Đề tài Chiết xuất và phân lập Acid Glycyrrhizic từ Cam thảo

sự hấp thu mạnh. V trong hình 8 đại diện cho thể tích của phần di động, lượng nước tách ra do thắng được lực hấp thụ. Thể tích nước cố định là L. Với x, y là nồng độ tương ứng của GA trong L và V. Hình 8: Quá trình trao đổi của GA giữa bột nguyên liệu và dung môi chiết. Trong suốt quá trình MCE, L ở mỗi bình chiết có thể được xem như là một “giai đoạn” (staged) của pha tĩnh được chiết xuất liên tục bởi dòng dung môi V ở trên. Sau khi kết thúc quá trình chiết xuất, phần bã dược liệu được lấy khỏi bình chiết. Dung môi mới được thêm vào từ cuối của giai đoạn chiết thứ N, mà sau đó sẽ chảy từ phải sang trái và cuối cùng được lấy ra như là một sản phẩm chiết của giai đoạn chiết thứ nhất. Giả sử trong mỗi quá trình chiết đều đạt được trạng thái cân bằng ở mỗi giai đoạn, thì nồng độ GA của dung môi sẽ bằng với nồng độ GA còn lại trong bã dược liệu. Ta có: xi = yi (1) Ở giai đoạn thứ nhất ta có: L(x0 − x1) = V(y1 − y2) (2) Gọi R là tỉ lệ của V và L. Và AW là thể tích của lượng nước cố định trên mỗi đơn vị khối lượng của mẫu cam thảo (ml/g). m là khối lượng của mẫu cam thảo (g) và n là tỉ lệ của dung môi và cam thảo (ml/g). Ta có phương trình (3): (3) Nếu Ki là hệ số phân bố của GA trong bột cam thảo và dung môi chiết thì Ki = yi / xi (i = 1, 2, … ,N) º 1 vì xi = yi. Khi đó hệ số chiết (tỉ lệ khối lượng của GA chiết được từ bột cam thảo) có thể được viết lại như sau: (4) Thế (1) (3) (4) vào (2) ta được phương trình (5): (5) Chứng minh tương tự ta có các phương trình sau: (6) (7) (8) Hiệu suất chiết (p), được định nghĩa là phần trăm khối lượng của GA chiết được từ tổng khối lượng của GA trong dược liệu cam thảo được tính như sau: (9) Đặt M = , H= . Thì phương trình (9) có thể đơn giản thành: (10) Bởi vì trong dung môi mới không có GA nên y0 = 0. Nên ta có: (11) Phương trình (11) cho thấy, hiệu suất chiết tỉ lệ thuận với M, hoặc có thể nói rằng hiệu suất chiết tỉ lệ thuận với n và tỉ lệ nghịch với AW. Ngoài ra hiệu suất chiết còn bị ảnh hưởng bởi các thông số khác như nhiệt độ, thời gian chiết, kích thước của mẫu cam thảo mà ảnh hưởng đến việc đạt được trạng thái cân bằng trong quá trình MCE và thời gian để đạt được việc cân bằng đó. Trong các thảo luận ở trên, ta thấy rằng AW (thể tích của lượng nước cố định trên mỗi đơn vị khối lượng của mẫu cam thảo (ml/g) là một biến cần được xác định để tính toán hiệu suất chiết lý thuyết. AW được xác định thực nghiệm bằng cách trộn tương ứng 10, 15, 20, 25g bột cam thảo (gọi là m) với 40, 60, 80 và 100ml nước (gọi là V1) trong 4 bình nón 150ml. Giữ hỗn hợp trên ở nhiệt độ phòng (29°C) trong 60 phút. Phần nước không được hấp thu vào bột cam thảo được gọi là V2, đo bằng bình lắng gạn. AW (ml/g) được tính như sau: AW = (V1–V2)/m. Các giá trị đo được được liệt kê trong Bảng 2: Bảng 2: AW thực nghiệm của cam thảo Khối lượng cam thảo, m (g) 10 15 20 25 Lượng nước thêm vào, V1 (ml) 40 60 80 100 Lượng nước gạn ra, V2 (ml) 20 35 46 55 AW (ml/g) 2,0 1,7 1,7 1,8 Từ dữ liệu thu được ta có AW trung bình là 1,8ml/g. Bởi vì rất khó để gạn hết lượng nước không được hấp thu trong quá