Đề tài Định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1

Mở đầu Theo thống kê của Tổ chức Nghiên cứu ung thư Thế giới (International Agency for Research on Cancer_ IARC), ung thư phổi là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong số các bệnh về ung thư. Tổng số người chết vì ung thư phổi hàng năm cao hơn tổng số người chết vì ung thư vú, ung thư ruột và ung thư tuyến giáp, và đứng thứ hai trong tổng số tử vong vì bệnh sau các bệnh về tim mạch. Các thống kê từ hiệp hội Ung thư quốc gia của Việt Nam cũng đưa ra những cảnh báo tương tự, số bệnh nhân ung thư phổi gia tăng liên tục trong những năm gần đây. Phần lớn bệnh nhân ung thư khi được phát hiện đã ở giai đoạn cuối không chữa trị được, đa số bệnh nhân bị tử vong. Vì rất nhiều lí do như: hút thuốc lá, môi trường sống bị ô nhiễm, thực phẩm không an toàn…..nên căn bệnh nguy hiểm này ngày càng trở nên phổ biến. Mặc dù đây là một căn bệnh rất nguy hiểm nhưng nếu bệnh nhân được phát hiện sớm và được điều trị theo những phác đồ thích hợp thì người bệnh vẫn có cơ hội được cứu sống, thậm chí là khỏi bệnh. Ngoài những phương pháp chẩn đoán ung thư truyền thống như: chụp hình phổi bằng X_quang, chụp CT Scan phổi….các nhà khoa học đang nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra cách chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh ung thư. Sự phát triển như vũ bão của ngành sinh học phân tử đã mở ra một hướng mới trong nghiên cứu Sinh_Y_Dược học. Việc tìm ra những chỉ thị sinh học đã giúp cho các bác sĩ chẩn đoán và phát hiện bệnh một cách nhanh chóng, có độ chính xác cao hơn. Các chỉ thị sinh học có liên quan đến chẩn đoán bệnh ung thư cũng đang được quan tâm. Trong đo, Cyfra21-1 là một chỉ thị có độ nhạy tương đối cao đối với ung thư phổi và đang được nghiên cứu. Do đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 bằng kỹ thuật Real-time PCR”. Để từ đó nghiên cứu và tạo ra một bộ Kít định lượng để có thể chẩn đoán Ung thư phổi một cách nhanh chóng, có độ chính xác cao. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Ung thư phổi 1.1.1. Khái niệm chung về ung thư phổi Ung thư phổi còn được gọi là ung thư phế quản – phổi nguyên phát, gây ra do tế bào ung thư phát triển từ biểu mô phế quản (hiếm khi phát triển từ biểu mô phế nang). Ung thư phổi khi đã phát hiện được thường là một khối rắn chắc có đường kính từ 2- 10cm, thậm chí còn lớn hơn. Mặt ngoài khối u thường gồ ghề, nhiều múi, nhăn nhúm. Mặt cắt khối u thường đồng nhất, hay có mầu trắng như tổ chức não. 1.1.2. Phân loại ung thư phổi Tùy thuộc vào hình dạng quan sát được dưới kính hiển vi mà người ta phân chia ung thư phổi thành hai loại chính: ung thư phổi tế bào nhỏ và ung thư phổi không phải tế bào nhỏ. Mỗi loại ung thư phát triển theo những cách khác nhau và được điều trị theo những phác đồ điều trị khác nhau. - Ung thư phổi tế bào nhỏ (small_cell carcinoma) chiếm khoảng 20% trong số các bệnh ung thư phổi, loại này thường phát triển ở phế quản – phổi (không ở ngoại vi phổi). Mặc dù tế bào ung thư là những tế bào nhỏ, nhưng chúng phát triển rất nhanh và tạo thành những khối u lớn, có khả năng lan rất xa trước khi có triệu chứng lâm sàng. Nhiều trường hợp khi phát hiện không thể mổ được nữa, tử vong nhanh. Đây là loại ung thư có quan hệ mật thiết với thuốc lá và là loại ung thư ác tính nhất.