Đề tài Đánh giá đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật RAPD

MỞ ĐẦU Lúa là một trong những cây lương thực chính của hơn một nửa dân số trên thế giới (IRRI, 1994). Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các nước châu Á. Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam cũng là cái nôi của nền văn minh lúa nước. Đã từ lâu cây lúa trở thành cây lương thực chủ yếu, có ý nghĩa đáng kể trong nền kinh tế và xã hội nước ta. Năm 2003, sản lượng xuất khẩu gạo Việt Nam đạt 4,2 triệu tấn, tăng 11% so với năm 2000 [12]. Tuy nhiên, thực tế cho thấy có nhiều yếu tố làm giảm năng suất và chất lượng lúa gạo. Trong số đó, bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên là một trong những yếu tố hạn chế sự phát triển của lúa, bệnh có khả năng lây nhiễm mạnh và rất khó khống chế. Ở những nơi bệnh phát triển mạnh, năng suất lúa có thể giảm đến 60%. Để phòng trừ bệnh bạc lá vi khuẩn người ta thường sử dụng thuốc hoá học, song việc dùng thuốc gây độc hại cho người sử dụng và làm ô nhiễm môi trường. Hạn chế những độc hại trên thì việc gieo trồng các giống lúa kháng bệnh là có triển vọng nhất. Nhưng thực tế, giống kháng chỉ tồn tại vài năm trong sản xuất sau đó nông dân phải thay thế bằng giống mới hoặc phun thuốc diệt bệnh, vì nòi bệnh có độc tính cao hơn phát triển [10]. Để khắc phục được bệnh bạc lá vi khuẩn một cách hiệu quả, các nhà chọn giống đang sử dụng các giống kháng bệnh lai với các giống có năng suất, chất lượng cao nhằm thu được các giống vừa kháng bệnh, năng suất cao và có chất lượng tốt. Hiện nay, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã xác định được các giống lúa mang các gen kháng với các nòi khác nhau của bệnh bạc lá vi khuẩn. Đây là những nguồn gen quí trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh cũng như các trong nghiên cứu đa dạng di truyền [4], [10]. Trong những năm 90, kỹ thuật sinh học phân tử đã trở thành công cụ rất có hiệu quả trong phân tích đa dạng, bảo tồn và tiến hóa giống loài ở sinh vật. Nghiên cứu đa dạng trên đối tượng lúa là vấn đề được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm và kết quả là có rất nhiều công trình chỉ ra mức độ đa hình ở lúa khi sử dụng chỉ thị RAPD [14], [29] và RELP [18], [25]. Trong các loại chỉ thị, thì chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) đơn giản, ít tốn kém nên được sử dụng rộng rãi hơn các chỉ thị AFLP, RFLP, SSR. Sử dụng chỉ thị RAPD, các nhà khoa học có thể đánh giá và phân loại tập đoàn giống cây trồng một cách nhanh chóng và chính xác. Trên thực tế, chỉ thị RAPD cho kết quả đặc trưng đối với từng cá thể và có thể ứng dụng chỉ thị này để phân tích tính đa hình ADN nhờ sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên. Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: ‘‘Đánh giá đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật RAPD” với mục tiêu: đánh giá đa dạng phân tử của 36 giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn, nhằm phục vụ việc xác định bố mẹ trong nghiên cứu lập bản đồ và chọn tạo giống lúa kháng bệnh. Ch­¬ng 1. TæNG QUAN TµI LIÖU 1.1. giíi thiÖu vÒ c©y lóa C©y lóa thuéc hä hßa th¶o (Poaceae), th©n bôi, l¸ mÒm. Lóa trång thuéc chi Oryzae víi nhiÒu loµi kh¸c nhau. Trong sè 23 loµi ®· ®­îc ph©n lo¹i th× chØ cã hai loµi lµ O. glaberrima vµ O. sativa ®­îc trång cÊy. Loµi O. glaberrima ®­îc trång chñ yÕu ë mét sè n­íc miÒn T©y ch©u Phi. Cßn loµi O. sativa cã ë kh¾p thÕ giíi vµ tËp trung phÇn lín ë ch©u ¸. Loµi O. sativa ®­îc chia lµm 3 loµi phô: Indica, Japonica, Javanica. Lóa Indica ®­îc trång ë c¸c vïng nhiÖt ®íi vµ cËn nhiÖt ®íi; Japonica ®­îc trång chñ yÕu ë c¸c vïng «n ®íi vµ cËn «n ®íi; Javanica chØ ®­îc trång ë mét vµi n¬i thuéc Indonesia (Khush, 1997). Loµi Oryza sativa cã sè nhiÔm s¾c thÓ lµ 2n = 24. T¸m trong sè 23 loµi lóa d¹i cã bé gen ë thÓ tø béi, cßn l¹i ®a sè c¸c lo¹i lóa d¹i vµ lóa trång hiÖn nay cã bé gen lµ thÓ l­ìng béi (Khush, 1997) [7], [21]. Lóa ph©n bè kh¾p thÕ giíi, tr¶i tõ vÜ ®é 550 B¾c thuéc Trung Quèc ®Õn 360 Nam thuéc Chi Lª. Theo FAO (1999) diÖn tÝch ®Êt canh t¸c lóa trªn toµn thÕ giíi kho¶ng 150 triÖu ha. Riªng Trung Quèc vµ Ên ®é chiÕm kho¶ng 50% diÖn tÝch trång lóa vµ 56% s¶n l­îng lóa toµn cÇu. Ch©u Phi cã diÖn tÝch trång lóa gÇn b»ng diÖn tÝch trång lóa cña ViÖt Nam, nh­ng s¶n l­îng lóa l¹i thÊp h¬n tõ 2 ®Õn 3 lÇn [2], [7]. 1.2. BÖnh b¹c l¸ vi khuÈn ë lóa (Xanthomonas oryzae) BÖnh b¹c l¸ (cßn gäi lµ bÖnh ch¸y b×a l¸) lµ mét trong nh÷ng bÖnh h¹i lóa nguy hiÓm do vi khuÈn Xanthomonas oryzae g©y nªn. lµ mét trong nh÷ng bÖnh h¹i lóa nguy hiÓm. BÖnh xuÊt hiÖn lÇn ®Çu tiªn ë NhËt B¶n n¨m 1884. N¨m 1960, bÖnh lan truyÒn sang, sau nguån bÖnh ®­îc t×m thÊy ë c¸c vïng kh¸c ë ch©u Phi, Australia, Mü vµ mét sè n­íc Mü La Tinh. ë ViÖt Nam, bÖnh phæ biÕn ë tÊt c¶ c¸c vïng trång lóa trong c¶ n­íc, tõ vïng nói cao ®Õn ven biÓn. BÖnh cã thÓ lµm gi¶m n¨ng suÊt tõ 6 - 60%. BÖnh ph¸ h¹i trong c¶ vô §®«ng xu©n, hÌ HÌ thu vµ vô mMïa., ®Æc biÖt, bÖnh g©y h¹i nÆng trong c¸c th¸ng nhiÖt ®é cao. M­a b·o lµ ®iÒu kiÖn ®Ó bÖnh l©y lan vµ ph¸t triÓn m¹nh. Trong nh÷ng n¨m 1970 - 1975, bÖnh ph¸t triÓn vµ g©y thiÖt h¹i nÆng cho ë lóa ë kh¾p c¸c tØnh phÝa B¾c [2]. 1.2.1. Vi khuÈn g©y bÖnh b¹c l¸ lóa (Xanthomonas aryzae) Vi khuÈn Xanthomonas oryzae cã h×nh gËy ng¾n, hai ®Çu trßn, lµ vi khuÈn Gram (-) vµ kh«ng h×nh thµnh bµo tö. C¸c tÕ bµo vi khuÈn ®­îc bäc trong mµng nhÇy vµ liªn kÕt víi nhau thµnh mét khèi t­¬ng ®èi v÷ng ch¾c ngay c¶ trong n­íc. Trªn m«i tr­êng nh©n t¹o, khuÈn l¹c cã mµu vµng nh¹t vµ cã thÓ sèng trong ph¹m vi pH 4,0 - 8,8. NhiÖt ®é thÝch hîp nhÊt cho vi khuÈn sinh tr­ëng lµ 260C - 300C, nhiÖt ®é tèi thiÓu lµ 550C - 100C vµ nhiÖt ®é tèi ®a lµ 400C [9], [11]. Vi khuÈn x©m nhËp cã tÝnh chÊt thô ®éng vµ cã thÓ x©m nhiÔm qua thñy khæng, lç khÝ ë trªn mÐp l¸, ®Æc biÖt qua vÕt th­¬ng x©y x¸t trªn l¸. Khi ®· tiÕp xóc víi bÒ mÆt cã mµng n­íc, vi khuÈn dÔ dµng di ®éng vµ x©m nhËp vµo bªn trong qua c¸c lç khÝ, qua vÕt th­¬ng ®Ó nh©n lªn vÒ mÆt sè l­îng, sau ®ã theo c¸c bã m¹ch dÉn lan réng ®i. Trong ®iÒu kiÖn m­a Èm, trªn bÒ mÆt vÕt bÖnh sÏ tiÕt ra nh÷ng giät dÞch vi khuÈn vµ th«ng qua sù va ch¹m gi÷a c¸c l¸ lóa, bÖnh cã thÓ lan truyÒn tõ l¸ nµy sang l¸ kh¸c ®Ó tiÕn hµnh x©m nhiÔm lÆp l¹i nhiÒu lÇn trong thêi kú sinh tr­ëng cña c©y lóa [6], [9]. HiÖn nay, cã rÊt nhiÒu nßi vi khuÈn g©y bÖnh b¹c l¸, ph©n bè ë nhiÒu n­íc trªn thÕ giíi. C¸c nhµ khoa häc cã thÓ ph©n lo¹i c¸c nßi X. oryzae theo tÝnh g©y bÖnh cña chóng. Nh×n chung, c¸c nßi vi khuÈn kh¸ kh¸c nhau vÒ tÝnh g©y bÖnh vµ trë nªn ®éc h¬n khi truyÒn lÆp ®i lÆp l¹i qua c¸c thÕ hÖ cña gièng kh¸ng bÖnh, nh­ng tÝnh g©y bÖnh vÉn kh«ng thay ®æi hoÆc gi¶m ®i khi x©m nhiÔm qua c¸c gièng lóa mÉn c¶m [11]. 