trình thử nghiệm, nên thể tích thật của lượng nước không được hấp thu hơi lớn hơn những số liệu đã được liệt kê. Trong các tính toán của phương trình (11) ta sẽ sử dụng một giá trị xấp xỉ của AW = 2,0 ml/g. Giả sử rằng quá trình chiết đạt trạng thái cân bằng, hiệu suất chiết lý thuyết tính theo phương trình (11) ở các giai đoạn khác nhau với các tỉ lệ dung môi / dược liệu được liệt kê trong Bảng 3: Bảng 3: Hiệu suất chiết (% khối lượng) ở các giai đoạn Tỷ lệ dung môi / dược liệu (ml/g) Giai đoạn chiết thứ 1 2 3 4 5 6 67,70 85,70 93,30 96,70 98,40 8 75,00 92,30 97,50 99,17 99,70 10 80,00 95,20 98,80 99,70 99,90 Tối ưu hóa quá trình MCE. Các thảo luận ở trên cho ta thấy rằng số giai đoạn (N), tỉ lệ dung môi/dược liệu (n), nhiệt độ chiết (T) và thời gian chiết (t) là những yếu tố chính ảnh hưởng hiệu suất chiết trong phương pháp MCE. Hiệu quả chiết sẽ được đánh giá bằng ba chỉ số xác định sẽ được thảo luận sau đây. Đầu tiên là hiệu suất chiết của GA (được định nghĩa là phần trăm khối lượng của GA chiết ra được từ lượng GA có trong mẫu cam thảo thô). Ở đây tổng lượng GA có trong mẫu cam thảo thô được xác định bằng cách chiết xuất hoàn toàn, lặp đi lặp lại mẫu khô của cam thảo thô bằng phương pháp chiết siêu âm và sau đó định lượng bằng HPLC (3,72% như đã được nói đến ở 2.1.1.1.1). Chỉ số thứ hai là nồng độ cuối cùng của GA trong dịch chiết, bao gồm cả số lượng và chất lượng của GA chiết được trong cả quá trình chiết. Chỉ số cuối cùng là tốc độ, là thời gian cần thiết để đạt được hiệu suất cần thiết. Để tối ưu hóa các điều kiện trong quá trình chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn, phương pháp thiết kế mảng trực giao (orthogonal array design) được sử dụng, là một kỹ thuật thiết kế thử nghiệm giai thừa phân số (fractional factorial experimental design technique). Trực giao ở đây có nghĩa là cân bằng, có thể tách rời hoặc không có trộn lẫn, tức là trong khi một tác dụng của một yếu tố đặc biệt đang được tính toán thì ảnh hưởng của các yếu tố khác được loại bỏ. Do đó ảnh hưởng của riêng yếu tố đó được chọn ra một cách độc lập. Phương pháp thiết kế thử nghiệm mảng trực giao (orthogonal array design) được áp dụng là L9 (34): 4 yếu tố và 3 cấp độ. Thiết kế chi tiết được liệt kê trong Bảng 4. Kết quả của phương pháp thử nghiệm này sau khi được phân tích bằng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) được tóm tắt trong Bảng 5 và Bảng 6. Bảng 4: Các yếu tố và cấp độ của phương pháp thử nghiệm trực giao L9 (34) Cấp Các yếu tố A, N B, n (ml/g) C, T (°C) D, t (phút) 1 5 6 30 60 2 3 10 50 30 3 7 8 70 90 Bảng 5: Thiết kế và kết quả của thử nghiệm trực giao. No. A B C D p(%) y (µg/ml) 1 1 1 1 1 44 255,1 2 1 2 2 2 82 259,8 3 1 3 3 3 98 347,3 4 2 2 3 1 100 284,5 5 2 3 1 2 35 122,6 6 2 1 2 3 94 349,9 7 3 3 2 1 93 292,9 8 3 1 3 2 87 412,3 9 3 2 1 3 67 190,4 p (%) K1/3 75 75 49 79 K2/3 76 83 90 68 K3/3 82 75 95 86 r 7 8 46 18 Tối ưu A3B2C3D3 y (µg/ml) K1/3 287 339 189 278 K2/3 252 245 301 265 K3/3 299 254 348 296 r 46 94 159 31 Tối ưu A3B1C3D3 Bảng 6: Kết quả phân tích ANOVA Nguồn Tổng bình phương của phương sai Bậc tự do Ước lượng của phương sai Chỉ số F Tầm quan trọng p y p y p y p y p Y N 98 3488 2 2 49 1744 1,0 2,4 - n 122 16158 2 2 61 8079 1,2 11,1 * T 3856 39832 2 2 1928 19916 39,3 27,4 ** ** t 511 1455 2 2 255 727 5,2 1,0 - Error 98 1455 2 2 49 727 Total 4587 60933 8 8 2293 30466 F0.01 (2, 2) =99.00 (***); F0.05 (2,2) = 19.00 (**); F0.1 (2, 2) = 9.00 (*). Bảng 5 và Bảng 6 chỉ ra rằng phương pháp MCE được dùng để chiết GA từ cam thảo chịu ảnh hưởng lớn bởi yếu tố nhiệt độ. Hiệu suất chiết và nồng độ GA trong dịch chiết thu được đều tăng đáng kể khi gia tăng nhiệt độ, được biểu thị bằng giá trị F rất cao 39,3 và 27,4 trong Bảng 6. Có thể là do GA dễ dàng hòa tan trong nước nóng và rất khó hòa tan trong nước mát. Quá trình chiết không thể đạt được trạng thái cân bằng khi nhiệt độ chiết nhỏ hơn 70°C. Bảng số liệu trên cũng cho ta thấy khi tăng tỉ lệ dung môi/dược liệu, nồng độ GA trong dịch chiết giảm đáng kể từ 339µg/ml ở tỉ lệ 6ml/g xuống còn 245µg/ml ở tỉ lệ 10ml/g, trong khi hiệu suất chiết chỉ chênh lệch một khoảng nhỏ 75% - 83%. Hiệu suất chiết và nồng độ GA trong dịch chiết chỉ tăng nhẹ khi ta tăng thời gian chiết, như đã được liệt kê ở Bảng 5. Khi tăng nhiệt độ từ 60 đến 90 phút hiệu suất chiết chỉ tăng 7% tức là từ 79% đến 86%. Vì vậy việc tăng thời gian chiết vượt quá 60 phút không mang đến lợi nhuận nhiều. Số giai đoạn chiết cũng ảnh hưởng rất ít đến hiệu suất chiết và nồng độ GA trong dịch chiết, như đã được chỉ ra trong Bảng 6 với chỉ số F chỉ là 1,0 và 2,4. Theo như các số liệu trong Bảng 3 thì với tỉ lệ dung môi/dược liệu là 6ml/g thì hiệu suất chiết lý thuyết đạt 98,4% với 5 giai đoạn, nhưng chỉ có 93,3% ở 3 giai đoạn. Vì vậy ta chọn số giai đoạn là 5 để được hiệu suất chiết cao hơn. Tóm lại điều kiện tối ưu của qui trình chiết xuất GA bằng phương pháp MCE là A1B1C3D1. Trong đó A1 biểu thị cho số giai đoạn chiết là 5, B1 biểu thị cho tỉ lệ dung môi/dược liệu là 6ml/g, C3 biểu thị cho nhiệt độ chiết là 70°C và D1 biểu thị cho thời gian chiết là 60 phút. Ảnh hưởng của dung môi lên hiệu suất chiết GA. Các thuộc tính của dung môi được sử dụng để chiết và kết quả chiết được liệt kê trong Bảng 7. Các điều kiện tối ưu đã thảo luận ở trên được sử dụng để chiết GA bằng phương pháp MCE với bốn hệ dung môi khác nhau, cụ thể là nước tinh khiết (SW), 10% về khối lương của Ethanol trong nước (SE), 10% về khối lượng của Ethanol và 0,5% về khối lượng của Amoniac trong nước (SEA) và 0,5% về khối lượng của Amoniac trong nước (SA). Kết quả trong Bảng 7 chỉ ra rằng không có sự khác biệt đáng kể về hiệu suất chiết của 4 hệ dung môi được thử nghiêm. Chính vì vậy nước tinh khiết được lựa chọn làm dung môi chiết vì cả tính an toàn lẫn tính kinh tế. Bảng 7: Hiệu suất chiết GA bằng các hệ dung môi khác nhau Dung môi SW SE SEA SA Hiệu suất chiết (% khối lượng) 97,2 97,8 98,3 98,6 So sánh với các phương pháp chiết khác. Bảng 8 so sánh hiệu suất chiết giữa phương pháp MCE với các phương pháp chiết xuất khác thường sử dụng trong phòng thí nghiệm. Dung môi được sử dụng là nước tinh khiết. Hiệu suất chiết của phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn (97,2%) là cao nhất trong số tất cả các phương