Đánh giá đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết với hải miên tại vùng biển Đà nẵng Việt Nam thông qua nghiên cứu metagenomics bằng kỹ thuật 16S rrna miseq sequencing

ừng đối tƣợng cụ thể, hệ vi sinh vật có những vị trí và vai trò khác nhau. 1.2.1. Đối với hải miên: Chức năng cộng sinh của vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu dinh dƣỡng, ổn định khung hải miên, xử lý chất thải trao đổi chất, sản sinh các chất trao đổi thứ cấp, quang hợp, oxy hoá metan, nitorat hoá, cố định nitơ, khử sulphat và khử halogen (dehalogenation). Một số nghiên cứu đã tìm thấy sự xuất hiện của chu trình lƣu huỳnh ở hai loài hải miên nƣớc lạnh Geodia barrette và Aplysina aerophoba. Chu trình này đƣợc thực hiện trong điều kiện vắng mặt oxy, lúc quá trình bơm đẩy không hoạt động ở hải miên. Ở hải miên Geodia barrette, ngƣời ta ƣớc tính đƣợc tỉ lệ khử sulphur là rất cao lên tới 1200nmol/cm 3 hải miên/ngày [22]. Các gen mã hoá cho enzyme APS (aprA)-một enzyme quan trọng trong việc khử sulphate và oxy hoá sulphur đƣợc tìm thấy ở hải miên nƣớc sâu Polymastia corticata thuộc biển Caribe [36]. Cả hai loại vi khuẩn oxy hoá sulphur và khử sulphate đều đƣợc phát hiện ở nhiều loài hải miên [50]. Vi khuẩn khử sulphate thuộc các chi Desulfoarculus, Desulfomonile. Chi Syntrophus đƣợc tìm thấy ở hải miên nƣớc lạnh Geodia barretti [22]. Quá trình oxy hoá metan cũng đƣợc tìm thấy ở nhiều loài hải miên đƣợc khảo sát. Chẳng hạn, loài hải miên ăn thịt sống ở vùng nƣớc sâu Cladorhiza methanophila đƣợc phát hiện có liên quan đến hai nhóm vi khuẩn, trong số đó có ít nhất một loại là vi khuẩn methane (methanotrophic) [52, 53]. Dehalogenation (khử halogen) cũng đƣợc chứng minh có xuất hiện ở hải miên có cộng sinh với vi sinh vật. Một số hải miên đƣợc biết là nguồn tự nhiên cung cấp các hợp chất brome nhƣ bromophenols và 15 bromoindoles. Ở hải miên Aplysina aerophoba khử halogen có thể đƣợc thực hiện qua trung gian là vi khuẩn [2]. Với lối sống dị dƣỡng, quá trình chuyển hoá cacbon ở hải miên có thể diễn ra bằng cách tiêu thụ trực tiếp vi khuẩn từ nƣớc biển hoặc sử dụng nguồn cacbon hữu cơ đƣợc hấp thu từ vi khuẩn cộng sinh với hải miên [62]. Trong môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng, hải miên vẫn có thể phát triển do cộng sinh với vi khuẩn quang hợp, đặc biệt là vi khuẩn lam Synechococcus spongiarum [14]. Ở khu vực có sự xuất hiện của những rạn san hô, nơi mà dinh dƣỡng hoà tan và các vật chất hữu cơ khan hiếm, hải miên sẽ phải đối mặt với môi trƣờng sống thiếu nitơ. Trong trƣờng hợp này, nhóm vi khuẩn tự dƣỡng (cyanobacteria) và dị dƣỡng cộng sinh với hải miên [60] sẽ là nguồn bổ sung nitơ cho hải miên thông qua quá trình cố định nitơ từ khí quyển [37]. Bằng chứng đầu tiên để kiểm định điều này là việc phát hiện ra hoạt tính của enzyme nitrogenase có trong hải miên đƣợc khảo sát ở Biển đỏ [60]. Bằng chứng tiếp theo đƣợc phát hiện trong những năm gần đây thông qua việc sử dụng kỹ thuật đo tỉ lệ đồng vị nitơ [59] và việc giải trình tự gen mã hoá cho enzyme nitrogenase ở vi khuẩn [37] đã cho thấy có sự xuất hiện quá trình nitrat hoá ở hải