosan tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. [9] 2.2.3 khả năng chống oxi hóa của chitosan Các sản phảm thực phẩm chứa một hàm lượng cao các chất béo chưa bão hòa, dễ bị mất hương vị, tạo mùi ôi. Darmadji và Izumimoto (1994) nhận thấy rằng 1% chitosan thêm vào thịt dẫn đến một sự suy giảm 70% trong 2-thiobarbituric acid (TBA) giá trị sau 3 ngày kể từ ngày lưu trữ ở 4 0C.[15] Thịt bò băm được xử lý với 5000 ppm of N-carboxymethylchitosan thì làm giảm 93% giá trị TBA St Angelo và Vercellotti (1989) . Shahidi et al. (1999) nhận thấy cơ chế của quá trình này liên quan tới sự chelation các ion sắt tự do 2.3. Cơ chế kháng khuẩn Cơ chế chính xác của hoạt động kháng VSV của chitosan, chitin và các dẫn xuất của chúng vẫn chưa được biết đến đầy đủ. Tuy nhiên hiện nay có 2 cơ chế được quan tâm:[11] Cơ chế thứ nhất Chitosan là đại phân tử tích điện dương, trong khi màng tế bào vi sinh vật đa số tích điện âm, do đó xảy ra tương tác tĩnh điện làm cho màng tế bào vi sinh vật bị hư hỏng, ngăn cản quá trình trao đổi chất qua màng tế bào, đồng thời làm xuất hiện những lỗ hổng trên thành tế bào, tạo điều kiện để protein và các thành phần cấu tạo của tế bào bị thoát ra ngoài à tiêu diệt vi sinh vật (Shahidi, Arachchi, và Jeon, 1999). Trong một nghiên cứu khá rộng về tính kháng khuẩn của chitosan từ tôm chống lại E.coli, người ta đã tìm ra rằng nhiệt độ cao và pH acid của thức ăn làm tăng ảnh hưởng của chitosan đến vi khuẩn. Nó cũng chỉ ra cơ chế ức chế vi khuẩn của chitosan là do liên kết giữa chuỗi polymer của chitosan với các ion kim loại trên bề mặt vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. Khi bổ sung chitosan vào môi trường, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ tích điện âm sang tích điện dương. Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy rằng chitosan không trực tiếp hoạt động ức chế vi khuẩn E.coli do mà là do sự kết lại của các tế bào và sự tích điện dương ở màng của vi khuẩn. Chitosan N-carboxybutyl, một polycation tự nhiên, có thể tương tác và hình thành polyelectrolyte với polymer acid tính có trên bề mặt vi khuẩn, do đó làm dính kết một lượng vi khuẩn với nhau. Cũng từ thí nghiệm này người ta thấy rằng có rất nhiều ion kim loại có thể ảnh hưởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan như K+, Na+,Mg2+ và Ca2+. Nồng độ lớn các ion kim loại có thể khiến mất tính chất này, ngoại trừ ảnh hưởng của Na+ đối với hoạt động kháng Staphylococcus aureus. Người ta cũng thấy rằng chitosan có thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bào nhiều vi khuẩn. Khi sử dụng chitosan, thì một lượng lớn các ion K+ với ATP bị rò rỉ ở vi khuẩn Staphylococcus aureus và nấm candida albicans. Cả chitosan phân tử lượng 50kDa và 5kDa đều kháng tốt hai loại trên nhưng chitosan phân tử lượng 50kDa làm mất nhiều gấp 2-4 lần ion K+ với ATP chitosan 5kDa. Điều này thể hiện cơ chế kháng khuẩn khác