pháp, mặc dù thời gian chiết của phương pháp này (60 phút) cao hơn phương pháp MAE (54 phút) và USE (40 phút) nhưng vẫn còn thấp hơn nhiều so với phương pháp SHE (240 phút) và RTE (2660 phút). Lượng dung môi tiêu thụ trên mỗi đơn vị khối lượng của dược liệu của phương pháp chiết xuất ngược dòng nhiều giai đoạn (6ml/g) cũng ít hơn nhiều so với các phương pháp khác (16ml/g). Bảng 8: So sánh các phương pháp chiết MCE, MAE, USE, SHE VÀ RTE Phương pháp Dung môi sử dụng (ml/g) Thời gian chiết (phút) Hiệu suất chiết (%) MCE 6 60 97,2 MAE 16 54 86,6 USE 16 40 93,8 SHE 16 240 87,3 RTE 16 2660 87,3 So sánh phương pháp MCE với phương pháp chiết xuất một giai đoạn (SPE) có thể thực hiện bằng cách xem xét lại dữ liệu đã được liệt kê trong Bảng 3. Hiệu suất chiết của MCE là cao hơn đáng kể so với hiệu suất chiết của SPE ở tất cả các tỉ lệ dung môi/dược liệu. Chiết bằng SPE với nhiều chu kì thì năng suất tăng có giới hạn trong khi tốn kém rất lớn về chi phí và thời gian. Ví dụ ở tỉ lệ dung môi/dược liệu là 6ml/g, hiệu suất chiết của MCE là 98,4% so với hiệu suất chiết của SPE chỉ 67,7% trong cùng thời gian chiết. Lặp lại thêm một lần nữa với phương pháp chiết SPE thì hiệu suất năng lên 85,7%, nhưng lại tăng gấp đôi thời gian và lượng dung môi sử dụng. Thể tích dung môi sử dụng cao hơn kéo theo việc gia tăng chi phí và làm giảm nồng độ của sản phẩm chiết được. Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ vi ba (Microwave –assisted extraction)[7]. Thiết kế thí nghiệm. Nguyên vật liệu: Rễ Cam thảo (Glycyrrhiza uralensis Fisch) mua từ công ty Tongrentang medical. Nguyên liệu được chuẩn bị với 3 kích cỡ khác nhau, được thực hiện trong phòng thí nghiệm. Nguyên liệu A: có kích thước lớn khoảng 5 – 10 mm và bề dày khoảng 3 –5mm; nguyên liệu B: Bột cam thảo thô, được nghiền và rây chọn cỡ hạt khoảng 5 – 10 mesh; nguyên liệu C: Bột cam thảo 50 mesh. Dung môi. Ethanol ( analytical reagent), amonia (25% NH3, chemical reagent), glacial acetic acid (analytical reagent), acetonitrile ( dung môi cho sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC), glycyrrhizic ammoniate (mua từ Viện y học và sinh phẩm Trung Hoa). Ngoại trừ các thí nghiệm về ảnh hưởng của thành phần dung môi lên tỷ lệ glycyrrhizic acid chiết xuất được, tất cả các dung môi đều được cấu tạo gồm: 60% ethanol + 1% amonia + nước. Chiết xuất có hỗ trợ vi sóng: Lò vi sóng sử dụng trong gia đình (National, Japan, công suất cực đại 700W) được thiết kế lại với máy khuấy từ , sinh hàn, bộ phận ghi nhận nhiệt độ và kiểm soát thời gian. Rễ cam thảo được trộn với khoảng 100ml dung môi, như nước, ethanol, ethanol – nước, dung dịch amonia (với các nồng độ khác nhau) hoặc ethanol – nước – amonia. Hỗn hợp gồm rễ cam thảo và dung môi được chiếu xạ bằng lò vi sóng với điều kiện thiết kế: 15 giây chiếu xạ, 15 giây ngừng, lặp lại 3 lần; nhiệt độ khoảng 85 -90ºC sau đó chiếu xạ tiếp trong 3 giây để làm nóng và 15 giây ngừng chiếu xạ để làm mát, nhưng không được để quá sôi. bộ phận kiểm soát thời gian máy khấy từ Bộ phận ghi nhận nhiệt độ Vị trí cài đặt thời gian bình cầu dung tích 250ml Điểm nối bình cầu và sinh hàn Bộ giảm năng