miên. Ngƣời ta cũng tìm thấy chi vi khuẩn Nitrosospira và Nitrosococcus oxy hoá ammonia thành nitrite ở hải miên [38]. Cổ khuẩn oxy hoá ammonia lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở hải miên Axinella mexicana thuộc vùng biển California. Vi khuẩn oxy hoá nitrite thành nitrate là Nitrospina và Nitrospira cũng đƣợc tìm thấy trong nhiều loài hải miên. Vi sinh vật liên kết với hải miên biển có vai trò chủ yếu trong việc bảo vệ vật chủ chống lại các loài ăn thịt do chúng sản sinh ra các chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học. Bên cạnh đó, nhóm vi khuẩn quang hợp cố định cacbon cung cấp đến gần 50% nhu cầu cacbon cho hải miên. Ngoài ra, có quan hệ cộng sinh với vi khuẩn quang hợp giúp hải miên nhận đƣợc một số sản phẩm từ quá trình quang hợp nhƣ glycerol. Ngƣợc lại, vi khuẩn sẽ đƣợc cung cấp giá thể và cơ chất từ hải miên mà nó có quan hệ 16 cộng sinh [6]. Một số vi sinh vật đƣợc cho là sinh các chất trao đổi thứ cấp có khả năng bảo vệ vật chủ. Các chức năng khác nhƣ loại bỏ các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất có hại. Đổi lại hải miên làm cho vi sinh vật có thể nhận đƣợc ánh sáng mặt trời, chỗ ẩn náu khỏi các loài săn mồi, cơ chất để bám và cung cấp dinh dƣỡng [58]. 1.2.2. Các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật liên kết hải miên Vi sinh vật liên kết với hải miên và một số vật chủ biển khác có cả nội bào và ngoại bào. Hiện nay, cộng đồng vi sinh vật ở hải miên và hệ gen của chúng chƣa đƣợc hiểu rõ. Ngƣời ta tin rằng rất nhiều sản phẩm của hải miên thực tế là do vi khuẩn liên kết với nó sinh ra. Ví dụ diketopiperazines của Tedania ignis đƣợc qui cho là sản phẩm trao đổi chất của Micrococcus sp. liên kết với hải miên. Kháng sinh polybrominated biphenyl ether tách từ hải miên Dysidea herbacea (Demospongiae) thực tế do cyanobacterium Oscillatoria spongeliae nội cộng sinh tạo ra. Vi khuẩn Salinispora phân lập từ hải miên P. clavata đƣợc nhận dạng là nguồn kháng sinh rifamycin. Ngƣời ta đã chứng minh đƣợc rằng vi sinh vật liên kết với hải miên sản sinh các chất có hoạt tính sinh học thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u, ức chế miễn dịchvà cũng có hoạt tính chữa bệnh tim, hô hấp và tiêu hóa (Grasa et al., 2013). - Các chất có hoạt tính kháng khuẩn. Polyketide synthases (PKS) và Non ribosomal peptide synthases (NRPS) tham gia sản xuất rất nhiều các sản phẩm tự nhiên. NRPS liên quan đến tạo ra một số thuốc chống khối u, ức chế miễn dịch, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, và hàng trăm các sản phẩm tự nhiên, gồm các hợp chất giảm cholesterol lovastatin là từ PKS (Brakhage, 2013). Yung và cs (2010) đã sử dụng Metagenomics chức năng để sàng lọc các protein kháng khuẩn mới từ vi sinh vật liên kết với hải miên Cymbastela concentrica và đã chọn đƣợc 2 dòng là CcAb1 và CcAb2 có hoạt tính kháng Staphyloccus aureus và Alteromonas sp., cả hai dòng đều thuộc lớp Gammaprotebacteria. Các tác giả cũng 17 nhận diện đƣợc các enzyme thủy phân mới từ cộng đồng vi sinh vật liên kết với hải miên và phần lớn chúng thuộc lớp Alphaproteobacteria và Gammaproteobacteria. Phần