nhau ở chitosan khối lượng phân tử thấp và cao. Hoạt động kháng khuẩn của chitosan phân tử lượng khác nhau đã được nghiên cứu trên 6 loài vi khuẩn.Và cơ chế kháng khuẩn này đã được chứng minh đựa trên việc đo tính thấm của màng tế bào vi khuẩn và quan sát sự nguyên vẹn của tế bào. Kết quả chỉ ra rằng khả năng này giảm khi khối lượng nguyên tử tăng. Và nó tăng cao ở nồng pH thấp, giảm rõ rệt khi có mặt ion Ca2+, Mg2+ . Nồng độ ức chế thấp nhất khoảng 0.03-0.25%, thay đổi tùy từng loài vi khuẩn và khối lượng phân tử của chitosan. Chitosan cũng là nguyên nhân làm thoát các chất trong tế bào và phá hủy thành tế bào.Tính kháng khuẩn này phụ thuộc vào khối lượng phân tử và loại vi khuẩn. Đối với vi khuẩn Gram dương, chitosan 470 KDalton có ảnh hưởng đến hầu hết các loài trừ lactobacillus sp. , trong khi với vi khuẩn Gram âm chitosan có khối lượng 1106 KDalton mới có ảnh hưởng. Hoạt tính kháng khuẩn tăng khi gia tăng nồng độ chitosan. [18] Tóm lại khả năng kháng khuẩn của chitosan đối vi khuẩn Gram âm mạnh hơn so với vi khuẩn Gram dương (Chung et al. 2004; No et al., 2002). Trong khi đó vi khuẩn Gram dương lại nhạy cảm hơn, có thể do vi khuẩn Gram âm có lớp màng chắn bên ngoài (Zhong et al., 2008). [13] Hình: Ảnh hưởng của chitosan (MW = 48.5 kDa) lên E.coli (1) 0%, (2) 0.25%, (3) 0.5%, (4) 0.75%, (5) 1.0% chitosan. Hình: Ảnh hưởng của chitosan (MW = 48.5 kDa) lên S.aureus (1) 0%, (2) 0.25%, (3) 0.5%, (4) 0.75%, (5) 1.0% chitosan. Hình: E. coli xử lý với 300 mg/l OCNP(hạt nano chitosan) trong 30 min. A. 0 phút, B. 5 phút, C. 15 phút, D. 30 phút (Xing et al., 2009b) Theo Ming Kong và các cộng sự (2008) tất cả các vi khuẩn gram âm có một màng ngoài do sự biểu hiện của lớp lipopolysaccharide (LPS). trong đó đóng góp vào sự ổn định của lớp LPS thông qua tương tác tĩnh điện với các cation hóa trị hai như vậy như Mg2+ (Hình).Giống như EDTA, chitosan loại bỏ các cation. Việc giải phóng LPS làm mất sự ổn định của màng ngoài.[12] Cơ chế của hoạt động kháng khuẩn của chitosan khác nhau ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm (Zheng & Zhu, 2003). Trong nghiên cứu này, họ phân biệt tác động của chitosan trên S. aureus (Gram dương) và Escherichia coli (Gram âm). Đối với S. aureus Gram dương, hoạt động kháng khuẩn tăng khi tăng trọng lượng phân tử của chitosan. Bên cạnh đó, với Gram âm E. coli, hoạt động kháng khuẩn tăng lên khi giảm trọng lượng phân tử. Các tác giả gợi ý hai cơ chế khác nhau cho hoạt động kháng khuẩn: (1) Trong trường hợp của S. aureus, các chitosan trên bề mặt của tế bào có thể hình thành một màng polymer, ức chế các chất dinh dưỡng đi vào tế bào và, (2) Đối với, E. coli, chitosan trọng lượng phân tử thấp sẽ đi vào các tế bào thông qua sự lan tỏa. [14] Hình : Cấu tạo màng ngoài của vi khuẩn Gram âm Ảnh hưởng của chitosan đối với E.coli sau 30 phút (kong và các cộng sự 2008) Cơ chế thứ hai Các phân tử chitosan khi phân tán xung quanh tế bào vi sinh vật sẽ tạo ra các tương tác làm biến đổi ADN, ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp ARN thông tin và tổng hợp protein, ngăn cản sự hình thành bào tử, ngăn cản trao đổi chất, hấp thu các thành phần dinh dưỡng của vi sinh vật…(Sudarshan và cộng sự, 1992).