Đề tài Enzyme Amylase

me Amylase Lớp 08DTP06 + Để loại muối và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ ta dùng phương pháp thẩm tích qua màng bán thấm. Tinh chất của màng này sẽ cho chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua . Các chất có trọng lượng phân tử lớn bị giữ lại (Enzyme , protein... ). + Để loại prôtein lạ và tạp chất có trọng lượng phân tử cao ta dùng phối hợp nhiều phương pháp khác nhau như sắc kí hấp phụ , sắc kí trao đổi ion , điện di lọc gel… a) Động vật: Enzyme Amylase có trong tụy tạng của động vật. Tụy tạng là ống dạng chùm, dài, lớn, nằm ngang phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng. Chiều dài của tụy tạng khoảng 30-35cm, và nặng khoảng 80-150g. Bên trong có những vách ngăn nhỏ chia tụy tạng thành nhiều thùy nhỏ. Tụy tạng vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết. Thu nhận Amylase từ động vật phần lớn là từ dịch tụy tạng. 98% tụy tạng được cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc là tế bào tuyến. Các tế bào này tiết Enzyme tiêu hoá vào trong tá tràng. b) Thực vật: Được lấy từ nhiều nguồn như: - Đại mạch (Hordeum sativum): có giống hai hàng và giống nhiều hàng (4,6 hàng), trong đó người ta sử dụng loại hai hàng để sản xuất malt làm bia, những loại còn lại để làm thức ăn cho gia súc. - Lúa (Oryse sativa L): Chủ yếu ở vùng Đông Nam Á - Ngô (Zea mays): có nhiều loại ngô: ngô đá, ngô bột, ngô răng ngựa. Hạt ngô có màu trắng, màu vàng hay màu hồng. Ngô màu vàng do có sự hiện diện của carotenoid và zeaxanthine ở trong nội nhũ, ngô màu hồng là do trong nội nhũ của ngô có anthocyanin c) Vi sinh vật: Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, VSV trở thành nguồn thu Enzyme Amylase chủ đạo. Những chủng VSV tạo nhiều Amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên. VSV tạo Amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn. - Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, Rhizopus - Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces. Endomycopsy, Endomyces cũng tạo Amylase. - Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn Amylase như: Bac. Polymyxa, Phytomonas destructans, Bact. cassavanum, Clostridium acetobutylium, Pseudomonas saccharophila… Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi - 18 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 nuôi chúng ít bị nhiễm VSV khác. Đáng chú ý là Bac. diastaticus, Bac. stearothermophilus, Bac. coagulans, Bac. circulans - Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo Amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng có một số chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora vulgaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ α-Amylase hoạt động ở 650C cùng với proteinase và các Enzyme khác. 2. Thu nhận Enzyme từ thực vật: a) Malt đại mạch: Malt là từ chỉ trạng thái hạt nảy mầm . Quá trình sản xuất malt gồm các bước sau : Ngâm hạt, ủ hạt cho nảy mầm, sấy malt tươi, tách mầm, bảo quản malt khô . * Yêu cầu về nguồn nguyên liệu - Hạt có màu vàng vàng óng ánh , thơm mùi rạ tươi . - Hạt phải thuần , tỷ lệ hạt ngoại lai chỉ được chiếm 5% . Không có hạt bị bệnh - Vỏ hạt < 7-9% trọng lượng hạt . Trọng lượng 1000 hạt khoảng 40-44g . - Sức nảy mầm ( qua ngày thứ 3 của quá trình nảy mầm ) : 80 -90% - Khả năng nảy mầm ( tính đến ngày thứ 5 của quá trình nảy mầm : > 95% ) - Độ ẩm của hạt khoảng 15% - Dung trọng : 650 – 680g/l - Hàm lượng protein : 9 – 12% - Hàm lượng tinh bột > 63 – 65% * Sản xuất Malt Các bước trong quy