[3] - Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (non small _cell carcinoma) chiếm khoảng 80% trong số các bệnh ung thư phổi, ung thư phổi không phải tế bào nhỏ thường gặp hơn ung thư phổi tế bào nhỏ. Nó thường phát triển và lan chậm hơn ung thư phổi tế bào nhỏ. Có ba loại ung thư phổi không phải tế bào nhỏ chủ yếu, chúng được đặt tên theo loại tế bào mà từ đó ung thư phát triển.[3] + Ung thư tế bào tuyến (adenocarcinoma, AC): xuất phát từ tế bào tuyến nhầy trong thành phế quản, chiếm tỷ lệ khoảng 30-45% trong các loại ung thư phổi. Đây là loại ung thư phổi phổ biến nhất ở phụ nữ và những người không hút thuốc.[3] + Ung thư tế bào sừng (squamous_cell carcinoma; SCC): hay xuất hiện ở phế quản lớn và làm chít hẹp lòng phế quản.Đây là loại ung thư phổi phổ biến nhất ở nam giới, chiếm tỷ lệ khoảng 30-35% trong các loại ung thư phổi.[3] + Ung thư tế bào lớn (large_cell carcinoma; LCC): hình thành gần bề mặt phổi, chiếm tỷ lệ khoảng 10-15% trong các loại ung thư phổi.[3] 1.1.3. Triệu chứng của bệnh ung thư phổi Những người mắc bệnh ung thư phổi thường có các triệu chứng sau: - Ho không khỏi và ngày càng nặng hơn. - Thường xuyên thấy đau ngực. - Ho ra máu. - Khó thở, ngạt mũi, khản giọng. - Phù nề vùng mặt và cổ. - Mệt mỏi. - Mất cảm giác ngon miệng, sút cân. - Thường xuyên bị viêm phổi và viêm phế quản. 1.1.4. Chẩn đoán bệnh ung thư phổi Khi người bệnh bị nghi ngờ mắc ung thư phổi, các bác sĩ sẽ xem xét tiền sử người bệnh, tiền sử hút thuốc, tiếp xúc với các chất ở môi trường tự nhiên và môi trường lao động, các yếu tố di truyền…..Sau đó, các bác sĩ có thể cho chụp X_Quang lồng ngực, xét nghiệm tế bào trong đờm (quan sát dưới kính hiển vi những tế bào lấy từ mẫu dịch nhầy ở phổi khi ho), đây là một xét nghiệm đơn giản mà có thể có ích cho việc phát hiện ra bệnh ung thư phổi. Ngoài ra, con có thể sử dụng kĩ thuật Sinh thiết (lấy một mẫu mô nhỏ ở phổi để quan sát dưới kính hiển vi. Qua đó có thể cho biết một người có bị ung thử phổi hay không). Một số thủ thuật dùng để lấy mẫu bệnh phẩm: nội soi phế quản, chọc hút bằng kim, chọc dịch màng phổi, mở lồng ngực…..Hiện nay, còn có thêm các xét nghiệm mẫu máu, sử dụng các chỉ thị như Cyfra 21-1 để chẩn đoán bệnh.[1] 1.1.5. Các nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thư phổi Các công trình nghiên cứu hiện nay chưa cho biết chính xác nguyên nhân gây ra ung thư phổi. Tuy vậy, người ta cũng xác định được những yếu tố gắn liền với quá trình phát sinh bệnh như: hút thuốc lá, tiếp xúc nhiều với các hóa chất độc hại như amiang, niken…. 