[11] Các cơ chế khác Chitosan kích hoạt một số hàng rào phòng thủ trên tế bào chủ, chitosan tiếp xúc với các mô thực vật và kích thích tiết ra các emzyme bảo vệ như chitinase, chitosanase, b-1,3-glucanse, từ đó tiêu diệt vi sinh vật. Cơ chế này không còn đúng trong trường hợp sử dụng màng bao chitosan cho các sản phẩm bảo quản nguyên quả, vì khi đó chitosan bao bọc bên ngoài lớp vỏ thực vật, không có điều kiện tiếp xúc với các mô thực vật nên không thể kích thích tiết enzyme tiêu diệt vi sinh vật. Chitosan hoạt động như một tác nhân kìm hãm, liên kết có chọn lọc với kim loại dạng vết do đó ức chế sự sản xuất chất độc và tăng trưởng vi sinh vật (Cuero, Osuji, và Washington, 1991b). 2.3. Các nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan Nghiên cứu trên vật thí nghiệm cho thấy chitin và chitosan có hoạt động ức chế vi khuẩn và nấm. Một trong các đồng phân của chitosan là N- carboxybutyl chitosan có tác dụng kìm hãm và tiêu diệt 298 loài vi sinh vật gây bệnh. Khi có chitosan và chitin trên bề mặt các tác nhân gây bệnh ở thực vật, chúng ức chế sự phát triển của những loài này. ở nồng độ 0.1% và pH 5.6 chúng kháng các loại nấm: Fusarium, Alternaria, Rhizopus… Và hoạt động kháng này sẽ giảm ở những vi sinh vật mà trên thành tế bào có chứa chitin, chitosan hoặc chitin-ß-glucan. Chính hoạt động ức chế vi khuẩn cao của chitosan ở pH thấp nên khi thêm chitosan vào những thực phẩm có tính acid thì nó có chức năng tăng cường hoạt động kháng khuẩn như là một chất bảo quản tự nhiên. Ở pH 5.5, với nồng độ 0.5-1% chitosan có tác dụng ức chế đến các loài S. aureus, E. coli, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes. Ở pH 6.5 chỉ có S. aureus bị ức chế ở nồng độ đó trong khi các loài khác vẫn phát triển ở nồng độ 2.5% (nồng độ cao nhất đã được nghiên cứu)[10]. Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của chitosan đến các loại vi khuẩn: - (Shahidi et al, 1999.). Wang (1992) quan sát thấy rằng nồng độ chitosan (1-1,5%) ngừng hoạt động hoàn toàn của Staphylococcus aureus sau 2 ngày kể từ ngày ủ ở pH 5,5 hoặc 6,5. -Chang et al. (1989) tìm thấy nồng độ chitosan 0,005% bất hoạt hoàn toàn S. aureus. Điều này đã được tìm thấy bởi Darmadji và Izumimoto (1994)về ảnh hưởng của chitosan trong bảo quản thịt. -Simpson et al. (1997) nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ khác nhau của chitosan vào sự phát triển của vi khuẩn vào tôm nguyên liệu. Họ tìm thấy vi khuẩn Bacillus cereus bị ức chế bởi chitosan nồng độ 0,02%, trong khi Eschcoli và Proteus vulgaris erichia tăng trưởng tối thiểu tại 0,005% và bị ức chế sự tăng trưởng ở