Hệ thống sinh hàn Dung tích lò vi sóng Hệ thống sinh hàn Nhiệt điện trở Hình 9: Sơ đồ thiết kế máy vi sóng dùng trong chiết xuất Phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Thông thường, phân tách các GA đạt được với cột sắc ký pha đảo RP – 18 và rữa giải với CH3-H2O-CH3COOH (60:34:6) với tốc độ dòng 2ml/phút hoặc cột Zorbax-ODS (150mmx4.6mm Du Pont) và rửa giải với CH3CN- 3%CH3COOH - H2O (47:53, v/v) ở bước sóng 248nm với tỉ lệ dòng tăng theo gradient. Trong thí nghiệm này, hỗn hợp sau khi chiết xuất được bằng MAE được ly tâm và lọc với màng lọc xốp (khoảng 0.5µm) sau đó đem đi phân tích. Quá trình phân tách thực hiện với cột bảo vệ Zorbax-SB và cột sắc ký Zorbax-ODS (5µm, 4.6mm×150mm) và rửa giải với hệ dung môi CH3CN-3%CH3COOH – H2O (41:59, v/v) phát hiện ở bước sóng 248nm với tốc độ dòng 1ml/phút. Thời gian lưu của GA khoảng 4.35 phút. GA được phân tách hoàn toàn khỏi các hợp chất khác. Khoảng tuyến tính từ 0.1 đến 2µg của ammonium glycyrrhizinate. Phương pháp này có RSD là 1.55% (n=7). Quá trình phân tích hoàn tất trong 20 phút. Hình 10: Đường chuẩn của ammonium glycyrrhizinate. Kết quả và thảo luận. Ảnh hưởng của pH đến tỷ lệ phần trăm GA chiết được. Hình 11 và 12 cho thấy ảnh hưởng của thời gian chiết xuất lên tỉ lệ phần trăm chiết xuất được của GA bằng phương pháp chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE) và chiết xuất ở nhiệt độ phòng (ERT-extraction at room temperature). Kết quả chỉ ra rằng phần trăm lượng hoạt chất chiết được tăng lên với sự tăng lên của thời gian chiết. Đặc biệt là, khi nguyên liệu A là những mảnh lớn của rễ cam thảo, MAE có thể làm giảm thời gian chiết xuất một cách có ý nghĩa để đạt đến cùng một tỷ lệ phần trăm hoạt chất chiết được. MAE đạt đến tỷ lệ phần trăm hoạt chất chiết được cao hơn trong khoảng thời gian từ 4-5 phút so với ERT ( từ 20 -24h). Các nguyên liệu thường sử dụng để chiết xuất trong công nghiệp thường có kích thước lớn. Do đó những thử nghiệm tiếp sau sử dụng nguyên liệu A để tiến hành. Hình 11: Ảnh hưởng của thời gian MAE đến % GA chiết được (dung môi: 100ml; nguyên liệu: 10 g). Hình 12: Ảnh hưởng của thời gian ERT đến % GA chiết được (dung môi: 30ml; nguyên liệu: 3 g). Hình 13: Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến % chiết xuất của GA – MAE: (dung môi: 100ml, nguyên liệu A: 3g, chiết xuất trong 4 phút ở nhiệt độ khoảng 85 – 90ºC); ERT: (dung môi: 30ml, nguyên liệu A: 3g, chiết trong 20h ở nhiệt độ phòng (khoảng 10±1ºC)). Ảnh hưởng của thành phần dung môi lên tỷ lệ phần trăm GA chiết được. Hình 13 cho thấy tỷ lệ phần trăm GA chiết xuất được chịu ảnh hưởng khá lớn bởi nồng độ ethanol. Khi phần trăm về thể tích của ethanol trong dung môi thấp, tỷ lệ phần trăm hoạt chất chiết được tăng lên cùng với sự tăng của nồng độ ethanol. Khi tỷ lệ phần trăm về thể tích của ethanol trong dung môi chiết xuất ở mức cao hơn, tỷ lệ phần trăm của hoạt chất chiết được giảm xuống đáng kể với sự tăng lên của nồng độ ethanol từ 60-100%(v/v). Tỷ lệ phần trăm các chất chiết được ở mức cao nhất đạt được ở tỷ lệ 50-60%(v/v) ethanol không có sự hiện diện của amonia. GA tồn tại dưới dạng kết