trình sản xuất malt đại mạch : Đại mạch ----- > làm sạch ------ > sấy bảo quản ------ > ngâm hạt ------- > ủ mầm ------ > malt tươi ------ > sấy malt ----- > tách mầm rễ ------ > malt khô Ngâm Hạt : Đại mạch được ngâm trong nước sạch cho đến khi đạt đến sự cân bàng về độ ẩm. Chú ý đến sự thông khí trong khối hạt bằng cách đảo trộn khối hạt thường xuyên. Mục đích của giai đoạn này là tạo độ ẩm cho hạt có điều kiện lấy đủ oxy, đẩy CO2 và các sản phẩm bất lợi cho quá trình nảy mầm của hạt ra ngoài khối hạt . Khi ngâm hạt, nước sẽ ngấm vào hạt làm cho thể tích hạt tăng nên, các Enzyme đang ở trạng thái không hoạt động chuyển sang trạng thái hoạt động và hoạt tính của Enzyme sẽ mạnh dần và thuỷ phân các chất dự trữ có phân tử lượng cao ở trong hạt thành các chất có phân tử lượng nhỏ hơn như đường , amino acid . Vì vậy , cần phải luôn luôn chú ý đến sự thông khí , độ ẩm của hạt và nhiệt độ . - 19 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Hạt đại mạch khô hầu như không có hoạt lực của α-Amylase. Khi hạt chuẩn bị nảy mầm thì xuất hiện hoạt lực của α-Amylase và hoạt lực này tăng dần. Đến ngày thứ 7 và thứ 8 của quá trình nảy mầm ( nhiệt độ18 – 200C), hoạt lực này đạt đến mức độ tối đa, sau đó giảm xuống. Vào lúc hoạt lực của Enzyme đạt đến mức tối đa thì phải ngừng quá trình nảy mầm bằng cách sấy hạt đang nảy mầm ở nhiệt độ thích hợp . Các bước quy trình sản xuất malt khô b) Malt thóc: Đại mạch là loại ngũ cốc trồng ở vùng ôn đới có khí hậu lạnh. Ở những vùng nhiệt đới người ta nghiên cứu việc sử dụng malt thóc, bắp để thay thế một phần hay toàn bộ malt đại mạch. * Các bước trong quy trình sản xuất malt thóc Hạt lúa ------- > làm sạch, phân loại -------- > sấy bảo quản --------- > ngâm hạt ---- > ủ mầm ------- > malt tươi ---------> sấy malt --------- > tách mầm rễ ------ > malt khô Trong qúa trình nảy mầm của hạt, các Enzyme như Amylase, protease,… hoạt động mạnh xúc tác cho các biến đổi sinh lý, sinh hoá trong hạt như thuỷ phân các chất cao phân tử như tinh bột và cellulose, protein thành những chất đơn giản hơn. Quá trình nảy mầm xảy ra khi hạt có đầy đủ các điều kiện thích hợp về độ ẩm, nhiệt độ. Ngâm Hạt : trong hạt lúa có sẵn một lượng nước ở dạng liên kết. Nước từ bên ngoài khi thấm vào hạt sẽ hoà tan các chất dự trữ, hoạt hóa các Enzyme xúc tác quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử trong hạt thành những chất đơn giản cung cấp cho hoạt động tăng - 20 – Sấy khô Thu nhận, xử lý, làm sạch, phân loại Mầm rễ khô Tách mầm rễ Sấy khôNảy mầmNgâm Không khí Malt khô sản xuất bia Malt khô bảo quản Bảo quản Đại mạch Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 trưởng của phôi để hình thành cây mầm. Phôi là nơi hút nước mạnh nhất. Tốc độ hút nước rất mạnh ở thời gian đầu do có sự chênh lệch áp suất thẩm thấu rất lớn giữa môi trường bên ngoài và các tế bào bên trong hạt, đồng thời các chất keo háo nước trương nở rất mạnh, càng về sau, sức hút nước của hạt càng giảm . Ủ hạt : việc ủ hạt trải qua 3 giai đoạn + Giai đoạn 1 : kéo dài 3 ngày. Ở ngày thứ ba bắt đầu nảy mầm, nhiệt độ của khối hạt tăng nhanh do hoạt động hô hấp mạnh. Khối hạt cần được đảo 2 - 3 lần/ngày . + Giai đoạn 2 : kéo dài 3 ngày . Lúc này chồi mầm và rễ mầm tăng trưởng nhanh , nhiệt độ khối hạt cũng tăng nhanh do hoạt động hô hấp cao. Khối hạt cần được đảo 2 - 3 lần/ngày . + Giai đoạn 3 : những ngày sau quá trình nảy mầm xảy ra chậm dầm, nhiệt độ tăng yếu và khối hạt cũng cần được đảo 2 - 3 lần/ngày. * Các quá trình xảy ra trong quá trình