lớn các chất kháng khuẩn đƣợc nhận dạng bởi chọn lọc metagenomic là những phân tử nhỏ, chẳng hạn nhƣ palmitoylputrescine, violacein, turbomycin A và B, indirubin và indigo. Những nghiên cứu trƣớc đây cũng tìm thấy các enzyme lipolytic mới bằng sàng lọc thƣ viện gen metagenomic của vi sinh vật liên kết hải miên Aplysina aerophoba và Hyrtios erecta (Karpushova et al., 2005; Okamura at al. 2010). Lipases tác động lên lipids giải phóng acid béo có độ dài khác nhau, chúng đƣợc biết có phổ đối kháng vi sinh vật rộng. Phƣơng thức hoạt động của chúng đƣợc cho là liên quan đến các đặc tính tẩy (detergent) của các acid này, cho phép chúng tạo các lỗ nhỏ hoặc ở nồng độ cao làm cho tế bào bị tiêu bởi màng tế bào bị phân hủy (Desbois et al. 2010). Sử dụng phƣơng pháp chọn lọc chức năng từ thƣ viện metagenomic hải miên biển Nhật Bản Discodermia calyx đã phân lập đƣợc cyclodipeptides có hoạt tính kháng khuẩn (He et al., 2013). - Các chất có hoạt tính ức chế protease Protease là enzyme có các chức năng cần thiết trong rất nhiều con đƣờng truyền tín hiệu, sự phát triển của một số loại ung thƣ cũng nhƣ các bệnh truyền nhiễm. Khoảng 32 chất ức chế protease hiện đang sử dụng trong lâm sàng, phần lớn cho đến nay là tổng hợp hóa học và đƣợc thiết kế dựa trên cấu trúc. Miraziridine A, chất ức chế cathepsins B và L đƣợc phân lập từ hải miên biển Theonella mirabilis. Các chất ức chế enzyme đƣợc chú ý nhƣ một công cụ hữu hiệu, không những để nghiên cứu cấu trúc enzyme và cơ chế tác động mà còn có tiềm năng sử dụng trong dƣợc học và nông nghiệp. Các chất ức chế protease là công cụ mạnh để bất hoạt các proteases đích trong quá trình gây các bệnh ở ngƣời nhƣ khí thũng (emphysema), viêm khớp (arthritis), nghẽn mạch (throbosis), huyết áp cao, loạn dƣỡng cơ, ung thƣ và AIDS (Wahyudi et al., 2010). Abdelmohsen và cs (2012) đã tách đƣợc Diazepinomicin từ chủng Micromonospora sp. RV115 liên kết với hải miên Aplysina aerophoba (Croatia) có 18 hoạt tính không những kháng khối u phổ rộng, mà còn có khả năng chống ôxy hóa và ức chế protease. Ba chủng vi khuẩn SAB S-2; SAB 17; SAB S-21 đƣợc phân lập từ hải miên Jaspis sp. có hoạt tính ức chế serine protease (subtilisin), metalloprotease (thermolysin) và dịch chiết thô của vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus (tụ cầu khuẩn) và Pseudomonas aeruginosa (Trực khuẩn mủ xanh). Chủng SAB S-2 tƣơng đồng với Providencia dựa trên trình tự gen 16S rRNA; chủng SAB 17 – Pracoccus và SAB S-21- Bacillus sp. Một sản phẩm tự nhiên khác có hoạt tính ức chế protease là các dẫn xuất của tetromycins 1-4 đƣợc tách từ xạ khuẩn Streptomyces axinellae Po1001T liên kết với hải miên Axinella polypoides ở biển Mediterranean. Các sản phẩm tự nhiên này có hoạt tính ức chế một vài cystein proteases [36]. - Các chất có hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư. Dịch chiết ethyl acetate của nấm Eurotium cristatum phân lập từ hải miên Mycale sp. đã đƣợc nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học. Kết quả nhận đƣợc cho thấy dịch chiết thô có hoạt tính ức chế sinh trƣởng của 3 dòng tế bào ung thƣ: ung thƣ vú, ung thƣ phổi