1.2.2. TriÖu chøng cña bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn BÖnh b¹c l¸ vi khuÈn th­êng ph¸t sinh d­íi d¹ng c¸c säc vµng kÐo dµi tõ mÐp l¸ c¸ch ®Ønh vµi cm. Trªn phiÕn l¸, vÕt bÖnh lan réng theo c¶ chiÒu dµi vµ réng, cã mÐp viÒn h×nh sãng råi trë nªn vµng sau vµi ngµy. Khi bÖnh tiÕn triÓn, vÕt bÖnh lan réng phñ kÝn c¶ mÆt l¸, chuyÓn tõ tr¾ng sang x¸m nh¹t do sù sinh tr­ëng cña c¸c nÊm ho¹i sinh. §èi víi c¸c gièng c¶m nhiÔm, vÕt bÖnh lan réng tíi bÑ l¸ vµ cã thÓ ph¸t triÓn xuèng tËn phÇn d­íi cña bÑ l¸, lµm phiÕn l¸ bÞ hÐo vµ cuén l¹i trong khi l¸ vÉn cßn xanh, sau ®ã toµn bé phiÕn l¸ cã thÓ bÞ hÐo råi kh« ®i. ë c¸c ruéng lóa bÞ bÖnh nghiªm träng, h¹t còng cã thÓ bÞ nhiÔm bÖnh. Trªn vá h¹t xuÊt hiÖn c¸c ®èm mµu nh¹t, xung quanh cã mÐp viÒn d¹ng giät dÇu. Khi h¹t cßn non vµ xanh c¸c vÕt bÖnh lé râ, khi b«ng chÝn vÕt bÖnh sÏ cã mµu x¸m,, hoÆc tr¾ng hoÆc vµng nh¹t [6], [19]. 1.2.3. c¸c yÕu tè ¶nh h­ëng ®Õn sù ph¸t triÓn cña bÖnh Trong dù b¸o bÖnh b¹c l¸, yÕu tè khÝ hËu lµ ®èi t­îng ®Ó ph©n tÝch. C¸c nhµ khoa häc ph¸t hiÖn thÊy r»ng møc ®é nhiÔm bÖnh t­¬ng quan víi tæng l­îng m­a, møc ®é ngËp lôt, giã m¹nh vµ ®é s©u n­íc t­íi. NhiÖt ®é t­¬ng ®èi cao trong thêi kú lóa sinh tr­ëng cã thÓ lµm t¨ng bÖnh, song mïa hÌ qu¸ nãng vµ kh« lµ ®iÒu kiÖn h¹n chÕ bÖnh. Kü thuËt trång trät còng lµ mét trong nh÷ng ®iÒu kiÖn quan träng ¶nh h­ëng ®Õn sù ph¸t sinh, ph¸t triÓn bÖnh, song còng rÊt phøc t¹p v× mét mÆt nã ¶nh h­ëng tíi sù ph¸t sinh ph¸t triÓn cña c©y lóa - lµm t¨ng hay lµm gi¶m tÝnh chèng chÞu, mÆt kh¸c nã ¶nh h­ëng tíi tiÓu khÝ hËu ®ång ruéng. Trong c¸c yÕu tè kü thuËt ch¨m sãc th× ph©n bãn cã ¶nh h­ëng râ rÖt nhÊt tíi sù ph¸t sinh, ph¸t triÓn cña bÖnh. Cô thÓ lµ bãn ®¹m qu¸ nhiÒu, bãn thóc muén, thiÕu l©n, kali vµ magie ®Òu lµm t¨ng bÖnh. ë nh÷ng n¬i ®Êt chua, óng ngËp ®Æc biÖt ë nh÷ng vïng ®Êt nhiÒu mïn, hµng lóa bÞ ch¾n n¾ng th× bÖnh b¹c l¸ cã thÓ ph¸t triÓn m¹nh h¬n [6]. Trong tÊt c¶ c¸c giai ®o¹n sinh tr­ëng, c©y ®Òu cã thÓ bÞ nhiÔm bÖnh nh­ng ë møc ®é kh¸c nhau tuú tõng giai ®o¹n sinh tr­ëng. Nãi chung, tõ thêi k× m¹ ®Õn khi lóa ®Î nh¸nh lµ thêi kú bÖnh t­¬ng ®èi Ýt h¬n so víi giai ®o¹n cuèi ®Î nh¸nh. Giai ®o¹n lóa lµm ®ßng - trç - chÝn s÷a lµ giai ®o¹n rÊt mÉn c¶m víi bÖnh, hiÖn t­îng nµy thÓ hiÖn kh¸ râ nÐt trªn c¸c gièng lóa ng¾n ngµy, chÞu ph©n, cã n¨ng suÊt cao, cÊy trong vô Chiªm xu©n vµ vô Mïa [11]. 