nảy mầm của Hạt Khi nước ở bên ngoài thấm vào hạt, các hợp chất cao phân tử bên trong hạt thấm nước và trương lên, các Enzyme thuỷ phân hoạt động, phân cắt các chất này thành những chất đơn giản hơn ở trạng thái hoà tan. Các chất này một phần được chuyển đến để nuôi phôi, một phần bị tiêu hao do hoạt động hô hấp và phần lớn được sử dụng để chuyển hoá thành những chất cao phân tử mới ở các mô của cây nảy mầm. Hoạt động hô hấp trong hạt cần được cung cấp oxy đồng thời thải ra khí CO2 và toả nhiệt làm cho nhiệt độ của khối tăng lên, do đó cần phải chú ý tới đảo trộn khối hạt. Hoạt động của Enzyme : trong khối hạt, Enzyme ở dạng liên kết và chúng được chuyển sang trạng thái hoạt động khi hạt nảy mầm. Ngoài ra còn có một số Enzyme được tổng hợp mới. Các Enzyme hoạt động trong quá trình nảy mầm của hạt lúa . - α-Amylase : Enzyme này không hoàn toàn hoạt động ở hạt chín. Hoạt tính của Enzyme α-Amylase tăng dần trong quá trình nảy mầm của hạt. Ở nhiệt độ 15 - 170C, hoạt tính của α-Amylase đạt đến cực đại vào ngày thứ 10 – 12 của quá trình nảy mầm; Ở nhiệt độ 28 – 300C, hoạt tính của α-Amylase đạt cực đại vào ngày 5 – 8 . - β-Amylase : Enzyme β-Amylase tồn tại ở dạng liên kết và một số ít hoạt động rất yếu trong hạt chín hoàn toàn. Hoạt động này tăng nên trong quá trình hạt nảy mầm. Thời gian để hoạt động của Enzyme này đạt đến cực đại cũng tuỳ thuộc vào nhiệt độ . - Enzyme Oxy Hoá Khử : Trong quá trình nảy mầm , hoạt động của các ezyme này tăng nên mạnh do đó hoạt động hô hấp của hạt cũng gia tăng. Hoạt động hô hấp của hạt mạnh nhất vào ngày thứ 4–6 ở nhiệt độ 27 - 280C và cường độ hô hấp phụ thuộc vào độ ẩm của hạt, nhiệt độ vào lượng O2 cung cấp. - 21 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 * Phương pháp tinh sạch Amylase: Có hai phương pháp - Tinh sạch Enzyme Amylase bằng phương pháp sắc ký - Thu nhận Enzyme Amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (polyacrylamide Gel Electrophoresis – PAGE) 3. Thu nhận Enzyme từ vi sinh vật: Nguồn thu nhận chủ yếu là : nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn… Khi nuôi VSV tạo Amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ Enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Ở một số VSV, quá trình tổng hợp Amylase tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ Enzyme phụ thuộc vào tuyến tính của sự tăng khối. * Yêu cầu chung Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập, và chọn giống VSV để tuyển lấy những chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hoá các điều kiện nuôi. Như vậy sự tổng hợp Enzyme Amylase không những phụ thuộc vào tính chất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu. Ngoài các yếu tố hoá học (thành phần môi trường) ra, thì các điều kiện lý hoá của quá trình nuôi cấy cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp Enzyme Amylase. Trong các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các Enzyme Amylase trong quá trình nuôi VSV, thì thành phần môi trường , tính chất cơ lý của môi trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… Là những yếu tố cơ bản tối quan trọng * Nuôi VSV tạo Amylase bằng phương pháp bề mặt: • Yêu cầu đối với môi trường thành phần dinh dưỡng. Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi VSV tạo Amylase cũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi VSV tạo Enzyme khác là tính hoàn thiện. Hầu hết các VSV tạo Amylase đều hấp thụ carbon chủ yếu ở các dạng hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin…), hyđro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử. Cấu tử chính của môi trường VSV tạo Amylase bằng phương pháp lên men bề mặt là cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi VSV không cần bổ sung thêm các chất khác nữa. Cám mì có 16–22% - 22 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 tinh bột, 10 – 12% protein, trong đó các amino acid quan trọng như methionine (0,19%), cystine (0,3%), arginine (1%), lysine (6%), tryptophan (0,3%), 3 – 4% chất béo, 10,3% celulose, các nguyên tố trơ (Na – 0.09% , K – 1% , Ca – 0.16% , P - 0.94% ) và các nguyên tố vi lượng cùng các chất khác. Cám gạo có khoảng 20% tinh bột 10 –15% chất béo, 10 – 14% protein, 8–16% celulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37 –5 9 %) Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của enzyme. Cám không được chứa tinh bột dưới 20 – 30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay vị đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%... Tuy là phế liệu của công nghiệp xay xát, nhưng cám cũng tương đối đắt tiền, hơn nữa trong quá trình nuôi VSV, các chất dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay cám bằng một số cấu tử rẻ tiền hơn. Cấu tử này thường là mầm mạch (15 – 20 %), trấu (2 – 5%), mùn cưa (5 - 10%)… Có thể dùng cặn bã canh trường rắn (sau khi cách ly Enzyme) là cấu tử chính của môi trường (Silova, Fenikxov) 1967, đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải tiệt trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai. Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1 - 5atm trong vòng 4 -6 giờ, có thể thanh trùng bằng hơi nóng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin (40%) và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lượng môi trường. • Độ ẩm tối thích cuả môi trường : Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích (đối với Asp.niger , Asp.awamort, Asp.flavus , Asp.arysee) của môi trường là 58 – 60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm mà tăng quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 – 55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như sự tạo Enzyme Amylase. Trong điều kiện tiệt trùng tốt (môi trường trong bình tam giác, trong tủ ấm phòng thí nghiệm hoạt lực Amylase cao nhất thu ở độ ẩm 65 –68%). Cần nhớ rằng khi nuôi trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối (trên các khay), thì độ ẩm môi trường không được vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dễ bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được độ ẩm cao (việc phòng ngừa và hạn chế sự hư hỏng của canh trường) trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm sợi lại còn có ý nghĩa to lớn hơn đối với sự tạo thành Enzyme. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến sinh tổng hợp Enzyme Amylase như sau : - 23 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Ảnh hưởng của việc giữ độ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-Amylase của Asp.ozysee nuôi bằng phương pháp bề mặt . Phương án thí nghiệm 20 giờ 34 giờ 42 giờ Độ ẩm % Hoạt độ của Amylase đv/g canh trường khô Độ ẩm % Hoạt độ của Amylase đv/g canh trường khô Độ ẩm % Hoạt độ của Amylase đv/g canh trường khô Khay để hở 27,8 15.0 23.8 18.0 22.0 20.5 Khay đậy nắp 46,4 20.4 42.4 32.9 42.4 36.7 Qua bảng số liệu trên thấy rõ là hoạt lực α-Amylase của canh trường nuôi nấm sợi , khi bị hong khô giảm gần hai lần. Điều đó khẳng định sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích. Cần thông khí liên tục trong suốt thời kì