1.1.5.1. Nghiện hút thuốc lá, thuốc lào Trong khói thuốc lá có chứa các chất Hydrocacbua thơm nhiều vòng, trong số đó độc nhất là chất 3,4 benzopyrene với hàm lượng 0.5 µg/1 điếu thuốc lá (P.Freour, 1979). Chất này đóng vai trò quan trọng trong phát sinh ung thư phổi. Ngoài ra trong khói thuốc lá còn chứa các chất gây ung thư khác như nitrosamine, benzanthracene. Các chất này cũng là nguyên nhân gây ra bệnh Ung thư phổi. Trong khóa họp vào tháng 11 năm 1982 tại Geneve, các chuyên gia về ung thư phổi đã thống nhất kết luận rằng 80-90% nguyên nhân dẫn đến ung thư phổi là do hút thuốc lá. Tại Việt Nam, theo thống kê trên 389 bệnh nhân mắc ung thư phổi đã được phẫu thuật thì: 70% số bệnh nhân có hút thuốc lào, 52% hút thuốc lá, 10,49% hút cả thuốc lá và thuốc lào. Những người hút các loại khác và những người hít phải khói thuốc lá (hút thuốc lá thụ động) cũng có nguy cơ tương tự. Ngừng hút thuốc lá sẽ làm giảm đáng kể khả năng mắc ung thư phổi. 1.1.5.2. Radon Radon là một chất khí phóng xạ không màu, không mùi và không nhìn thấy bằng mắt thường. Trong tự nhiên radon có trong sỏi đá. Nó có thể làm tổn hại tới phổi và từ đó có thể dẫn đến ung thư phổi. Những người làm việc trong hầm mỏ có thể tiếp xúc với khí radon. Ở một số vùng ở Mỹ, người ta còn tìm thấy khí radon ở trong những ngôi nhà. 1.1.5.3. Amiang Amiang là tên gọi của một nhóm các chất khoáng, chúng tồn tại trong tự nhiên dưới dạng sợi và được sử dụng trong một số nghành công nghiệp. Amiang có hai nhóm chính là nhóm amphibole và nhóm serpentine. Nhóm amphibole khi hấp thụ qua đường hô hấp và lưu lại trong phổi sẽ rất khó bị đào thải ra ngoài. Các sợi thuộc nhóm amphibole là nguyên nhân chính gây ra các bệnh ung thư phổi, u trung biểu mô. 1.1.5.4. Nghề nghiệp Các thống kê bệnh học cho thấy, chất phóng xạ đóng vai trò quan trọng trong phát sinh bệnh ung thư. Những người thường xuyên tiếp xúc với các chất phóng xạ, niken, cromat, amian và các chất sinh ra do chưng cất hắc ín thường dễ bị ung thư. Các chất này cũng là nguyên nhân dẫn đến Ung thư phổi ở những người không hút thuốc (chiếm khoảng 15-20%). Nghiên cứu của Doll (1958) cho thấy: công nhân làm việc trong công nghiệp niken bị chết do Ung thư phổi là 26%, cao hơn 9 lần so với những công nhân làm việc trong các ngành công nghiệp khác. 1.1.5.5. Môi trường Các nhà nghiên cứu đã tìm ra mối liên kết giữa bệnh ung thư phổi và sự phơi nhiễm với một số chất gây ô nhiễm môi trường không khí nhất định (ví dụ: các sản phẩm phụ sinh ra trong quá trình đốt dầu Diezen và những nguyên liệu hóa thạch). Tuy nhiên, mối quan hệ này vẫn chưa được xác định một cách rõ ràng và vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu. Nhiều thống kê cho thấy, tỉ lệ mắc ung thư phổi ở các thành phố công nghiệp, đặc biệt là các thành phố có ngành công nghiệp hóa chất cao hơn hẳn so với các vùng nông thôn. Trong bầu khí quyển của các thành phố này có chứa nhiều chất độc hại như benzopyren…..Các chất này kích thích và gây ra phản ứng với lớp niêm mạc của đường hô hấp làm cho quá trình tiết chất nhầy bị chậm lại, sau đó biểu mô bị bong ra, rồi lại được tái sinh. Những chu kì như vậy liên tiếp diễn ra đã kích thích sự tăng sản của tế bào đáy, dị sản của tế bào biểu mô đẫn đến sự hình thành và phát triển của các tế bào ung thư. 1.1.5.6. Các yếu tố khác Ngoài những nguyên nhân trên, các nhà khoa học còn phát hiện thấy virus là nguyên nhân gây Ung thư phổi ở khỉ. Điều này đặt ra câu hỏi: liệu ung thư phổi có phải do virus gây ra không? Đây vẫn là