hợp với muối calcium và potassium trong rễ cam thảo, dạng này rất dễ hòa tan trong nước hoặc trong ethanol. Nếu trong dung môi chiết xuất thêm vào 2% amonia, GA tạo thành dạng glycyrrhizic ammoniate với amonia, vì thế, dễ dàng đạt đến tỷ lệ phần trăm GA chiết xuất được ở mức cao trong khoảng nồng độ ethanol từ 0-60%(v/v). Tuy nhiên, tinh bột, đường và các protein tan trong dung môi chiết xuất có độ cồn thấp, điều này gây khó khăn trong việc ly tâm và lọc. Vì vậy, nồng độ ethanol được sử dụng được lựa chọn là 50-60%. Tỷ lệ phần trăm GA chiết xuất được cũng tăng lên cùng với sự tăng của nồng độ amonia. Trong nước, 50 hoặc 60% ethanol, tỷ lệ amonia từ 1-2%(v/v) đủ để quá trình chiết xuất đạt đến hiệu suất cao. Hình 13 cũng cho thấy phần trăm GA chiết xuất được tăng lên có ý nghĩa với 2% amonia(v/v) được thêm vào. Nếu nồng độ của ammonia trên 2%, điều này không thuận lợi cho các quá trình xử lý tiếp sau, điều kiện tiến hànhthực nghiệm sẽ trở nên khó khăn hơn. Nồng độ ammonia 1 -2 % là tối ưu cho các thử nghiệm. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến tỷ lệ phần trăm GA chiết xuất được. Bảng 9 cho thấy tỷ lệ phần trăm GA chiết xuất được tăng lên với sự tăng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu. Tuy nhiên, phải tốn thêm năng lượng và thời gian để xử lý dung môi ngâm chiết ở các tỷ lệ cao. Bởi vậy, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu(ml/g) thích hợp là 10:1. Bảng 9: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu lên hiệu suất chiết bằng MAE. Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (ml/g) 5:1 10:1 15:1 20:1 Tỷ lệ GA chiết xuất được (%). 1.88 2.26 2.45 2.58 So sánh với các phương pháp chiết xuất khác. Hình 14 trình bày 6 phương pháp chiết xuất cùng đạt đến một tỷ lệ chiết xuất GA tương đương nhau trong cùng một điều kiện kích thước nguyên liệu. Đồng thời, sơ đồ cũng cho thấy rằng kích thước nhỏ (C) dễ dàng đạt đến hiệu suất chiết xuất cao hơn 2 kích thước còn lại. Kích thước của nguyên liệu là một nhân tố chính ảnh hưởng đến tỷ lệ phần trăm GA chiết xuất được. Từ những điều kiện thực nghiệm, có thể thấy được rằng nếu cùng một tỷ lệ phần trăm GA chiết xuất được, chiết xuất đung hồi lưu cần 4.5 h và 260ml dung môi; chiết xuất có hỗ trợ siêu âm cần 20.5h; chiết xuất bằng Soxhlet cần 10h và 200ml dung môi; Soxhlet-MAE cần 5.07h và 300ml dung môi; ERT cần 20h và 100ml dung môi; MAE chỉ cần 4 phút và 100ml dung môi. Chính vì lý do tiết kiệm đáng kể dung môi và thời gian chiết xuất, phương pháp MAE thích hợp cho việc chiết xuất GA từ rễ cam thảo. Hình 14: So sánh phương pháp MAE và các phương pháp khác: rễ cam thảo: 10 g; Chiết hồi lưu: tiến hành 3 lần (lần 1, 100ml dung môi, 1.5 h; lần 2, 80ml dung môi, 1.5 h; lần 3, 80ml dung môi, 1.5 h); chiết siêu âm: 100ml dung môi, siêu âm 30min sau khi ERT trong 20 h; chiết Soxhlet: 200ml dung môi, chiết trong 10 h; Soxhlet-MAE: 200ml dung môi, chiết trong 5 h, sau đó lọc, dung dịch chiết được phân tích bằng HPLC và phần bã được chiết với 100ml dung môi trong 4 phút bằng MAE; ERT: 30ml dung môi; nguyên liệu: 3 g, chiết trong 20 h; MAE: 100ml dung môi, chiết trong 4 phút. Trong cấu trúc của GA, có 3 nhóm carboxyl (-COOH) và 5 nhóm hydroxyl ( - OH), do đó GA rất phân cực và dễ hấp thụ vi sóng. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP. Phân lập và tinh khiết hóa bằng phương pháp chiết với dung môi hữu cơ[8]. Phương pháp chiết bằng dung môi, với những thuận lợi về kỹ thuật phát triển, dễ tiến hành, hiệu suất cao và tiết kiệm thời gian, được sử dụng rộng rãi để điều chế và phân lập những hợp chất có hoạt tính trong ngành dược. So sánh với những tác nhân chiết khác, tác nhân chiết dẫn xuất phosphor hữu cơ trung tính và rượu thì thích hợp sử dụng vì ít độc. Thí dụ, sự chiết leucine và isoleucin với di-(2-ethylhexyl)-phosphoric acid (P204), thu hồi acid malic, fumaric acid và hyroxyacetic với trialkylphosphine oxide (TRPO), phân lập penicillin G với tributyl phosphate (TBP), sự thu hồi theophyline với 2-ethyl-hexanol và sự chiết xuất spriamycin với capryl alcohol hoặc rược từ dầu dừa đã được báo cáo. GA, một acid yếu và bao gồm acid glycirrhitinic và acid glucuronic, có 3 nhóm carboxyl và 5 nhóm hydroxyl. Những nhóm phân cực này có khả năng tương tác với những nhóm chức của tác nhân chiết thông qua liên kết hydrogen. Từ đó, những phân tử GA có thể được chiết vào trong dung môi hữu cơ từ dịch chiết nước và phân tách chọn lọc từ những tạp chất. Thiết kế thí nghiệm Nguyên liệu, phương pháp. Rễ cam thảo thô được mua tại Inner- Mongolia, Trung Quốc, và được cắt nhỏ tại phòng thí nghiệm. Mẫu chuẩn GA và muối mono-ammonium của nó được mua từ viện nghiên cứu thuốc và chế phẩm sinh học Trung Quốc. GA và muối mono-amonium của nó (UV, 98%, công ty Yu Jiu, Thượng Hải) được sử dụng mà không cần tinh khiết thêm trong giai đoạn chiết bằng dung môi ban đầu. Nước và acetonitrile được sử dụng trong phân tích HPLC. Acid acetic, ethanol khan, 2-ethyl-hexanol, n-hexanol, TBP, TRPO và ether dầu hỏa là loại thương mại và đạt tiêu chuẩn dùng trong phân tích. Dịch chiết ngấm kiệt cam thảo có được bởi phương pháp chiết hỗ trợ vi sóng. Lò vi sóng (Nhật Bản) sử dụng trong gia đình được điều chỉnh để sử dụng trong phòng thí nghiệm. Bột rễ cam thảo (khoảng 5g) được trộn với nước cất (100 ml) và sau đó được chiếu xạ bằng máy vi sóng (700 W) tại áp suất thường trong khoảng 4 phút tại điểm sôi (khoảng 100ºC ). Dịch đối chứng được chuẩn bị bằng cách hòa tan GA chuẩn trong nước cất. Sự chiết bằng dung môi được tiến hành trong becher với máy khuấy từ (khoảng 500 rpm). Dịch chiết cam thảo hoặc dịch đối chứng được trộn với dung môi chiết và điều chỉnh pH của hỗn hợp bằng acid HCl (2M) đến pH xác định. Sự phân tách pha nước từ pha dung môi hữu cơ dễ dàng đạt được với máy ly tâm. Thể tích của mỗi pha được đo lường và lượng GA trong mỗi pha được phân tích với HPLC. Tiến trình tinh khiết được tiến hành trong một becher với máy khuấy từ (500 rpm), pha hữu cơ chứa GA được trộn với nước cất. pH của hỗn hợp được điều chỉnh với NaOH 1M. Sự phân tách giữa pha nước và pha hữu cơ được thực hiện bởi sự sa lắng trọng lực. Thể tích của mỗi pha được đo lường và lượng GA trong mỗi pha được phân tích với HPLC. Phân tích HPLC Pha nước sau khi chiết hoặc tinh khiết