sinh trưởng của VSV. Trong quá trình sinh trưởng của mình VSV tiêu thụ 25 – 35% chất dinh dưỡng của môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2 . Vì vậy cần phải thải nhiệt này bằng thông gió với không khí vô trùng có độ ẩm tương đối khoảng 100%. Chế độ thông khí có thể liên tục , gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên) tuỳ thuộc vào chiều dày của lớp môi trường nuôi , vào khoảng cách giữa các tầng khay và đĩa khay. Thường là giai đoạn sinh trưởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4 - 5 lần thể tích không khí trên một thể tích phòng trong 1 giờ , còn ở giai đoạn thứ 2 là 30 – 60 thể tích không khí trên thể tích phòng nuôi/1 giờ, còn ở giai đoạn thứ 3 giảm đi chỉ còn 10 – 12 thể tích không khí . • Nhiệt độ nuôi : Toàn bộ chu kì sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm 3 thời kỳ : + Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10 – 11 giờ đầu tiên, đối với vi khuẩn 3 – 4 giờ). Trong thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23 – 300C đối với nấm mốc và duy trì nhiệt độ 32– 380C cho vi khuẩn. Độ ẩm tương đối của không khí là 96 - 100% . + Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vòng 4- 18giờ). Ở giai đoạn này nấm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý rất lớn. Kết quả là trong lớp sợi nấm đang mọc nhiệt độ tăng lên đến 37 - 400C , đôi khi cao hơn tới 470C. Vì vậy cần phải hạ nhiệt độ phòng nuôi giúp cho sợi nấm mọc đều và đẹp. Ở nhà máy người ta thổi không khí vô trùng có nhiệt độ 28 – 290C và độ ẩm cao vào phòng nuôi. + Thời kỳ tạo Enzyme Amylase mạnh mẽ (kéo dài từ 10 - 20 giờ). Trong thời kỳ này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự toả nhiệt giảm mạnh. Các Enzyme Amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Theo Rodxevits (Pozerur, 1967) trong một ngày đầu ở giai đoạn - 24 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 sinh trưởng thứ nhất, thứ hai, nấm mốc Asp.ozysee chỉ được tạo được 7,5 – 8% Enzyme , trong vòng 12h sau, hoạt lực của oligo–1,6– glucosidase tăng lên gấp 10 lần. Đối với đa số VSV ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ xuống 3 – 40C so với giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 28 - 300C , cho Bac.subtilis là 35– 370C. Thời gian nuôi để có lượng Amylase cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Tuỳ thuộc vào tính chất của chủng VSV và sự ngừng tổng hợp Enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực của Enzyme. Đối với đa số nấm mốc Aspergillus, sự tạo Enzyme Amylase cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử. Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt thì thời gian nuôi để có thể tích luỹ Amylase cực đại đối với từng loại nấm sợi và vi khuẩn như sau : Chủng Thời gian nuôi ( giờ ) - Asp.orysee – 476 24 -25 - Asp.oryae – KC 30 – 36 - Asp.oryae 8F1 24 – 30 - Asp.awamori 22 36 - Bac.subtilis 68 – 72 ( ở 300C ) * Nuôi VSV tạo Amylase bằng phương pháp bề sâu: • Môi trường dinh dưỡng : Đặc điểm chung cho mọi môi trường nuôi VSV tạo Enzyme Amylase là có chất cảm ứng: tinh bột, dextrin hay maltose. Nguồn nitơ dinh dưỡng thường dùng là nitơ vô cơ (NaNO3). Sinh tổng hợp α-Amylase hoạt động của chủng Aspergillus thường chỉ thấy trong các môi trường có các muối của acid sulfuric. Đối với sinh trưởng của một số nấm sợi tạo maltase và oligo–1,6–glucoamylase hoạt động lại rất cần có sự có mặt của Mg trong môi trường. Để tạo điều kiện cho VSV phát triển tốt và sinh nhiều Amylase người ta cho thêm vào môi trường