một ẩn số lớn đối với các nhà khoa học. Tiền sử bản thân người bệnh cũng là một nguyên nhân gây ung thư phổi. Một người đã mắc ung thư phổi một lần có nguy cơ mắc ung thư phổi lần hai cao hơn so với một người chưa bao giờ mắc bệnh ung thư phổi.Bỏ hút thuốc sau khi được chẩn đoán ung thư phổi có thể ngăn ngừa nguy cơ bị ung thư phổi lần hai. Các nhà nghiên cứu vẫn tiếp tục tìm hiểu những nguyên nhân gây ra bệnh ung thư phổi và tìm kiếm những cách thức để phồng chống căn bệnh này. Chúng ta đã biết, cách tốt nhất để phòng chống bệnh ung thư phổi là bỏ hút thuốc lá, càng bỏ hút thuốc lá sớm thì càng tốt. Thậm chí, nếu bạn đã hút thuốc lá trong một thời gian dài thì việc bỏ hút thuốc lá cũng vẫn không bao giờ là quá muộn. 1.2. Kháng nguyên Cyfra 21-1 1.2.1. Kháng nguyên 1.2.1.1. Định nghĩa Kháng nguyên được định nghĩa là một chất tương tác với các phân tử kháng thể và thụ thể kháng nguyên trên các tế bào lympho. Một chất gây miễn dịch là một kháng nguyên được cơ thể nhận biết như một chất ngoại lai và kích thích phản ứng miễn dịch thích ứng. Để đơn giản hóa, kháng nguyên và chất gây miễn dịch đều được xem là kháng nguyên.[2,3] 1.2.1.2. Bản chất hóa học của kháng nguyên Về bản chất hóa học, kháng nguyên là những phân tử protein có khối lượng phân tử lớn (kể cả các protein cộng hợp như các glycoprotein, lipoprotein và nucleoprotein) và các polysaccharide (kể cả lipopolysaccharide). Các kháng nguyên protein và polysaccharide này được tìm thấy trên bề mặt của virus, tế bào vi khuẩn, nấm, đơn bào và tế bào người.[3] 1.2.1.3. Nguồn gốc kháng nguyên 1.2.1.3.1. Kháng nguyên ngoại sinh Kháng nguyên ngoại sinh là kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể từ bên ngoài do: hít, ăn, tiêm. Bằng quá trình nhập nội bào hoặc thực bào, các kháng nguyên này được đưa vào tế bào trình diện kháng nguyên (ACP) và được xử lí thành các mảnh nhỏ. Sau đó các ACP trình diện các mảnh nhỏ này cho tế bào Lympho T giúp đỡ (CD4+) bằng cách dung phân tử phù hợp mô loại II trên bề mặt của chúng. Một số tế bào Lympho T đặc hiệu cho phức hợp peptide: MHC. Chúng trở nên hoạt hoá và bắt đầu tiết Cytokine. Cytokine là các chất có khả năng hoạt hoá Lympho bào T độc tế bào (CLL), tế bào Lympho B tạo kháng thể, đại thực bào và các tế bào khác. 1.2.1.3.2. Kháng nguyên nội sinh Kháng nguyên nội sinh là các kháng nguyên được sản xuất bên trong tế bào, là kết quả của quá trình chuyển hoá tế bào bình thường, hoặc do nhiễm khuẩn nội bào hay nhiễm virus. Sau đó các mảnh kháng nguyên được trình diện trên bề mặt tế bào trong phức hợp phân tử phù hợp mô loại I. Nếu tế bào Lympho T CD8+ độc tế bào nhận ra chúng, các tế bào Llympho T này bắt đầu tiết các loại độc tố khác nhau gây ly giải hoặc chết theo chương trình (apoptosis) tế bào bị nhiễm. Để giữ tế bào độc tế bào khỏi giết nhầm các tế bào vốn chỉ sản xuất protein của chính nó, các tế bào lympho T tự đáp ứng được loại ra khỏi quá trình miễn dịch qua cơ chế dung nạp trung ương (cũng được biết là quá trình chọn lọc âm tính xảy ra ở tuyến ức). Chỉ những Lympho bào T độc tế bào nào không phản ứng với peptide của chính nó (peptide này được trình