nồng độ lớn hơn 0,0075%. -Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự ảnh hưởng của nồng độ khác nhau của chitosan tăng trưởng E. coli. Wang (1992) sau khi ủ ngày 2 với 0,5% hoặc 1% chitosan ở mức độ pH là 5,5.Nồng độ Chitosan 1% trong nước cũng ức chế hoàn toàn E. coli [10] Một số nghiên cứu đã xem xét tác động của chitosan bất hoạt của một số loại nấm: -EL-Ghaouth et al. (1992b) đã nghiên cứu ảnh hưởng của Chitosan lên sự phát triển của nấm ở quả dâu tây sau thu hoạch.Các tác giả thấy rằng chitosan với 7,2% NH2 làm giảm sự phát triển của Botrytis cinerea và Rhizopus stolonife. -Trong một nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, et al EL-Ghaouth.(1992b) đã quan sát các dấu hiệu của nhiễm trùng trong trái cây phủ chitosan sau 5 ngày lưu trữ tại 13OC so với 1 ngày so với một ngày không sử dụng Chitosan. Sau 14 ngày lưu trữ, chitosan phủ (tại 15 mg / ml) giảm sự hư hỏng của dâu gây ra bởi các loại nấm Fang et al. (1994) [10] 2.4 Độc tính của chitosan Nghiên cứu về độ an toàn, độ độc tích lũy Chitosan được thử độ an toàn (LD50) trên 123 chuột trắng (18-21 gam) chia 5 đợt, với liều lượng tăng dần 0,0025-0,020 g/ngày cho mỗi chuột. Theo dõi liên tục trong 72 giờ. Kết quả chuột vẫn khỏe mạnh, không chuột nào chết. Theo dõi độc tính tích lũy trên chuột nhắt, liều uống 0,02g một ngày cho một chuột, cho uống liên tục 14 ngày, chuột vẫn sống khỏe mạnh bình thường. Độc tính cấp Trên 5 lô chuột nhắt trắng (50 con) cho uống chitosan với liều lượng 9g/kg cân nặng, theo dõi liên tục 72 giờ: không có chuột nào chết, suy ra chỉ số điều trị là 250g theo đường uống, chứng tỏ chitosan dùng an toàn. Độc tính tại chỗ Kết quả nghiên cứu dược lý cho thấy chitosan không gây tồn thương các tổ chức, không gây phù nề tại chỗ, không gây phản ứng giản mạch tại chỗ trên thỏ và chuột cống thực nghiệm. Độc tính bán trường diễn Dùng chitosan trên thỏ thực nghiệm, ở dạng bột trộn thức ăn với liều lượng 2g/kg cân nặng, liên tục trong 4 tuần lễ. Theo dõi ảnh hưởng của chitosan trên các chức năng gan, thận và tạo máu, chưa thấy có độc tính bán trường diễn trên thỏ thực nghiệm. Kết quả Chitosan được thử trên xúc vật thực nghiệm( chuột nhắc, chuột cống, thỏ), kết quả cho thấy: chitosan không gây độc tính tại chỗ, độc tính bán trường diễn,không ảnh hưởng đối với trọng lượng cơ thể, trọng lượng gan, cơ quan tạo máu, các chỉ tiêu hóa sinh trong nước tiểu của súc vật thực nghiệm[21] 2.5 Các chất kết hợp bảo quản 2.5.1 Chitosan và nitrite Youn et al. (1999) khám phá rằng có thể thay 50% nitrite bằng chitosan 0,2 % trong xúc xích hàn quốc. Đối với xúc xích bào quản bằng nitrite nồng độ 150 ppm thì sau 4 ngày lượng vi khuẩn tăng hơn 2 log CFU/g và hơn 3 log CFU/g sau 7 ngày bảo quản ở 300C. Trong khi sử dụng hỗn hợp chitosan và nitrite thì sau 7 ngày lưu trữ ở 300C thì lượng vi khoảng 30 000 đến 120 000 Da thì màu đỏ, hệ nhủ tương, độ cứng của xúc xích vẫn được giữ nguyên, chitosan có trọng lượng phân tử cao có thế ảnh hưởng đến cảm quan [10]. 