các loại nước chiết như nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước chiết đậu nành,… đó là nguồn bổ sung amino acid, vitamin và các tạp chất sinh trưởng. Dưới đây là một số môi trường lỏng dùng để VSV tạo các Enzyme Amylase. Đối với Aspergillus, người ta thường nuôi bằng môi trường Sapeck cải tiến gồm : 6% tinh bột ; 0,9% NaNO3 ; 0,001% FeSO4 ; 0,1% KH2PO4 ; 0,05%MgSO4; 0,05% KCl và nước máy. Để tăng cường khả năng sinh trưởng của VSV và khả năng tạo Enzyme có thể thêm nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước cám nấu, nước chiết bột đậu nành . - 25 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 • Nhiệt độ nuôi : Nhiệt độ nuôi là một trong những yếu tố quan trọng với sinh trưởng của VSV và sự tạo thành các Enzyme Amylase. Không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ dẫn tới giảm hoạt lực các Amylase. Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm sợi thuộc giống Aspergillus là 30 – 320C (trong đó có Asp.orysee 3–9–15 và Asp.awamori 22), Bacillus. Môi trường thích hợp nhất và tạo nhiều Amylase ở nhiệt độ 370C. Một số vi khuẩn khác thì lại có nhiệt độ tối thích cao hơn. Bac.circulans phát triển mạnh ở nhiệt độ 65 – 700C song lại tạo nhiều Amylase ở nhiệt độ 500C vì vậy người ta thường cấy giống ở 700C sau đó tiến hành cho tích luỹ ở nhiệt độ 500C nuôi chủng này bằng môi trường nước lỏng gồm nước nấu khoai tây, pepton và phấn. Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn tới độ bền của Enzyme tạo thành Amylase của Bac.coagulans và Bac.searothermophilus được nuôi ở 350C và 550C có độ bền nhiệt khác xa nhau. Khi giữ nhiệt ở 900C trong 1 giờ thì Amylase của chủng sinh trưởng ở nhiệt độ 350C bị mất 90 – 94% hoạt độ ban đầu ; trong lúc đó Amylase của chủng được nuôi ở nhiệt độ 550C chỉ bị vô hoạt có 10 - 12%. Các VSV ưa nhiệt thì sinh tổng hợp nên các Amylase bền nhiệt. Enzyme với độ bền nhiệt cao có ưu thế lớn trong nhiều lĩnh vực sản xuất. Ngoài ra nuôi vi khuẩn ưa nhiệt lại rất tiện lợi cho việc sản xuất công nghiệp, vì nuôi ở nhiệt độ cao tạo ra điều kiện chọn lọc và cho phép giảm bớt yêu cầu khắt khe về độ tuyệt trùng, đồng thời khi nuôi đỡ bị nhiễm tạp khuẩn. • Sục khí và khuấy trộn Phần lớn vi sinh vật tạo Amylase là những VSV hiếu khí. Vì vậy sinh trưởng cuả chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hoà tan trong dịch nuôi cấy. Trong quá trình sinh trưởng của mình, VSV sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy hoà tan trong môi trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung. Chính vì lẽ đó, việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới quá trình sinh trưởng và tích luỹ sinh khối cũng như sinh tổng hợp các Enzyme của VSV : Việc khuấy đảo bằng các cách như sau : + Sục không khí vô trùng vào thiết bị nuôi + Bằng máy móc chuyên dùng + Bằng tác dụng hiệp đồng của cả sục khí lẫn máy khuấy + Bằng tác dụng của các khí sinh ra khi lên men * Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10 – 12m3 không khí vô trùng ( có nhiệt độ không quá 400C ) trên 1m3 môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi trong khoảng 68 – 72giờ. Với thời gian nuôi ngắn hơn ở các thùng lên men nhân giống ( 48giờ ) và trong các thùng lên men sản xuất (48 – 52giờ) thì lượng không khí cần sục vào môi trường để nuôi - 26 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Asp.orysee (3-9-15) phải là 30m3/m3 môi trường /giờ đối với thùng nhân giống và 40m3/m3 môi trường/giờ cho thùng sản xuất. Mức độ sục khí tối ưu để nuôi