diện trong tuyến ức qua phân tử MHC loại I) mới được phép vào máu. Có một ngoại lệ không thuộc ngoại sinh lẫn nội sinh được gọi là trình diện chéo. 1.2.1.4. Kháng nguyên khối u Kháng nguyên khối u là các kháng nguyên được trình diện bởi các phân tử MHC I trên bề mặt tế bào khối u. Đôi khi các kháng nguyên này chỉ được trình diện bởi các tế bào khối u và không có ở tế bào thường. Trong trường hợp này, chúng được gọi là kháng nguyên đặc hiệu khối u và thường là kết quả của một đột biến đặc hiệu cho khối u. Phổ biến hơn, các kháng nguyên này được trình diện ở tế bào khối u lẫn tế bào thường, khi đó chúng được gọi là kháng nguyên liên hệ khối u. Nếu lympho bào T độc bào nhận ra kháng nguyên này, chúng có thể tiêu diệt tế bào khối u trước khi tế bào khối u tăng sinh và di căn. Kháng nguyên khối u cũng có thể có trên bề mặt khối u ở dạng thụ thể bị đột biến. Trong trường hợp này chúng bị nhận diện bởi tế bào B. 1.2.1.5. Các loại kháng nguyên -Miễn dịch nguyên: kháng nguyên loại này kích thích đáp ứng miễn dịch khi được đưa vào trong cơ thể. Miễn dịch luôn luôn là một đại phân tử (protein, polysaccharide). Khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của nó phụ thuộc vào tính lạ đối với vật chủ, kích thước phân tử, thành phần hoá học và tính không đồng nhất (vd: phân tử protein chứa nhiều loại amino axit khác nhau). -Dung nạp nguyên: kháng nguyên loại này kích thích tình trạng không đáp ứng miễn dịch đặc hiệu do hình dạng phân tử của nó. Khi thay đổi hình dạng, nó có thể trở thành miễn dịch nguyên. -Dị ứng nguyên: đây là chất gây phản ứng dị ứng. Chúng có thể xâm nhập vào cơ thể qua nhiều con đường như: ăn, hít, tiêm hoặc tiếp xúc với da. Tế bào trình diện với kháng nguyên của chúng qua phân tử phù hợp mô. Các tế bào miễn dịch khác nhau có thể được hoạt hoá tuỳ thuộc vào kháng nguyên được trình diện và loại phân tử phù hợp mô. 1.2.2. Kháng nguyên Cyfra 21-1 Trên thế giới hiện nay có khá nhiều chỉ thị sinh học liên quan đến ung thư phổi, trong đó các nhà khoa học đang rất quan tâm đến một chỉ thị mới, có độ nhạy cao với ung thư phổi là Cyfra 21-1 nằm trong nhóm chỉ thị Cytokeratin, một cấu trúc trong bộ khung tế bào. 1.2.2.1. Cytokeratin Cytokeratin thuộc họ sợi trung gian, đặc biệt hữu ích trong chẩn đoán bất thường ở tế bào, chẳng hạn như ung thư. Bởi vậy, các nhà ung thư học hiện nay đang tích cực nghiên cứu kỹ hơn về cấu trúc và vai trò của Cytokeratin, nhằm tìm ra giải pháp chống lại sự hoành hành của căn bệnh toàn cầu – Căn bệnh ung thư. Cấu trúc sợi đã được quan sát trong nhân và tế bào chất từ rất lâu. Nhưng chỉ ngần đây, những kiến thức về chức năng thực sự của bộ khung tế bào mới được tìm hiệu cặn kẽ và chi tiết. Ở tế bào nhân chuẩn, bộ khung tế bào được tạo thành từ 3 loại cấu trúc sợi, khác nhau về hình thái: vi sợi (microfilament), sợi trung gian (intermidiatefilament) và vi ống (microtubules). Bộ khung xương tế bào hợp nhất được hình thành từ hệ thống 3 loại sợi là yếu tố then chốt trong một quá trình như phân bào, vận động và tương tác tế bào với tế bào. Trong cấu trúc sợi, họ protein sợi trung gian là phức tạp nhất, bao gồm vài trăm