1.2.4. T¸c h¹i cña bÖnh b¹c l¸ lóa vi khuÈn BÖnh b¹c l¸ vi khuÈn ®· lµm gi¶m n¨ng suÊt lóa g¹o h»ng n¨m ë Ch©u ¸ xuèng 60%. VÝ dô ë NhËt nh÷ng n¨m gÇn ®©y, cã kho¶ng 300.000 - 400.000 hecta lóa bÞ ¶nh h­ëng bëi bÖnh nµy vµ n¨ng suÊt gi¶m 20 - 50%. ë nh÷ng c¸nh ®ång nhiÔm bÖnh ngiªm träng ë Indonesia, s¶n l­îng lóa cßn thÊp h¬n so víi ë NhËt; cßn ë Ên ®é, hµng triÖu hecta lóa nhiÔm bÖnh nghiªm träng lµm cho n¨ng suÊt gi¶m tõ 6 - 60%. ë ViÖt Nam, bÖnh b¹c l¸ ®­îc ph¸t hiÖn tõ l©u trªn c¸c gièng lóa mïa cò, ®Æc biÖt tõ n¨m 1965 trë l¹i ®©y bÖnh th­êng xuyªn ph¸ ho¹i nghiªm träng ë c¸c vïng trång lóa [6], [19].th× sao? 1.2.5. C¸c biÖn ph¸p phßng trõ C¨n cø vµo ®Æc ®iÓm sinh häc cña vi khuÈn g©y bÖnh, c¸c nhµ khoa häc ®· ®­a ra nh÷ng biÖn ph¸p phßng trõ tæng hîp nh­: xö lý h¹t gièng tr­íc khi gieo nÕu l« h¹t bÞ nhiÔm bÖnh, bãn ph©n ®óng kü thuËt vµ ®óng giai ®o¹n, ruéng lóa cÇn ®iÒu chØnh møc n­íc thÝch hîp, chó ý vÖ sinh ®ång ruéng hoÆc cã thÓ sö dông thuèc hãa häc ®Ó h¹n chÕ sù ph¸t sinh, ph¸t triÓn cña bÖnh... [6]. Cho ®Õn nay, viÖc sö dông gièng chèng chÞu bÖnh vÉn lµ biÖn ph¸p cã hiÖu qu¶ nhÊt v× gi¶m ®­îc chi phÝ do sö dông thuèc hãa häc vµ b¶o vÖ m«i tr­êng tèt h¬n. ChÝnh v× vËy, viÖc chän t¹o ra nh÷ng gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ lu«n lµ môc tiªu hµng ®Çu cña c¸c nhµ t¹o gièng trªn thÕ giíi còng nh­ ë ViÖt Nam [24], [30]. Cïng víi sù ph¸t triÓn cña khoa häc hiÖn ®¹i c¸c nhµ nghiªn cøu t×m thÊy kho¶ng 24 gen kh¸ng bÖnh b¹c l¸ ë nhiÒu loµi lóa hoang d¹i vµ c¸c gièng lóa ®Þa ph­¬ng. Gen kh¸ng ®­îc thèng nhÊt cã tªn lµ Xa + sè thø tù, vÝ dô nh­ Xa1, Xa2... Trong sè ®ã, Xa21 cã phæ kh¸ng réng vµ ®­îc chó ý nhiÒu trong c«ng nghÖ chuyÓn gen hiÖn nay [20], [27]. 1.2.6. Mét sè thµnh tùu trong chän gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn Trong 50 n¨m gÇn ®©y, c¸c nhµ khoa häc ®· ph¸t triÓn nhiÒu kü thuËt thanh läc ng©n hµng gen ®èi víi tÝnh tr¹ng chèng chÞu vi khuÈn, c«n trïng g©y h¹i c©y trång, x¸c ®Þnh nguån cung cÊp gen kh¸ng. Víi ph­¬ng ph¸p chän gièng truyÒn thèng, c¸c nhµ khoa häc ®· t¹o ra nhiÒu gièng c©y trång kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vµ ®­îc gieo trång víi diÖn tÝch hµng triÖu ha. Vµ chän gièng ngoµi ®ång ruéng, kh¶o nghiÖm vµ t¹o c¸c gièng lóa chèng chÞu bÖnh tõ l©u ®· ®­îc thùc hiÖn ë nhiÒu n­íc trªn thÕ giíi. Kh«ng hiÓu ý c©u nµy? ë NhËt B¶n, gÇn ®©y c¸c nhµ khoa häc ®· chän ®­îc nhiÒu gièng lóa kh¸ng bÖnh ®­îc sö dông ®Ó lai t¹o ra c¸c gièng míi nh­ gièng Sengoku 4, Magatama, Zensho 26, Norin 27... Tuy nhiªn, kÕt qu¶ kiÓm tra ngoµi ®ång ruéng cho thÊy ch­a chän ®­îc gièng cã tÝnh chèng chÞu cao víi c¸c nßi vi khuÈn g©y bÖnh b¹c l¸ míi ®­îc gi¸m ®Þnh gÇn ®©y. N¨m 1968, Sakaguchi vµ CS ®· kh¶o nghiÖm 863 gièng lóa ®­îc trång phæ biÕn ë nhiÒu n¬i trªn thÕ giíi vµ ph¸t hiÖn gièng lóa Lead cña MiÕn §iÖn, TKM6 vµ Nigeria 5 chèng chÞu kh¸ víi hÇu hÕt c¸c nhãm vi khuÈn g©y bÖnh b¹c l¸ thuéc c¸c nßi kh¸c nhau [9], [11]. ë viÖt Nam, ®· cã nhiÒu nghiªn cøu ®Ó chän t¹o gièng lóa mang gen kh¸ng bÖnh b¹c l¸. Nh­ ë ViÖn Lóa §ång b»ng s«ng Ccöu lLong, b»ng ph­¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ kiÓu gen nhê chØ thÞ ph©n tö ®èi víi 148 gièng lóa ®Þa ph­¬ng cã nguån gèc Duyªn h¶i Trung Bé cho thÊy c¸c gièng lóa: Cµ §ung, Ba Tóc, Th¬m Lung, VÖ PhÝch, Lóa Tr¾ng, NÕp Hoa Vµng, Lóa Th­íc, Quinkes 85 vµ Seraup kechil 30 cã gen kh¸ng Xa13; gen kh¸ng Xa5 ®­îc t×m thÊy trªn gièng Nµng Tri, Tr¾ng Lïn, Be Ren, Giµu Dumont; gièng Lóa Sãc, Lóa Mïa 2, Tr¾ng Qu·ng, Tr¾ng Ph­íc, Tµu H­¬ng, Nµng SËu cã gen kh¸ng Xa4 [4]. 