và ung thƣ da-tế bào hắc tố (melanoma) (Almeida et al., 2010). Có thể tìm thấy trong hải miên Discodermia dissoluta và Theonella swinhoei các hợp chất chống ung thƣ discodermolide, onnamide và theopederin. Ngoài ra, vi khuẩn Salinispora phân lập từ hải miên Pseudoceratina clavata đƣợc nhận dạng là nguồn kháng sinh rifamycin, đƣợc sản xuất bởi hệ PKS. Kháng sinh polybrominated biphenyl tách từ hải miên Dysidea herbacea thực tế do cyanobacterium Oscillatoria spongeliae nội cộng sinh tạo ra. Lên men chủng nấm lớp Hyphomycetes đƣợc phân lập từ hải miên Jaspis affjohnstoni thu đƣợc tricyclic sesquiterpenes coriolin B, dihydrocoriolin C cũng nhƣ chloriolines A-C mới. Coriolin B có hoạt tính ức chế ung thƣ vú mạnh và dòng tế bào CNS, với IC50 0.7 µg (vú) và 0.5 µg (neuroblastoma) (Thomas et al., 2010). Một taxa thú vị khác liên kết với hải miên có tầm quan trọng dƣợc học là Cyanobacteria nhƣ: 19 Lyngbya, Oscillatoria, Symploca, Calothrix, Leptolyngbya, Dichothrix, Geitlerinema, Schizothrix, Aphanothece, Blennothrix, và Synechocystis (Tabares, 2011). 1.3. Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết với hải miên Bằng công nghệ sinh học phân tử không phụ thuộc nuôi cấy, kính hiển vi và kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật, ngƣời ta đã phát hiện có sự liên kết của các loài thuộc ba giới là Bacteria, Archaea và Eukarya với hải miên (Taylor et al., 2007). Các quần thể vi sinh vật khác sống trong hải miên còn có vi nấm và vi tảo. Sự đa dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay đổi các điều kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hƣởng đến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa. Vi sinh vật liên kết với hải miên có cả nội bào và ngoại bào [7] [8]. Cộng đồng vi sinh vật này đặc hiệu cho hải miên. Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bằng các phƣơng pháp nhƣ điện di gel gradient biến tính (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis_DGGE), giải trình tự gen 16S rRNA và lai huỳnh quang in-situ (Fluorescense In Situ Hybridization_FISH), ngƣời ta nhận thấy ngoài các thành viên của Archaea còn có tới hơn 25 ngành vi khuẩn liên kết với hải miên. Trong số đó có Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và Verrucomicrobia. Chƣa rõ về virus trong hải miên, mặc dù các hạt giống nhƣ virus đƣợc phát hiện trong nhân tế bào của Aplysina (Verongia) cavernicola. Ở Việt Nam, chỉ có một số nghiên cứu về thành phần hải miên ở vịnh Hạ Long, Nha Trang cho thấy thành phần loài của chúng rất đa dạng [1], [2]. Có hai con đƣờng để hải miên tạo nên vi khuẩn liên kết, một là hấp thu vi khuẩn đặc hiệu từ nƣớc xung quanh khi nƣớc đi qua hải miên trong quá trình ăn lọc và hai là truyền thẳng vi khuẩn thông qua giao tử (gametes) của hải miên bằng cách đƣa cả vi khuẩn vào noãn bào (oocytes) hoặc ấu trùng (larvae) (Wang et al., 2006; Li et al., 2007). 