Asp.orysee (3-9-15) tương ứng với 180 micromol O2/lít môi trường (nồng độ oxy hoà tan đo bằng máy cực phổ với điện cực kiểu clark). Chủng này có vận tốc tiêu thụ oxy hoà tan cực lớn vào cuối pha sinh trưởng logarithm. Vận tốc tiêu thụ O2 giảm dần từ lúc bắt đầu pha ổn định. Nuôi VSV ưa nhiệt đòi hỏi nhiều không khí hơn là nuôi VSV ưa ẩm. Nhiệt độ và pH của một số Enzyme Amylase do VSV tổng hợp Vi sinh vật Enzyme pHoppt Toopt Aspa.wamori α-Amylase 4,5 – 6,2 40 β-Amlylase 3,5 – 7,0 50 Glucoamylase 4,5 – 4,7 55-75 Asp.niger α-Amylase 4,7 – 6,0 65Glucoamylase 3,8 50 Asp.asami α-Amylase 3,8 50Glucoamylase 5,0 55 Asp.orysee α-Amylase 5,5 – 5,9 50 – 57 β-Amlylase 4,8 30 Glucoamylase 4,8 50 Bac.amyloliquefaciens α-Amylase 5,7 – 6,0 55 – 60 Bac.diastaticus α-Amylase 5,8 70 Bac.subtilis α-Amylase 4,6 – 5,1 37 Endomyces sp Glucoamylase 4,8 55 Phizopase doleamar Glucoamylase 5,5 45 V. Phương pháp xác định hoạt độ: 1. Đơn vị đo hoạt độ: Mức độ hoạt động trong chế phẩm là thông tin quan trọng về lượng Enzyme trong đối tượng nghiên cứu, vì trong những điều kiện xác định, tốc độ phản ứng Enzyme tỉ lệ với lượng Enzyme trong hỗn hợp phản ứng. Lượng Enzyme theo quy ước quốc tế được biểu diễn bằng đơn vị Enzyme. Đơn vị Enzyme quốc tế ( UI ) là lượng Enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa được 1 micromol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Trong những điều kiện xác định ( bão hòa cơ chất ), tốc độ phản ứng do Enzyme xúc tác tỷ lệ với lượng Enzyme trong hỗn hợp phản ứng - 27 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Hoạt độ riêng của 1 chế phẩm Enzyme đặc trưng cho độ thuần khiết của chế phẩm Enzyme. Hoạt độ phân tử của Enzyme là số phân tử cơ chất ( hoặc số đương lượng các liên kết bị phân giải ) được chuyển hóa bởi 1 phân tử Enzyme sau 1 phút. Hoạt độ của trung tâm xúc tác Enzyme là số cơ chất ( hoặc số đương lượng các liên kết bị phân giải ) được chuyển hóa trên 1 trung tâm hoạt động sau 1 phút. Hoạt độ xúc tác của Enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất bị chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm phản ứng tạo thành trên 1 đơn vị thời gian càng lớn. Bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa của cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng ta có thể đánh giá hoạt độ xúc tác của Enzyme. Có 3 nhóm phương pháp: - Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong 1 thời gian nhất định ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định. - Đo thời gian cần thiết để thu được 1 lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm ứng với 1 nồng độ Enzyme nhất định. - Chọn nồng độ Enzyme như thế nào để trong 1 thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm. * Phương pháp xác định hoạt độ Enzyme có rất nhiều. Ở mỗi nước và mỗi phòng thí nghiệm có thể dùng phương pháp này hay phương pháp khác là tùy thuộc điều kiện và thói quen. Nhưng khi so sánh chất lượng giữa các chế phẩm với nhau thì phải theo phương pháp thống nhất. 2. Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi Enzyme có trong dịch chế phẩm nghiên cứu với các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iodine bằng máy so màu quang điện sẽ tính được hoạt độ Enzyme Đơn vị hoạt độ Amylase là lượng Enzyme chuyển hóa được 1 g tinh bột tan thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 300C trong thời gian 1 giờ ( pH cho Amylase của malt là 4,8 – 4,9; của nấm là 4,7; của vi khuẩn là 6,0 …) 3. Xác định hoạt độ Enzyme glucoamylase ( γ-Amylase) a/ Phươn