1.3. øng dông kü thuËt RAPD - PCR trong nghiªn cøu ®a h×nh ADN 1.3.1. Ph¶n øng PCR Kü thuËt nh©n b¶n ADN ®Æc hiÖu dùa vµo ph¶n øng chuçi trïng hîp (Polymerase Chain Reaction) ®­îc Karry Mullis hoµn thiÖn vµo gi÷a nh÷ng n¨m 80 ®· gãp phÇn t¹o ra mét cuéc c¸ch m¹ng trong sinh häc ph©n tö. Kü thuËt PCR lµ mét ph­¬ng ph¸p hoµn toµn míi trong viÖc nghiªn cøu vµ ph©n tÝch c¸c gen. Sö dông kü thuËt PCR cã thÓ t¹o ra mét sè l­îng lín c¸c b¶n sao cña ®o¹n ADN cÇn tæng hîp mµ kh«ng ph¶i t¸ch vµ nh©n dßng. Thùc chÊt PCR lµ mét ph­¬ng ph¸p in vitro vitro cho phÐp nh©n b¶n nhanh mét ®o¹n ADN nµo ®ã mµ chØ cÇn mét khèi l­îng mÉu ban ®Çu h¹n chÕ [8], [5]. Ph¶n øng PCR lµ mét chuçi ph¶n øng gåm nhiÒu chu kú lÆp l¹i, mçi chu kú gåm 3 giai ®o¹n: + Giai ®o¹n 1 (BiÕn biÕn tÝnh): ADN ®­îc biÕn tÝnh ë nhiÖt ®é kho¶ng 950C trong thêi gian kho¶ng 1 phót, khi ®ã c¸c liªn kÕt hidro bÞ ®øt vµ sîi ADN kÐp t¸ch thµnh hai sîi ®¬n. + Giai ®o¹n 2 (Gg¾n måi): ë nhiÖt ®é tõ 300C ®Õn 650C trong kho¶ng 30 gi©y ®Õn 1 phót th× c¸c måi b¾t cÆp víi sîi ADN khu«n theo nguyªn t¾c bæ sung ë hai ®Çu ®o¹n ADN cÇn nh©n. NhiÖt ®é cña b­íc g¾n måi tïy thuéc vµo tõng lo¹i måi cô thÓ, ®­îc tÝnh to¸n dùa trªn nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi [3], [5]. C«ng thøc tÝnh nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi: Tm = 81,5 + 16,6(log10 {J+}) + 0,41(%G + C) - (600/I) - 0,63(%FA) Trong ®ã: {J+}: nång ®é cña c¸c cation hãa trÞ I FA: chÊt dïng ®Ó g©y biÕn tÝnh ADN I: chiÒu dµi cña måi + Giai ®o¹n 3 (tæng hîp ADN): ë nhiÖt ®é kho¶ng 720C, trong kho¶ng thêi gian tõ 30 gi©y ®Õn nhiÒu phót (tuú thuéc vµo chiÒu dµi ®o¹n ADN cÇn tæng hîp), khi ®ã, enzym Taq polymerase ho¹t ®éng vµ qu¸ tr×nh tæng hîp ADN diÔn ra trªn nh÷ng ®o¹n gi÷a cÆp måi theo chiÒu tõ 5’- 3’. Mét chu kú gåm 3 b­íc trªn ®­îc lÆp ®i lÆp l¹i nhiÒu lÇn vµ qua mçi lÇn lµm t¨ng gÊp ®«i sè mÉu lÇn tr­íc. Sù t¨ng l­îng mÉu nµy theo cÊp sè nh©n, nªn sau n chu k× sè mÉu thu ®­îc lµ: A = x.2n Trong ®ã A: Tæng sè b¶n sao ADN x: Sè l­îng ph©n tö ADN lµm khu«n ban ®Çu n: Sè chu kú C¸c thµnh phÇn c¬ b¶n cña mét ph¶n øng PCR gåm: ADN khu«n, hai ®o¹n måi ®Ó x¸c ®Þnh c¸c ®iÓm b¾t ®Çu tæng hîp ADN, Taq polymerase, hçn hîp bèn tiÒn chÊt deoxynucleotit, dung dÞch ®Öm chøa mét sè cation hãa trÞ 1, ion Mg2+ vµ dung m«i (n­íc khö ion khö trïng). - Enzym Taq polymerase: Enzym Taq polymerase lµ enzym chÞu nhiÖt, ®­îc t¸ch tõ vi khuÈn suèi n­íc nãng Thermus aquaticus. Enzym Taq cã träng l­îng ph©n tö lµ 94 kDa vµ kh«ng mÊt ho¹t tÝnh ë nhiÖt ®é cao trong giai ®o¹n g©y biÕn tÝnh ADN, nh­ng ho¹t tÝnh cña enzym Taq gi¶m 50% sau 150 phót ë nhiÖt ®é 92,50C; sau 40 phót ë nhiÖt ®é 950C vµ sau 5 - 6 phót ë nhiÖt ®é 970C. NÕu nhiÖt ®é t¨ng lªn tíi 950C trong 20 gi©y ®Ó biÕn tÝnh ADN kÐp thµnh sîi ®¬n th× ho¹t tÝnh enzym Taq cßn l¹i 65% sau 50 chu k× ph¶n øng. Nång ®é enzym Taq tèi ­u cho ph¶n øng PCR lµ 0,5 - 2,5 ®¬n vÞ; nh­ng nÕu nång ®é enzym qu¸ cao sÏ lµm gi¶m hiÖu xuÊt xóc t¸c cña ph¶n øng. Ngoµi ra, nång ®é Mg2+ vµ dNTP còng ¶nh h­ëng ®Õn ho¹t tÝnh cña enzym. HiÖn nay, cã nhiÒu lo¹i polymerase chÞu nhiÖt kh¸c cã chøc n¨ng riªng biÖt vµ hoµn thiÖn h¬n nh­ Tth polymerase t¸ch chiÕt tõ Thermus thermophilus, cã kh¶ n¨ng ho¹t ®éng nh­ mét enzym phiªn