20 Hình 1.4: Đa dạng vi khuẩn liên kết với hải miên (Tabares 2011). Sự phân bố tổng thể của vi khuẩn ở hải miên dƣờng nhƣ đi theo một mẫu chung. Ở các lớp bên ngoài tiếp xúc với ánh sáng thƣờng đƣợc liên kết với các sinh vật quang hợp, vi khuẩn lam và tảo nhân chuẩn (Wilkinson, 1992). Các mesohyl chứa phần lớn các vi sinh vật, cả dị dƣỡng và tự dƣỡng, thƣờng liên kết ở ngoại bào (Hentschel et al., 2006). Trong một số trƣờng hợp xuất hiện các vi sinh vật có ở trong tế bào thậm chí ngay trong nhân tế bào của một số hải miên (Vacelet và Gallissian, 1978; Friedrich et al., 1999). Một số hải miên, đặc biệt là demosponges đƣợc liên kết dày đặc bởi nhiều tế bào vi khuẩn (từ 108 – 1010 tế bào vi khuẩn trên 1g trọng lƣợng hải miên tƣơi) đƣợc gọi là hải miên có đa dạng vi khuẩn cao („high-microbial-abundance‟ (HMA) sponges) (Hình 1.5a) (Hentschel et al., 2006). Ngƣợc lại các loài hải miên liên kết với vi sinh vật ở mật độ thấp hơn (105 – 106 tế bào vi khuẩn trên 1g trọng lƣợng hải miên tƣơi) (Hentschel et al., 2006) đƣợc gọi là hải miên có đa dạng vi khuẩn thấp („low-microbial abundance (LMA) sponges‟) (Hình 1.5b). HMA và LMA có thể cùng tồn tại trong môi trƣờng 21 sống giống nhau nhƣng lý do cho những khác biệt trong sự phong phú của vi sinh vật vẫn chƣa đƣợc biết đến. Hình 1.5: Mô mesohyl của (A) Ancorina alata, hải miên có đa dạng vi khuẩn liên kết cao (HMA); (B) Polymastia sp, có đa dạng vi khuẩn liên kết thấp (LMA). Mũi tên chỉ ra các tế bào vi khuẩn Polymastia sp. (S. Schmitt; Kamke et al., 2010). Tài nguyên biển vô cùng đa dạng và ẩn chứa nhiều tiềm năng có ích cho đời sống con ngƣời. Vì vậy việc nghiên cứu về mối liên hệ giữa vi sinh vật với hải miên đã và đang tiếp tục đƣợc thực hiện bởi các nhà khoa học cả ở trong nƣớc và trên thế giới. *) Trên thế giới Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử không phụ thuộc nuôi cấy, rất nhiều nghiên cứu đã khảo sát tính đa dạng của vi sinh vật cộng sinh với hải miên ở các hệ sinh thái biển khác nhau và một số tác giả thấy rằng vi khuẩn liên kết với hải miên bền vững theo không gian và thời gian. Nhƣng kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác lại không thống nhất với giả thuyết này. Chẳng hạn, Cymbastela concentric có cộng đồng vi sinh vật ít thay đổi giữa các khoảng cách địa lý nhỏ, cộng đồng vi sinh vật ở vùng ôn đới khác với cộng đồng vi sinh vật trong Cymbastela concentric thuộc vùng nhiệt đới của Australia (Hill et al., 2006; Ouyang et al., 2009). Những nghiên cứu phát sinh loài đã nhận diện đƣợc 26 ngành vi khuẩn khác nhau liên kết hải miên biển, trong đó ngành Poribacteria hầu nhƣ chỉ tìm thấy trong hải miên [15], điều này cho thấy thành phần vi sinh vật liên kết hải miên biển rất phức tạp. Theo 22 Schmitt et al. (2012) [15], các loài hải miên khác nhau chứa quần thể vi khuẩn gồm các loài khác nhau (quần thể đặc trƣng loài) và có quần thể nòng cốt. Nhƣng các loài vi khuẩn trong các loài hải miên khác nhau vẫn có mối quan hệ gần hơn so với các loài vi khuẩn ở môi trƣờng nƣớc xung quanh. Li et al. (2006) [8] đã sử dụng phƣơng pháp đánh dấu diện di gel gradien biến tính gen 16S rDNA (16S rDNA-DGGE fingerprinting) không qua nuôi cấy, phân tích phát sinh loài và sự đa dạng của cộng đồng vi sinh vật liên kết với 4 loài hải miên Stelletta tenui, Halichrondria, Dysidea avara và Craniella australiensis ở biển nam Trung Quốc. Kết quả cho thấy, Proteobacteria (α, β và γ) là những vi khuẩn chiếm ƣu thế và có lẽ có quan hệ cộng sinh mật thiết với hải miên. Hải miên Craniella australiensis có sự đa dạng vi sinh vật lớn nhất, với 4 ngành vi khuẩn là Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes và Actinobacteria; tiếp đến là Dysidea avara với 2 ngành Proteobacteria và Bacteroidetes; và hải miên Stelletta tenui, Halichrondria với ngành Proteobacteria. Lee et al. (2009) [7] đã sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy và không nuôi cấy để đánh giá liệu hải miên cùng loài hoặc cùng chi quanh đảo San Juan (Washington) có các quần thể vi sinh vật đặc hiệu hay không. Kết quả cho thấy, quần thể vi sinh vật liên kết Myxilla incrustans và Haliclona rufescens rất giống nhau, trong khi với loài Halichondria panacea lại rất khác [7]. Thú vị là thành viên của Poribacteria - ứng viên đặc hiệu ở hải miên có rất ít trong nƣớc biển dẫn đến giả định Poribacteria là thành viên hiếm hoi trong sinh quyển biển có thể là những mầm giống cho vi khuẩn liên kết hải miên biển. Những ngành (phyla) vi khuẩn liên kết hải miên hay gặp là Acidobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Nitrospira và Proteobacteria. Nghiên cứu trình tự khu hệ vi sinh vật liên kết hải miên đƣợc công bố vào năm 2011 [Lee et al, 2011]. Phân tích 3 hải miên từ Red sea, nghiên cứu đã tăng các ngành vi khuẩn phát hiện trong hải miên biển lên 30. Nhƣng thú vị hơn là cặp mồi sử dụng nhắm 23 tới cả gen 16S rRNA của vi khuẩn và cổ khuẩn. Mẫu hải miên Raspailia ramose của Ireland có khu hệ vi sinh vật rất phong phú, trong khi đó hải miên Stelligera stuposa tại cùng điểm lấy mẫu có sự đa dạng ít hơn [Jackson et al., 2012]. Khu hệ vi sinh vật của hải miên có tính đặc hiệu theo vùng và loài, nhƣng nghiên cứu của Schmitt và cs (2012) cho thấy có sự liên kết vi sinh vật – hải miên đặc hiệu cho vùng nhiệt đới, vì các mẫu hải miên ở các điểm rất xa nhau về địa lý có sự tƣơng đồng lớn về khu hệ vi sinh vật liên kết với chúng. White và cs (2012) nghiên cứu sự thay đổi khu hệ vi sinh vật liên kết hải miên theo mùa nhƣng thấy rằng hầu nhƣ chúng không thay đổi. Phƣơng thức chính để giữ mối quan hệ cộng sinh giữa vật chủ không xƣơng sống và vi sinh vật hoặc là truyền ngang hoặc dọc hoặc cả hai. Ở hải miên biển đƣợc cho là tồn tại cả 2 cách này. *) Một số nghiên cứu trong nước Những năm gần đây, Việt Nam đã xúc tiến một số chƣơng trình nghiên cứu và giám sát đa dạng sinh học biển, đặc biệt là sự hợp tác lâu năm với Viện hàn lâm Khoa học Nga và các chuyến đi biển dài ngày của tàu Oparin nhằm thu thập mẫu vật tại các vùng biển của Việt Nam. Các nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ động vật biển nhƣ hải miên, san hô mềm cũng đƣợc tiến hành tại một số cơ sở nghiên cứu. Từ hải miên Spongia sp. của Việt Nam đã tách chiết đƣợc sesquiterpene quinines với hoạt tính chống oxy hoá (Utkina & Deniseko 2011), C29-Sterols từ hải miên Ianthella sp. có đặc tính chống ung thƣ (Nguyen Huu Tung et al. 2009). Từ hải miên biển Việt Nam Xestospongia testudinaria đã phân lập đƣợc 3 C29 sterol mới, xác định cấu