được hòa loãng với nước cất và sau đó được điều chỉnh đến pH 7 để phân tích HPLC. Ethanol khan được sử dụng như là dung môi cho pha hữu cơ. GA trong dịch nước và trong dung môi hữu cơ được phân tích bởi HPLC với cột bảo vệ Zorbax-SB và cột phân tích Zorbax-ODS (5μm, 150mm×4,6mm, Du Pont). Pha động bao gồm acid acetic: acetonitrile: nước ( 3:41:59, v/v), tốc độ dòng 1ml/min. Hệ thống HPLC là hệ thống sắc ký lỏng HP 1090, với thiết bị bơm tư động và đầu dò diode array (DAD). Phát hiện tại bước sóng 248nm, được dùng để định lượng tại nhiệt độ thường. Thời gian lưu của GA là 4.2 phút. Lượng GA trong dịch chiết được xác định bởi sử dụng diện tích đỉnh và diện tích dưới đường cong so sánh với đường chuẩn bởi tiêm dịch GA chuẩn trong pha động với lượng từ 0,1 μg đến 2,5 μg. Thành phần phần trăm của GA trong dịch chiết và sau khi chiết kiệt được xác định bởi : %GA chiết được (% ) = V0C0 : thể tích và nồng độ GA trong pha hữu cơ sau khi chiết bằng dung môi, ml và mg/ml ViCi: thể tích và nồng độ GA trong dịch ngấm kiệt lúc ban đầu trước khi chiết với dung môi, ml và mg/ml % GA sau khi tinh chế (%) = Va,Ca: thể tích và nồng độ GA trong pha nước sau khi tinh chế, ml và mg/ml. Vio, Cio: thể tích và nồng độ GA trong pha dung môi hữu cơ trước khi tinh chế, ml và mg/ml. Chuẩn bị mẫu cho quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền (TEM). Sự chuẩn bị mẫu cho TEM được thực hiện với kỹ thuật của Freezing- Etch Replica. Sự đông lạnh được tiến hành bởi nhỏ thuốc thử hữu cơ chứa GA trong nito hóa lỏng. Sau khi làm nứt mẫu đông lạnh trong bình chân không ( máy cô quay chân không JEE-4X), mẫu được tạo bởi bốc hơi lớp mỏng platinum và lớp carbon trên thuốc thử hữu cơ được làm nứt. Lớp mỏng platinum được bốc hới dưới góc 45º trong khi lớp carbon được bốc hơi dưới góc 90○. Bước tiếp theo của sự bốc hơi platinum và carbon, mẫu đông lạnh nằm dưới bản sao được làm tan với ethanol trong khi lớp platinum và carbon thì trơ. Sau đó được rữa bởi nước cất, bản sao được làm sạch cuối cùng được phủ lên bởi lớp mắt lưới mạ đồng để sử dụng cho chọn lọc phần mỏng và sẵn sàng để quan sát với TEM (JEM-100X electron microscope). Đo quang phổ và đo độ nhớt. Quét phổ UV với khoảng cách bước sóng 1nm đươc ghi nhận trên máy đo quang phổ (Perkin Elmer) Lambda Bio 40 UV/ vis. Độ nhớt dung dịch nước của GA được đo với máy đo độ nhớt Ubbelohde. 2.3.1.2. Kết quả và thảo luận. 2.3.1.2.1. Sự chiết GA trong dung dich đối chứng với pH khác nhau. Hình 15 chỉ ra pH có ảnh hưởng sự chiết GA trong dung dịch đối chứng. Tăng pH dẫn đến giảm phần trăm GA chiết được ở tất cả dung môi chiết. Đối với 2- ethylhexanol, phần trăm GA chiết được là trên 90% tại pH = 2, nhưng giảm còn 0 với pH > 6. Đối với n- hexanol, GA có thể được chiết hầu như hoàn toàn vào pha hữu cơ với pH 7. Đối với TBP và TRPO kết quả tương tự, phần trăm GA chiết được giảm từ 90% đến 0 với sự tăng pH . Những vùng pH mà phần trăm GA thay đổi nhanh chóng thì khác nhau một ít, đối với TBP pH = 4,5-6,5 và đối với TRPO pH = 5,5-7. Hình 15. Ảnh hưởng của pH trên sự chiết GA trong dung môi( điều kiện: pha hữu cơ / pha nước = 10ml/10ml; khuấy từ trong