m· ng­îc khi cã mÆt cña ARN khu«n vµ ion Mn2+. - ADN khu«n (template): ADN khu«n lµ vËt liÖu khëi ®Çu cho ph¶n øng PCR nªn ®ßi hái ph¶i cã ®é tinh s¹ch cao. ADN khu«n cã thÓ lµ sîi ®¬n hoÆc sîi ®«i cña chuçi ADN hayARN ®­îc biÕt tr­íc tr×nh tù ë hai ®Çu ®Ó thiÕt kÕ måi. Th«ng th­êng, nång ®é cña ADN khu«n ®­îc ®­a vµo ph¶n øng PCR kho¶ng 10 - 500 ng. - §o¹n måi (primer): C¸c ®o¹n måi thùc chÊt lµ c¸c oligonucleotit dµi kho¶ng 4 - 10 baz¬ (®èi víi måi ngÉu nhiªn) hoÆc kho¶ng 12 - 24 baz¬ (®èi víi måi ®Æc tr­ng). Nång ®é måi thÝch hîp ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng PCR lµ tõ 0,1 - 0,5 (M. L­îng måi ®­a vµo ph¶n øng PCR ph¶i phï hîp víi l­îng ADN cÇn tæng hîp (th­êng 106 ph©n tö ADN cÇn 108 ph©n tö primer). NÕu nång ®é måi qu¸ thÊp th× måi sÏ hÕt tr­íc khi sè chu k× kÕt thóc, cßn nång ®é måi qu¸ cao th× sÏ dÔ lµm t¨ng s¶n phÈm kh«ng ®Æc hiÖu. C¸c ®o¹n måi cÇn cã tÝnh ®Æc thï ®Ó lµm t¨ng tÝnh ®Æc hiÖu cña ph¶n øng. Måi ph¶i ®­îc thiÕt kÕ sao cho kh«ng ®­îc bæ trî lÉn nhau, sè l­îng 4 lo¹i baz¬ nit¬ trong måi nªn xÊp xØ nhau, l­îng G - C gi÷a hai måi ph¶i b»ng nhau, tr¸nh nh÷ng vïng tr×nh tù kh«ng b×nh th­êng nh­ polypurin hoÆc polyprimidine hay c¸c tr×nh tù lÆp. - C¸c nucleotit (dNTPs): Lµ hçn hîp cña bèn lo¹i deoxyribonucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) lµm nguyªn liÖu cho ph¶n øng tæng hîp ADN. Tuú thuéc vµo môc ®Ých nghiªn cøu, c¸c nhµ khoa häc cßn cã thÓ sö dông mét sè nucleotit ®· ®­îc thay ®æi nh­ g¾n thªm biotin hoÆc digoxigenin... Nång ®é ph¶n øng cña c¸c dNTP th­êng dïng vµo kho¶ng 200 mM mçi lo¹i, tuy nhiªn ë nång ®é dNTP thÊp (10 - 100 mM) Taq ADN polymerase ho¹t ®éng chÝnh x¸c h¬n. H¬n n÷a, nång ®é tèi ­u cña chóng phô thuéc vµo rÊt nhiÒu yÕu tè nh­: + Nång ®é Mg2+ + Nång ®é chÊt måi + §é dµi cña s¶n phÈm ®­îc khuyÕch ®¹i + Sè chu kú cña ph¶n øng - Dung dÞch ®Öm (buffer) Thµnh phÇn cña dung dÞch ®Öm phô thuéc vµo lo¹i enzym polymerase ®­îc sö dông. Trong dung dÞch ®Öm quan träng nhÊt lµ ion Mg2+. Ion Mg2+ lµm t¨ng nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ADN m¹ch ®«i, t¹o ra phøc chÊt tan víi dNTPs ®Ó h×nh thµnh c¬ chÊt mµ enzym polymerase cã thÓ nhËn ra, ®iÒu nµy rÊt cÇn thiÕt cho qu¸ tr×nh liªn kÕt cña c¸c dNTP. Nång ®é Mg2+ trong hçn hîp ph¶n øng cuèi cïng biÕn ®æi tõ 0,5 - 5,0 mM (nång ®é nµy cã thÓ thay ®æi khi cÇn thiÕt). Nång ®é ion Mg2+ qu¸ thÊp sÏ lµm gi¶m kh¶ n¨ng tæng hîp cña enzym polymerase, cßn nÕu nång ®é qu¸ cao sÏ t¹o ra nh÷ng ph©n ®o¹n kh«ng ®Æc hiÖu. Nh×n chung nång ®é MgCl2 cã ¶nh h­ëng nhiÒu tíi hiÖu qu¶ vµ tÝnh ®Æc thï cña ph¶n øng. Ngoµi Mg2+ cßn mét sè chÊt kh¸c trong dung dÞch ®Öm nh­ AMSO, DMSO, formamide ®­îc thªm vµo nh­ c¸c chÊt phô gia nh»m t¹o ra c¸c s¶n phÈm PCR cã kÝnh th­íc lín [3]. Kü thuËt PCR lµ mét c«ng cô h÷u hiÖu cho viÖc ph©n tÝch hÖ gen cña sinh vËt v× nã cã kh¶ n¨ng t¹o ra mét l­îng lín tr×nh tù ANDN ®Æc hiÖu tõ bÊt cø c¬ thÓ nµo. PCR ®­îc sö dông vµo nhiÒu môc ®Ých kh¸c nhau nh­: x¸c ®Þnh tr×nh tù trùc tiÕp tõ ®o¹n ®­îc nh©n, nh©n b¶n quÇn thÓ mARN ®Ó lµm mÉu lai, x¸c ®Þnh c¸c tr×nh tù ®Æc hiÖu tõ cADN hay th­ viÖn gen, x¸c ®Þnh sinh vËt chuyÓn gen, t¹o ®ét biÕn ®Þnh h­íng [1]. 