thành viên khác nhau. Dựa trên những đặc điểm như sự tương đồng về trình tự và cách biểu hiện, người ta phân loại chúng thành một vài nhóm. Sợi trung gian nhóm I và II tạo thành Cytokeratine (theo thứ tự là các protein axit và bazo), trong khi đó sợi trung gian nhóm III gồm các protein axit dạng sợi desmin, vimentin và glial. Loại IV bao gồm các sợi protein thần kinh (NF-L, NF-M và NF-H) và internexin, còn protein nhóm V được gọi là các lamin nhân (chỉ cở nhân tế bào). Các protein cytokeratin còn lại đôi khi được xếp vào nhóm VI, gồm có felensin và phakinin. Cytokeratin biểu mô (sợi trung gian nhóm I và II) được hình thành trong quá trình phát sinh và có liên quan gần gũi về mặt sinh hóa và miễn dịch. Ngày nay, hơn 20 loại Cytokeratin khác nhau đã được biết đến và được chia thành các nhóm I và II dựa vào tính tương đồng trình tự. Các Cytokeratin từ 1-8 tạo thành nhóm II (53-68 kDa, các thành phần protein trunng tính đến bazo), còn Cytookeratin 9-20 tạo thành nhóm I (40-56 kDa, các protein axit), trong đó các Cytokeratin 8, 18, 19 có nhiều nhất ở các tế bào biểu mô đơn giản. Các Cytokeratin khi giải phóng khỏi các tế bào đang tăng sinh hoặc chết theo chương trình, tạo ra các chỉ thị hữu ích cho khối u biểu mô ác tính, phản ánh rõ nét hoạt động của tế bào. Những chỉ thị này xuất hiện đặc trưng cho các Cytokeratin nhất định và sự giải phóng tiểu đơn vị của chúng diễn ra liên quan đến apoptosis.[9,11,13,14] 1.2.2.1.1. Cấu trúc chung của một Cytokeratin Một Cytokkeratin điển hình bao gồn 3 vùng: vùng đầu N (không xoắn), vùng trung tâm (chủ yếu có cấu trúc xoắn) và đầu C (không xoắn). Phần xoắn ở vùng trung tâm (chủ yếu là cấu trúc xoắn alpha) gồm 300-320 axit amin có tính bảo tồn về trình tự và được chia thành 4 vùng khác nhau: 1A, 1B, 2A và 2B. Thành phần axit amin của cá vùng xoắn được bảo toàn về kích thước và chứa các trình tự axit amin lặp lại ở phần dư. Các đoạn xoắn tách biệt nhau nhờ các vùng liên kết ngắn hơn là L1, L1-2 và L2.[9,11,13,14,15] 1.2.2.1.2. Biểu hiện của Cytokeratin Cytokeratin biểu hiện khác nhau ở các dạng tế bào biểu mô, ở quy mô phát triển và quá trình biệt hóa của các mô. Trong suốt quá trình biến đổi của tế bào từ bình thường thành tế bào ác tính, đặc tính của Cytokeratin thường được duy trì. Ưu điểm này làm cytokeratin được ứng dụng như các chỉ thị khối u. Những biến đổi sau khi dịch mã của các vùng ở trung tâm rất hiếm thấy, nhưng những biến đổi này xuất hiện khá nhiều ở vùng đầu N và C, bao gồm sự phosphoryl hóa, glycosyl hóa và sự vận chuyển glutamine hóa. Những biến đổi này làm tăng tính tan và gây ra sự sắp xếp lại các sợi. Trong bộ khung, Cytokeratin là điển hình cho tính tan rất thấp, nhưng khi lưu thông người ta nhận thấy rằng các Cytokeratin đều bắt nguồn từ các sợi protein nguyên vẹn bị biến tính một phần tạo thành các phức hệ nhỏ hoặc các polymer protein lớn. Các phân tử Cytokeratin nguyên vẹn không tham gia trong lưu thông. Thời gian bán hủy của sợi Cytokeratin trong lưu thông khoảng 10-15h, phụ thuộc vào kích thước sợi. Quá trình giải phóng sợi Cytokeratin tan vào lưu thông diễn ra rất phức tạp và chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn. Trong lúc giải phóng tự khối u, có thể nhận ra Cytokeratin với một lượng lớn trong dịch thể gồm: máu, nước tiểu, dịch tế bào và dịch màng phổi. Thông thường trong các cá thể khỏe, nông độ Cytokeratin lưu thông rất thấp. Nồng độ tăng một cách đặc biệt trong những người bệnh có bệnh Ung thư biểu mô.