2.5.2 Chitosan and benzoate Sự kết hợp giữa chitosan và benzoate đã được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm bởi (Sagoo et al., 2002b), ba chủng nấm men gây hỏng Sac. exiguus, Scd. ludwigii và T. delbrueckii, đã bị ức chế bởi 0.05 và 0.005% chitosan glutamate và 0.025% sodium benzoate trong dung dịch nước muối 0,9% tại pH 6.2 và 4.5. Phương thức tương tác giữa chitosan và benzoate chưa có nghiên cứu rõ ràng, và đang được nghiên cứu, là một đại phân tử chitosan không thể di vào vách của tế bào nấm men khác với benzoate tác động lên các thành phần nội bào. Các kết quả nghiên cứu trong phòng cần được khẳng định trong thực phẩm trước khi đưa vào thực tiễn sản xuất tận dụng khả năng kết hợp giữa chitosan và benzoate [10]. 2.5.3 Chitosan và sulfite Sulfite là một yếu tố không thể thiếu trong xúc xích thịt lợn vì ngoài khả năng kháng các vi khuẩn Gram âm nó còn mang lại màu hồng có tính cảm quan cho sản phẩm. Do đó các nghiên cứu được xoay quanh vấn đề là lượng sulfite tối thiểu đơn lẻ hoặc kết hợp với chitosan để ứng dụng vào thực phẩm dựa trên các chỉ tiêu vi sinh vật, nấm men, vi khuẩn lactic, các vi khuẩn đường ruột, pH, mùi. Ví dụ như kết quả được minh họa trong hình. Hình ảnh hưởng của sự kết hợp chitosan 0,6% và 170 ppm sulfite (n) và các nồng độ riêng lẻ, kết hợp chitosan và sulfite trên xúc xích thịt lợn tươi ở 40C Roller et al. (2002). Cơ chế của sự bảo quản kết hợp giữa chitosan và sulfite theo 2 bước sau. Thứ nhất chitosan có vai trò phân tán chậm sulfite, do đó giúp ngăn ngừa quá trình thái hóa sớm của sulfite. Thứ 2 chitosan ức chế nấm men thực vật, ngăn ngừa việc tổng hợp acetaldehyde, một chức gây mất hoạt tính đối với sulfite (Roller et al., 2002)[10]. 2.6. Các nghiên cứu bảo quản trên thịt 2.6.1 ứng dụng chitosan bảo quản thịt bò băm [15] Chitosan nồng độ 0,5 - 1,0% ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây hỏng trên thịt bò băm ở 300C trong thời gian là 48 giờ và 40C trong thời gian là 10 ngày.Ngoài ra chitosan còn ngăn cản quá trình oxy hóa lipid,tăng tính cảm quan và giữ màu thịt trong thời gian bảo quản. 2.6.1.1 vật liệu phương pháp Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong thí nghiệm này là Lactobacillus plantarum IAM 1216,Pedicoccus pentosaceus IAM 12296, Micrococcus varians IFO 3765, Staphylococcus aureus IAM 1011, Escherichia coli RB, Bacillus subtilis IFO 3025 và Pseudomonas fragi IFO 3458. Các vi khuẩn này được nuôi trong môi trường dịch triết peptone glucose (YPG) gồm 5g dịch triết nấm men, 10g peptone, 10g glucose 1g Tween 80, 0,1 g L-cystein trong 1 lít nước, pH 6,8 (Nakae etal., 1987). Tác dụng kháng khuẩn của chitosan lên sự phát triển của vi khuẩn với nồng độ 0%, 0.2%, 0.5%, 1% chitosan được xác định bằng máy đo OD bước sóng 660 nm sau 24 giờ trên môi trường YPG lắc chậm ở 