1.3.2. Kü thuËt RAPD vµ øng dông Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, nhiÒu kü thuËt míi ra ®êi dùa trªn nguyªn t¾c cña PCR cho phÐp ta x¸c ®Þnh ®­îc tÝnh ®a d¹ng cña hÖ gen víi nhiÒu ­u ®iÓm nh­ kü thuËt AFLP, SSR, RFLP, RAPD..... - Kü thuËt AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cho phÐp ta ph¸t hiÖn ®­îc tÝnh ®a d¹ng vÒ chiÒu dµi c¸c ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n chän läc - c¾t ra bëi enzym giíi h¹n. Sö dông kü thuËt nµy cã thÓ nh©n cïng mét lóc mét c¸ch ®Æc tr­ng víi sè l­îng lín c¸c ®o¹n ADN cã kÝch th­íc giíi h¹n. Kü thuËt AFLP kÕt hîp ®­îc nh÷ng ­u ®iÓm cña RFLP vµ RAPD nªn nã cã hiÖu qu¶ trong viÖc ph¸t hiÖn ®a h×nh ADN. Ngoµi ra, kü thuËt nµy cã thÓ ph©n tÝch tÝnh ®a h×nh mét c¸ch nhanh chãng, æn ®Þnh vµ ®¸ng tin cËy [3]. - Kü thuËt RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphic ADN - ®a h×nh vÒ chiÒu dµi cña c¸c ®o¹n ADN ®­îc c¾t ngÉu nhiªn bëi c¸c enzym giíi h¹n): Sö dông kü thuËt RFLP cã thÓ t¹o nªn c¸c ®o¹n c¾t kh¸c nhau ®­îc ph©n biÖt b»ng ph­¬ng ph¸p ®iÖn di. Nh­îc ®iÓm cña kü thuËt nµy lµ quy tr×nh phøc t¹p, cång kÒnh, khã tù ®éng ho¸, tèn kÐm vµ sö dông chÊt ®ång vÞ phãng x¹ g©y nguy hiÓm cho ng­êi thao t¸c [3], [8]. - Kü thuËt SSR (Simple Sequence Repeats) hay cßn gäi lµ vi vÖ tinh (microsatellites), lµ mét ®o¹n ADN cã sù lÆp l¹i cña mét trËt tù nucleotit ®¬n gi¶n nµo ®ã. Kü thuËt SSR cho phÐp ph¸t hiÖn ®­îc tÝnh ®a h×nh vÒ ®é dµi c¸c trËt tù nucleotit ®¬n gi¶n. Nh­îc ®iÓm cña kü thuËt SSR lµ tèn kÐm vÒ tiÒn cña, c«ng søc trong viÖc x©y dùng cÆp måi ®Æc hiÖu cho mçi locus ®a h×nh (®Ó x©y dùng c¸c cÆp måi ®Æc hiÖu cÇn t¸ch dßng vµ ®äc tr×nh tù mét sè l­îng lín c¸c ®o¹n ADN hÖ gen chøa ®o¹n lÆp l¹i) [8], [3]. - Kü thuËt RAPD (cßn ®­îc gäi lµ kü thuËt ph©n lo¹i ph©n tö): ®­îc sö dông ®Ó ph©n tÝch vµ x¸c ®Þnh mèi quan hÖ th©n thuéc gi÷a c¸c gièng c©y trång hay gi÷a c¸c c¸ thÓ, phôc vô cho c«ng t¸c lai t¹o gièng hoÆc ph©n lo¹i. ¦u ®iÓm cña kü thuËt nµy lµ nhanh, rÎ, ®¬n gi¶n vµ gióp x¸c ®Þnh tÝnh ®a d¹ng sinh häc, nguån gèc di truyÒn cña c¸c gièng ®éng vËt, thùc vËt, vi sinh vËt. N¨m 1990, William vµ CS ®· ph¸t triÓn kü thuËt RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN) trªn c¬ së PCR. VÒ c¬ b¶n, kü thuËt nµy sö dông nh÷ng ®o¹n måi ng¾n kho¶ng 4 - 10 nucleotit kh«ng ®Æc tr­ng ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng PCR. Nh­ng ®èi víi mçi ®èi t­îng, ta ph¶i tiÕn hµnh sµng läc ®Ó chän läc ®­îc mét sè måi thÝch hîp [1]. S¶n phÈm PCR khi dïng víi måi ngÉu nhiªn th­êng ®a d¹ng, cã chiÒu dµi tõ 100 - 5000 nucleotit vµ khi ®iÖn di trªn gel agarose ®­îc ph©n t¸ch thµnh c¸c ph©n ®o¹n kh¸c nhau. TÝnh ®a d¹ng thu ®­îc nhê kü thuËt RAPD lµ ®¸ng tin cËy v× khi cã sù thay ®æi mét baz¬ nit¬ nµo ®ã th× nã sÏ ng¨n c¶n sù tiÕp hîp cña måi víi ADN khu«n. sù mÊt ®o¹n nhiÔm s¾c thÓ hoÆc sù thªm bít ®iÓm g¾n måi còng nh­ sù xen vµo mét gen nµo ®ã sÏ lµm thay ®æi kÝch th­íc cña ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n. mçi ®o¹n måi cã thÓ t¹o ra mét hoÆc mét vµi sù ®a d¹ng, cã thÓ ph¸t hiÖn ®­îc vµ cho ra phæ ®iÖn di ®Æc tr­ng. Kü thuËt RADP ®­îc sù dông trong c¸c môc ®Ých nghiªn cøu ®a h×nh di truyÒn, lËp b¶n ®å gen liªn kÕt vµ ph©n tÝch con lai F1. ­u ®iÓm cña kü thuËt RADP lµ kh«ng cÇn biÕt tr×nh tù ®o¹n ADN cÇn nghiªn cøu, quy tr×nh tiÕn hµnh nhanh, chØ cÇn mét l­îng nhá ADN khu«n. Bªn c¹nh ®ã, chØ cÇn mét bé måi ta cã thÓ sö dông ®­îc víi c¸c loµi kh¸c nhau trong khi c¸c mÉu dß RFLP chØ cã thÓ dïng ®­îc cho c¸c loµi cã quan hÖ gÇn gòi nhau. TÝnh ®a d¹ng thu ®­îc tõ c¸c chØ thÞ RAPD ®­îc ®¸nh gi¸ cao h¬n so víi kü thuËt RFLP vµ cho phÐp ph¸t hiÖn ®­îc tÝnh ®a d¹ng ngay c¶ trong c¸c ®o¹n chøa c¸c trËt tù nucleotit lÆp l¹i. Nh­îc ®iÓm cña chØ thÞ nµy lµ: chØ thÞ RAPD cã tÝnh chÊt tréi do ®ã nh÷ng gen ®iÒu khiÓn tÝnh tr¹ng nµo ®ã cã tÝnh lÆn sÏ khã t×m thÊy sù ®a h×nh trªn gel ®iÖn di. H¬n n÷a, RAPD cã tÝnh chÊt ngÉu nhiªn nªn viÖc lÆp l¹i ph©n tÝch ®iÖn di ®Ó t×m liªn kÕt gen th­êng kh«ng thèng nhÊt [3]. C¸c nghiªn cøu gÇn ®©y cho thÊy RAPD lµ mét kü thuËt cã hiÖu qu¶ trong viÖc x¸c dÞnh kiÓu gen, ph©n tÝch quÇn thÓ vµ nguån gèc loµi, nghiªn cøu di truyÒn loµi vµ lËp b¶n ®å di truyÒn. Kü thuËt RAPD ®­îc sö dông ®Ó nhËn biÕt vµ ph©n lo¹i c¸c gièng c©y kh¸c nhau, sù ®a d¹ng di truyÒn gi÷a lóa Indica vµ Japonica, x¸c ®Þnh sù ®a h×nh cña c¸c c©y t¸i sinh cã nguån gèc m« sÑo, tÕ bµo huyÒn phï vµ tÕ bµo trÇn... Yang vµ Quiros ®· sö dông 28 ®o¹n måi cã ®é dµi 10 bp ®Ó nghiªn cøu sù kh¸c biÖt cña 23 gièng cÇn t©y vµ chóng ®­îc chia thµnh 3 nhãm. KÕt qu¶ nµy còng phï hîp khi dïng 6 chØ thÞ protein ®Ó ph©n lo¹i c¸c gièng cÇn t©y trªn (Yang vµ Quiros, 1993). T­¬ng tù nh­ vËy, nhiÒu t¸c gi¶ ®· dïng RAPD ®Ó lËp c©y chñng lo¹i ph¸t sinh (phylogenic tree) cña c¸c loµi c©y nh­ ng«, ®u ®ñ, hµnh t©y, xoµi, cá ®inh l¨ng…[26], [31]. Dùa trªn sù xuÊt hiÖn hay biÕn mÊt cña c¸c ph©n ®o¹n ADN khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD ®­îc quan s¸t thÊy ë c¸c c¸ thÓ kh¸c nhau vµ ®­îc ®¸nh gi¸ theo qui ­íc 1 = xuÊt hiÖn vµ 0 = biÕn mÊt. Mét b¶ng gåm c¸c gi¸ trÞ 0 vµ 1 ®­îc thiÕt lËp tõ c¸c c¸ thÓ nghiªn cøu sÏ cho phÐp tÝnh ra hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c cÆp theo Nei vµ Li. Trong qu¸ tr×nh thiÕt lËp mèi quan hÖ gi÷a c¸c loµi hay nhãm loµi, mét sè t¸c gi¶ (Apostol vµ CS, 1993) ®· x©y dùng kü thuËt ph©n nhãm th«ng qua c¸c biÓu ®å RAPD (RAPDLOT). Thùc chÊt kü thuËt nµy gåm 3 b­íc: + B­íc 1: So s¸nh tõng cÆp ®èi t­îng trong nghiªn cøu b»ng c¸ch tÝnh to¸n kho¶ng c¸ch quan hÖ gi÷a chóng + B­íc 2: LËp mét ma trËn gåm tÊt c¶ nh÷ng gi¸ trÞ tÝnh to¸n ®­îc tr­íc ®ã + B­íc 3: Gi¶i ma trËn vµ biÔu diÔn thµnh mét biÓu ®å ®Æc tr­ng [17] Ngµy nay, c¸c nhµ nghiªn cøu ®· thiÕt lËp ®­îc phÇn mÒm m¸y tÝnh ®Ó tù ®éng vÏ nªn biÓu ®å mèi quan hÖ hay ®é t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c ®èi t­îng nghiªn cøu sau khi nhËp d÷ liÖu vÒ c¸c ph©n ®o¹n ®­îc nh©n b¶n cña c¸c c¸ thÓ. NTSYS pc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) lµ tªn cña mét ch­¬ng tr×nh thuéc kiÓu trªn ®Ó lËp ra biÓu ®å h×nh c©y. BiÓu ®å h×nh c©y thu ®­îc sÏ thÓ hiÖn møc ®é gÇn nhau cña c¸c c¸ thÓ cho phÐp ®¸nh gi¸ ®­îc mèi quan hÖ di truyÒn gi÷a c¸c c¸ thÓ ®­îc nghiªn cøu. Ch­¬ng tr×nh nµy cho phÐp gi¶m bít thêi gian nghiªn cøu vµ cã ®é chÝnh x¸c cao nªn nã lµ mét phÇn mÒm cã hiÖu qu¶ trong viÖc ph©n tÝch kü thuËt RAPD.