trúc và khả năng ức chế sự bám dính của Pseudoalteromonas spp. và Polaribacter sp. (Xuan Cuong Nguyen et al., 2013). Viện Hoá sinh biển có hợp tác với KORDI Hàn Quốc: “Nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ các đối tƣợng san hô mềm và hải miên thu thập tại Hạ Long, Quảng Ninh”. Nghiên cứu thành phần hoá học 24 một số loài hải miên và vi sinh vật cộng sinh thuộc biển Việt Nam với đối tác Pháp và Bảo tàng lịch sử thiên nhiên quốc gia Pháp. Các nghiên cứu về hải miên tại Việt Nam còn hạn chế và chƣa có nghiên cứu nào về hệ vi sinh vật liên đới với hải miên cũng nhƣ phát hiện các chất có hoạt tính sinh học từ hệ vi sinh vật này, đặc biệt là việc sử dụng kỹ thuật metagenomics để phát hiện và sàng lọc các gen có hoạt tính sinh học từ nguồn môi trƣờng tiềm năng này. 1.4. Sơ lƣợc về gen 16S rRNA Là đoạn trình tự tƣơng đối ngắn, bảo thủ và đặc trƣng cho mỗi loài. Những khảo sát về gen trên rRNA đƣợc thực hiện trực tiếp từ DNA môi trƣờng đã cho thấy, số lƣợng loài vi khuẩn và vi khuẩn cổ đã tìm thấy trƣớc đây bằng phƣơng pháp giải trình tự truyền thống chỉ tƣơng đƣơng khoảng 1% số lƣợng thực của chúng trong môi trƣờng. Gen 16S rRNA là thành phần của bộ máy tổng hợp protein có từ lâu đời. Hơn nữa, các rRNA là những phân tử có chức năng không thay đổi, phân bố ở hầu hết các hệ thống sống và có độ bảo tồn vừa phải cho phép phản ánh sự liên quan tiến hoá giữa các loài sinh vật. Zuckerkand và Pauling (1967) cho rằng 16S rRNA có các đặc điểm phù hợp làm thƣớc đo tiến hoá vì: (i) phân tử có mặt ở tất cả các sinh vật khảo sát; (ii) phân tử không truyền qua lại giữa các loài; (iii) trình tự của phân tử có độ bảo tồn và biến động thích hợp trong khoảng cách tiến hoá khảo sát; (iv) phân tử có kích thƣớc đủ lớn để chứa nhiều thông tin. Mặc dù các tRNA có mặt ở hầu hết các vi sinh vật nhƣng chúng không đƣợc chọn làm thƣớc đo tiến hoá do kích thƣớc quá nhỏ (75 ribonucleotides). Ba loại rRNA là thành phần của ribosome đều có một số tính chất để có thể đƣợc chọn làm thƣớc đo tiến hoá. Tuy nhiên chỉ có 16S rRNA là sự lựa chọn phù hợp cho các nghiên cứu hiện nay do có kích thƣớc vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotides). Còn lại 5S có kích thƣớc quá nhỏ (khoảng 120 ribonucleotides), mang ít thông tin của quá trình tiến hoá nên ít đƣợc chọn. 23S rRNA là phân tử có kích thƣớc lớn (khoảng 2900 25 ribonucleotides), nên hiện không mấy thuận lợi cho việc nghiên cứu. Phân tử 16S rRNA đƣợc coi nhƣ “tiêu chuẩn vàng” cho phân loại học. Tuy nhiên, do RNA dễ bị phân huỷ nên cần phải rất cẩn trọng trong thao tác, vì vậy khuynh hƣớng hiện nay là sử dụng gene 16S rDNA mã hoá cho RNA trong các nghiên cứu. Gene 16S rRNA của các vi khuẩn thuộc nhóm Eubacteria có một đặc điểm rất đặc biệt là có những vùng bảo tồn cao ở cấp độ của nhóm xen kẽ những vùng biến động khác nhau giữa các loài trong cùng nhóm này. Tuy là những vùng biến động, nhƣng những vùng này lại là những vùng bảo tồn ở cấp độ loài. Sự bảo tồn và biến động ở các cấp độ khác nhau đã giúp cho gen 16S rRNA luôn là sự lựa chọn đầu tiên của các nhà nghiên cứu khi tiến hành định danh vi khuẩn hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn. Ở prokaryote, gene 16S RNA ribosome (rRNA 16S) dài khoảng 1.500 bp và chứa chín vùng biến đổi rải rác giữa các vùng bảo thủ. Vùng biến đổi 16S rRNA thƣờng đƣợc sử dụng trong phân loại phát sinh loài nhƣ chi hoặc loài trong đa dạng quần thể vi sinh vật. Hình 1.6: Gene 16S rRNA có 9 vùng biến đổi nằm xen giữa các vùng bảo thủ. 1.5. Sơ lƣợc về MiSeq Sequencing Platforms Illumina là họ sản phẩm đƣợc sử dụng rộng rãi nhất. Kỹ thuật đƣợc đƣa ra vào năm 2006 và nhanh chóng đƣợc các nhà khoa học sử dụng bởi có thể tạo ra lƣợng lớn số liệu với chi phí hiệu quả hơn. Theo thời gian, chiều dài read đƣợc tăng lên và những ngƣời thƣờng sử dụng 454 đã chuyển sang Illumina platform do hiệu quả kinh tế của kỹ thuật này. Mặc dù phƣơng pháp giải trình tự bằng tổng hợp nhƣ của 454, nhƣng phƣơng pháp Illumina có 2 điểm nổi bật khác với 454: (1) sử dụng flow cell với 26 vùng đính oligo, thay cho chip chứa các vi giếng (microwell) riêng lẻ có hạt và (2) nó không liên quan đến pyrosequencing, mà kết thúc bằng thuốc nhuộm thuận nghịch. Phƣơng pháp kết thúc bằng thuốc nhuộm giống nhƣ giải trình tự Sanger, nhƣng khác là chúng thuận nghịch vì vậy chúng đƣợc gỡ bỏ sau mỗi chu kỳ để tiếp tục kết thúc cho nucleotide tiếp theo. Chuẩn bị giải trình tự đƣợc bắt đầu với các đoạn DNA có các bộ chuyển đổi (adapter) đặc hiệu ở một đầu, chúng đi qua qua flow cell có các oligonucleotides cụ thể và lai với đầu cuối của đoạn DNA. Mỗi đoạn DNA sau đó tái tạo (replicate) để tạo thành cụm các đoạn giống nhau. Các nucleotides mầu kết thúc thuận nghịch sau đó chảy qua flow cell và gắn vào đó. Nucleotides thừa bị rửa trôi, flow cell đƣợc tạo hình ảnh và các chất kết thúc thuận nghịch, vì vậy quá trình có thể nhắc lại và nucleotides có thể tiếp tục đƣợc thêm vào trong các chu kỳ tiếp theo. Hiện nay, read dài nhất mà platform Illumina tạo ra là trên MiSeq, các read có đuôi kết đôi (paired-end) là 300 bp. Hiểu biết của chúng ta về vi sinh vật trong các môi trƣờng tự nhiên rất hạn chế và việc nghiên cứu đa dạng sinh học trong tự nhiên không phải nhiệm vụ dễ dàng. Trong các hệ sinh thái tự nhiên, vi sinh vật tồn tại với mật độ cao mặc dù rất nhiều loài hiện chƣa đƣợc mô tả. Vi sinh vật thích nghi với hầu hết các loại môi trƣờng trên trái đất và có các hoạt tính sinh học đa dạng tùy thuộc vào môi trƣờng sống. Câu hỏi quan trọng khi nghiên cứu vi sinh vật trong môi trƣờng tự nhiên của chúng là: các cộng đồng vi sinh vật hoạt động nhƣ thế nào và sự thay đổi về chất trong cộng đồng xảy ra do sự thay đổi môi trƣờng nhƣ thế nào. Có rất nhiều phƣơng pháp mô tả đa dạng vi sinh vật nhƣ phƣơng pháp sinh hóa, nuôi cấy, phân tích acid béo phospholipid..., các phƣơng pháp sinh học phân tử nhƣ lai acid nucleic, đa hình chiều dài các đoạn giới hạn (RFLP), đa hình chiều dài các đoạn giới hạn cuối (T-RFLP), DNA microarrays, điện di gradient biến tính (DGGE) hoặc điện di gradient nhiệt độ (TGGE), đa hình thể cấu tạo sợi đơn (SSCP)... 27 Với sự ra đời của giải trình tự thế hệ mới (NGS), khả năng phát hiện các nhóm vi sinh vật mới trong các hệ môi trƣờng phức tạp mà khô