300C Thịt bò tươi được mua vào ngày tiến hành thí nghiệm. Thịt được cắt và thái nhỏ thành miếng khoảng 4mm. Cứ 10g thịt sẽ được trộn với chitosan với nồng độ lần lượt 0%, 0.2%, 0.5%, 1% mỗi loại 3 mẫu. Sau đó các mẫu được bọc lại bằng Sarawrap và chia thành 2 lô. Lô thứ nhất ủ ở 300C trong thời gian 0, 12, 24 và 48 giờ. Lô thứ 2 được làm lạnh ở 40C trong thời gian 0, 3, 5 và 10 ngày. Các mẫu này được dùng để phân tích vi sinh vật,xác định giá trị TBA (2-thiobarbituric acid) và VBN (volatile basal nitrogen). Chitosan được thu nhận từ Katokichi Co. Ltd., Japan. Phân tích hóa học TBA được xác định bằng phương pháp chưng cất hơi nước(Ando & Yamauchi, 1968) và được sửa đổi bởi Izumimoto et al. (1990) số mg malonaldehyde/kg thịt. Giá trị VBN đo bằng phương pháp của Conway's method (Kousaka, 1983). Phân tích màu sắc Mỗi 40g mẫu được để trong đĩa petri kích thước 60 x 15 mm (Corning, Iwaki Co. Ltd), ép chặt và bọc lại bằng Saranwrap sau đó đóng đĩa petri. Giá trị màu sắc được đo bằng máy đo màu Minolta (CM-1000, Minolta Co.Ltd) thể hiện qua các giá trị như L* (màu sắc), a* (đỏ), b* (vàng) Phân tích cảm quan Mỗi 40g mẫu đối chứng và mẫu chứa chitosan được cho vào 100g patty( bánh bao)có đường kinh 10cm, dày 1cm chiên trong dầu ở 1900C, mỗi mặt chiên trong 4 phút. Sau đó cắt thành khối nhỏ 1-5 cm. Sau đó tiến hành đánh giá cảm quan ngẫu nhiên 2.6.1.2 kết quả và bàn luận Từ hình ta thấy chitosan (0,01%) ức chế sự tăng trưởng của một số vi khuẩn gây hỏng như Bacillus subtilis IFO 3025, Escherichia coli RB, Pseudomonas fragi IFO3458 và Staphylococcus aureus IAM 1011. Ở nồng độ cao hơn (0.1 và 1,0%), nó ức chế sự tăng trưởng của Lactobacillus 1216 01:00 plantarium, Pediococcus pentosaceus IAM 12296 và Micrococcus varians IFO 3765 Hình: ảnh hưởng của chitosan lên sự phát triển của vi khuẩn gây hỏng ở 30°C. Trong for 24 giờ. Lp: Lactobacillus plantarum IAM t216 Pp: Pediococcus pentosaceus IAM 12296 My: Micrococcus varians IFO 3765 Pf: Pseudomonasfragi IFO 3458 Sa: Staphylococcus aureus IAM 1011 Ec: Escherichiacoli RB Bs: Bacillus subtilis IFO 3025 Sự tăng trưởng của Staphylococci, Coliform, Gram-negative bacteria,Micrococci và Pseudomonas trên thịt trong thời gian lưu trữ ở 300C và 40C trong 10 ngày thể hiện ở 2 bảng sau Bảng : Ảnh hưởng của chitosan đến số lượng (log10 cfu/g) trên thịt 300C, 48 giờ Bảng : Ảnh hưởng của chitosan đến số lượng (log10 cfu/g) trên thịt 40C, 10 ngày Giá trị VBN Trong thời gian lưu trữ ở 300C trong 24 giờ và 48 giờ, giá trị VBN của thịt có chứa chitosan thấp hơn so với mẫu đối chứng. Một số vi khuẩn gây hư hỏng như speudomonas tiết ra các enzyme phân hủy protein. Quá trình này có thể làm ảnh hưởng đến sự thối rửa và làm hóa hơi nitơ. Tuy nhiên chitosan cho thấy khả năng kháng sự phát triển của vi khuẩn này Hình: Ảnh hưởng của chitosan đến giá trị VBN trên thịt 300C, 48 giờ Hình: Ảnh hưởng của chitosan đến giá trị VBN trên