[10] 1.2.2.2. Cyfra 21-1 Cyfra 21-1 là một phân đoạn của cytokeratin 19 (đặt tên theo chữ viết tắt của cytokeratin fragment) tiết ra mạnh khi tế bào biểu mô phổi tăng sinh bất thường. Cytokeratin 19 có cấu trúc giống các cytokeratin khác với kích thước khoảng 40 kDa, gồm 400 axit amin. Gene mã hóa cho cytokeratin 19 nằm trên nhiễm sắc thể 17 có kích thước 4667bp với 6 exon mã hóa cho mARN kích thước 1382bp. Fujita.J và các cộng sự cho rằng, sở dĩ cytokeratin 19 (40kDa) mất một phần đầu C để trở thành Cyfra 21-1 (37kDa) có liên quan đến vị trí Met-Asp nhậy cảm với một số protease.[12,16] 1.3. Kháng thể 1.3.1. Đinh nghĩa Kháng thể là một sản phẩm đặc hiệu được hệ miễn dịch tổng hợp giúp cơ thể tấn công các tác nhân gây bệnh. Kháng thể là các Immunoglobiulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào Lympho B, các tương bào (biệt hoá từ Lympho B) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hoá các tác nhân lạ. (Vd: các vi khuẩn hoặc virut).[3] 1.3.2. Cấu tạo Các kháng thể có cấu trúc hình chữ Y, có hai bộ “cành” gắn vào một “thân”. Các đầu của Y (Fab) được gọi là các vùng biến đổi, ở phía đầu các cành chứa các vùng gắn kết kháng nguyên (vùng quyết định bổ trợ, CDR) và thân (Fc) là một vùng hằng định. Các vùng hằng định chứa “lẫy khởi động” chức năng phản ứng lại kích thích bằng việc gắn kết các phức hệ của tế bào khác của hệ miễn dịch. Kháng thể thực hiện các chức năng cơ bản như liên kết đặc hiệu với kháng nguyên, hoạt hoá các bổ thể, hoạt hoá các tế bào miễn dịch. 1.3.3. Phân loại kháng thể 1.3.3.1. Kháng thể đa dòng Là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên một kháng nguyên cho trước. Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng thể tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên. Đáp ứng như vậy gọi là đa dòng. Các kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể liên kết với một epitope khác nhau 1.3.3.2. Kháng thể đơn dòng Là những kháng thể được tổng hợp từ một dòng tế bào Lympho B. Chúng chỉ nhận biết một epitope đặc hiệu trên một kháng nguyên cho sẵn.[3] Để tăng hiệu quả điều trị của các kháng thể đơn dòng, các nhà khoa học đã kết hợp các gene tái tổ hợp mã hoá các kháng thể đơn dòng có vùng gắn kết với cùng một vị trí (một epitope) của kháng nguyên. Các kháng nguyên đơn dòng có thể là: - Kháng thể đơn dòng chuột - Kháng thể đơn dòng khỉ - Kháng thể đơn dòng gà - Kháng thể đơn dòng người 1.3.3.3. Phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng - Kỹ thuật hybridoma - Tạo mảnh kháng thể đơn dòng bằng kỹ thuật gene - Kỹ thuật phage display (được dùng để tạo kháng thể đơn dòng dạng đơn chuỗi_scFv). 1.3.3.4. Kháng thể đơn chuỗi (scFv) Cùng với sự phát triển của công nghệ sản xuất kháng thể, các mảnh kháng thể được tạo ra bằng kỹ thuật sinh học đã đạt được những tiến bộ đáng kể. Kháng thể đơn chuỗi (scFv) là một trong những kháng thể phổ biến nhất. Kháng thể đơn chuỗi bao gồm vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (VL và VH) của phân tử kháng thể hoàn chỉnh được nối với nhau bằng linker polypeptide linh động. So với kháng thể đơn dòng thì kháng thể đơn chuỗi (scFv) có một số ưu điểm sau: - Chúng dễ dàng được sản xuất với số lượng lớn và giá thành. - Kích thướng nhỏ của chúng cho phép chúng dễ dàng xâm nhập vào mô và khối u rắn, có tính hướng đích cao. - Kháng thể đơn chuỗi dễ dàng được dung hợp với một protein khác như enzym hap protein phát huỳnh quang để tạo thành phân tử hoàn chỉnh dùng cho những thử nghiệm miễn dịch. 1.4 Phương pháp Real-time PCR 1.4.1. Kỹ thuật PCR 1.4.1.1. Định nghĩa PCR là tên gọi tắt của phản ứng chuỗi polymedase (Polymedase Chain Reaction = PCR) để nhân các bản của đoạn DNA trong ống nghiệm. 1.4.1. 2. Nguyên lý Phản ứng chuỗi polymedase (PCR) được Mullis và cộng sự mô tả đầu tiên và đã góp phần đem lại cho Mullis giải thưởng Nobel y học và sinh lý năm 1993. PCR là quá trình tương đối đơn giản cho phép nhân nhanh 1 số lượng không hạn chế nguyên bản 1 đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn. Quá trình nhân bản bằng Enzyme này bao gồm 3 bước lặp lại nhiều lần. - Bước 1: Biến tính DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ lên 94-95 oC trong khoảng thời gian ngắn. - Bước 2: Tiếp hợp đoạn mồi (primer) thông qua hạ nhiệt độ xuống 40-60oC. Hai đoạn mối là các oligonucletid dài khoảng 18-24 bazo sẽ tiếp hợp theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân. - Bước 3: Phản ứng polymedase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Hai phản ứng DNA mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu phân tử ban đầu. Để tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc thù, phản ứng tổng hợp được thực hiện ở 72 oC Loại polymedase thường dùng trong PCR là loại chịu nhiệt (Taq DNA polymedase) được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus hoặc chủ yếu là enzyme tái tổ hợp. Như vậy, mỗi vòng phản ứng sẽ có 2 lần số lượng DNA của đoạn DNA cần nhân được tổng hợp, hệ số nhân bản tính theo số chu kỳ n là 2n.[6] Vd: Sau 20 chu kỳ có tới trên 30 triệu bản của 1 đoạn DNA được nhân lên. 1.4.2. Kỹ thuật Real-time PCR 1.4.2.1. Nguyên lý Real-time PCR là PCR tại thời điểm thực, nghĩa là quá trình khuếch đại DNA đang diển ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp. Real-time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: - Quá trình khuếch đại DNA bằng PCR - Đo độ phát quang tỷ lệ thuận với số lượng phân đoạn DNA tạo thành. Hệ thống Real-time PCR bao gồm máy chu trình nhiệt (PCR) được nối với máy phát hiện quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Nguyên lý chủ yếu của Real-time PCR là dựa trên cơ sở phát hiện và định lượng thể thông báo huỳnh quang (fluorescent reporter). Hàm lượng sản phẩm PCR bắt đầu tăng lên cao từ chu kỳ ngưỡng (CT: threshold cycle) tương quan chặt chẽ với hàm lượng DNA đích ban đầu. Người ta thường sử dụng 3 dạng đầu dò để định lượng DNA bằng Real-time PCR: