Đề tài Khảo sát thành phần hoá học của lá xa kê artocarpus altilis (park.) fosberg thuộc họ dâu tằm moraceae

đã tách được 3 chất của rễ và thân cây Xa kê là Cyclomorusin (16), --19-- Cyclomulberrin (12), Engeletin (17) từ cao MeOH và 3 chất mới là Isocyclomorusin (18), Isocyclomulberrin (19) và Cycloaltilisin (20) từ cao CHCl3. O O O O OH (16) OH O OOH HO OH O OH HO OH OH O O O OOH OH (18) O O HO OH O OH (19) O O HO OH O OH OCH3 (20) (17) Năm 2000, K. Shimizu, Ryuichiro Kondo, Kokki Sakai, Supanida Buabarn, Uraiwan Dilokkunanant [23] cùng cô lập được 3′-geranyl-2′,3,4,4′- tetrahydroxychalcone (21) trong cao acetone của lá xa kê. --20-- O H O HO OH OH (21) Năm 2002, Ashok D. Patil, Alan J. Freyer, Lew Killmer, Priscilla Offen, Paul B. Taylor, Bartholomew J. Votta, và Randall K. Johnson [11] đã tách được Dihydrochalcone AC 5-1 (1) và 2 chất mới là Cycloaltilisin 6 (22) và Cycloaltilisin 7 (23) trong cao MeOH/CH2Cl2 của chồi hoa Xa kê. HO OH O OH OH OH OH O HO OH (22) OO OOH OH (23) --21-- Năm 2006, Jing-Ru Weng, Sheng-Ching Chan, Yi-Huang Lu, Hsien-Cheng Lin, Horng-Huey Ko, Chun-Nan Lin [20] cùng tìm tách được Dihydroartomunoxanthone (24), Artomunoisoxanthone (25), Cyclocomunomethonol (26), Artomunoflavanone (27), Artochamins B (28), Cyclocommunol CC (29) có trong vỏ rễ Xa kê. O OH HO O OH OCH3HO (24) O OOH O HO OHHO H (25) O O O HO OH O OH OCH3 OH HO O OCH3 OCH3HO (26) (27) O O OO O OH HO O OH OH OH O OH OH (29)(28) Năm 2007, Yanbin Lu, Cuirong Sun, Yu Wang, Yuanjiang Pan [43] dùng phương pháp HPLC đánh giá hàm lượng các chất trong cao tổng của cây Xa kê và thấy hàm --22-- lượng 3 chất Dihydrochalcone AC-5-1 (1), Lespeol (30), Isolespeol (31) chứa nhiều trong cao EtOH. O OH O OH (30) O OH O OH (31) Cùng năm 2007, N.R. Amarasinghe và U.L.B. Jayasinghe [29] cô lập được (E)- 2,4,3′,5′-stilbenetetrol (32), 4′-[3-methyl-1(E)-butenyl]-(E)-2,4,3′,5′-stilbenetetrol (33), (3-methyl-2-butenyl)-(E)-2,4,3′,5′-stilbenetetrol (34), 3′,5′,6-trihydroxy-2- phenylbenzofuran (35), 2′,4′,5,7–tetrahydroxylflavanone (36), 2′,4′,5,7-tetrahydroxyl flavones (37), 2′,4′,5,7-tetrahydroxy-6-[3-methyl-1(E)-butenyl]flavones còn gọi là isoartocarpesin (38), 2′,4′,5,7-tetrahydroxy-6(3-methyl-2-butenyl) flavones (39), 3β- acetoxyolean-12-en-11-one (40), cycloartenylacetate (11), β-sitosterol (41), stigmasterol β-D-glucopyranoside (42) trong cao buthanol chiết từ quả Xa kê. HO OH HO OH (32) HO OH HO OH (33) --23-- OH HO OHHO (34) HO OH O OH (35) O OHO OH O OHHO OH HO O OHHO (37)(36) H3C HO CH3 H H CH3 H CH2CH3 H O CH3 H CH3 H O O O O HO OH OOH HO OH HO O OHHO (38) (39) (40) (41) H3C O CH3 H H CH3 H CH2CH3 H OHO HO OH OH (42) --24-- Cùng năm 2007, Lotulung PDN., S.Fajriah, M.Hanafi, E.Filaila [25] cô lập được một tinh thể vàng 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[8-hydroxy-2-methyl-2-(4-methyl-3- pentenyl)-2H-1-benzopyran-5-yl] 1-propanone hay còn gọi là AC-GF (43) có trong cao CH2Cl2 của lá Xa kê. O O OH HO OH (43) Tiếp đó, Yu Wanga, Kedi Xua, Lin Lin, Yuanjiang Pan, Xiaoxiang Zheng [44] cùng tìm ra 5 chất mới là 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-{4-hydroxy-6,6,9-trimethyl- 6a,7,8,10a-tetrahydro-6H-dibenzo[b,d]pyran-5-yl}-1-propanone (44), 1-(2,4- dihydroxyphenyl)-3-[3,4-dihydro-3,8-dihydroxy-2-methyl-2-(4-methyl-3-pentenyl)- 2H-1-benzopyran-5-yl]-1-propanone (45), 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[8-hydroxy-2- methyl-2-(3,4-epoxy-4-methyl-1-pentenyl)-2H-1-benzopyran-5-yl]-1-propanone (46), 1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-[8-hydroxy-2-methyl-2-(4-hydroxy-4-methyl-2-pentenyl)- 2H-1-benzopyran-5-yl]-1-propanone (47), 2-[6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2(E),7- dienyl]-3,4,2’,4’-tetrahydroxydihydrochalcone (48) và 4 chất cũ là AC-GF (43), Dihidrochalcone AC-5-1 (1), Cycloaltilisin 6 (22) và (E)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3- (8-hydroxy-2-(4-hydroxy-4-methylpent-2-en-1-yl)-2-methyl-2H-chromen-5-yl) propan-1-one (49). O O OH OHHO O O OH OH HO OH (44) (45) --25-- O O OOH HO OH O O OH OH HO OH O HO OH OH OH HO OH O O HO OH OH (46) (47) (49) (48) Năm 2008, Song-Chwan Fang, Chin-Lin Hsu, Yu-Shen Yu, Gow-Chin Yen [37] cùng tìm ra Isolespeol (31), 5′-geranyl-2′,4,4′-trihydroxychalcone (50), 3′-geranyl- 2′,3,4,4′-tetrahydroxydihydrochalcone (21), Lespeol (30) và Xanthoangelol (51) trong lá cây Xa kê. (51) HO OH O OH (50) HO OH O OH --26-- Năm 2009, Kai-Wei Lin, Chiung-Hui Liu, Huang-Yao Tu, Horng-Huey Ko, Bai- Luh Wei [21] cùng tìm ra Cyclogera-Communin (52), Artoflavone A (53), Artomunoisoxanthone (25), Artocommunol CC (29), Artochamin D (54), Artochamin B (28) và Dihydroartomunoxanthone (24) trong vỏ rễ Xa kê. O O OH OOH HO (52) OO O HO OCH3 OH OH (53) O OCH3 OH HO OOH HO (54) Gần đây, vào năm 2011, Victor Kuete, Patrick Y Ango, Ghislain W Fotso, Gilbert DWF Kapche, Jean P Dzoyem, Arlette G Wouking, Bonaventure T Ngadjui, Berhanu M Abegaz [39] đã nghiên cứu khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên cao MeOH của vỏ cây Xa kê của vùng Cameroon và cô lập được 5 chất peruvianursenyl acetate C (55), α-amyrenol còn gọi là viminalol (56), sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside (42), artonin E (57) và 2-[(3,5-dihydroxy)-(Z)-4-(3-methylbut-1-enyl)phenyl]benzofuran-6- ol (58). --27-- H H O H O (55) H H HO H (56) OO OHO OH OH OH O HO OH OH (57) (58) Theo đó, Lin JA, Fang SC, Wu CH, Huang SM, Yen GC [24] nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm làm giảm bạch cầu đơn nhân S100B trên quả Xa kê và cô lập được chất 5,7,4′-trihydroxy-6-geranylflavanone (59). O O OH HO OH (59) --28-- 1.3.2. Hoạt tính sinh học Nước ngoài Theo tài liệu [38] thì cây Xa kê có rất nhiều chất có hoạt tính sinh học thú vị như: - Trị bệnh sốt rét [12]: Một báo cáo của Boomphong và cộng sự chỉ ra rằng khả năng trị sốt rét của rễ cây Xa kê từ 9 prenylated flavones: Cycloartocarpin, Artocarpin và Chaplashin được cô lập từ cao CH2Cl2 của thân và rễ, morusin, Cudraflavone B, Cycloartobiloxanthone, Artonin E và Artbiloxanthone trong vỏ rễ Xa kê có khả năng kháng trùng sốt rét ở IC50 từ 1.9-4.3 µg/ml. - Chống lao [12]: Là khả năng chống vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis H37Ra trong bài báo Microplate Alamar Blue (MABA) của Collin và Franzblau cho biết tất cả 9 prenylated flavones: cycloartocarpin, artocarpin, và chaplashin phân lập từ cao CH2Cl2 của thân và rễ cây Xa kê, cũng như morusin, cudraflavone B, artonin E, artobiloxanthone, IC50 tương ứng là 9,9; 6,9; 7,7; 4,5; 5,2; 6,4; 6,9 mM và cudraflavone C, cycloartobiloxanthone cô lập từ rễ cây Xa kê có khả năng kháng lao với nồng độ ức chế tối thiểu MIC từ 3.12-100 µg/ml. - Kháng tế bào gây độc [37]: 9 hợp chất thuộc họ prenylated flavones được phân lập được từ rễ cây Xa kê là cycloartocarpin, artocarpin, chaplashin, morusin, cudraflavone B, cycloartobiloxanthone, artonin E, cudraflavone C, artobiloxanthone có khả năng phát hiện ra tế bào độc hại chống lại tế bào KB, BC và Vero ở IC50 khoảng 2.9-14.7 µg/ml. Lotulung PD, Fajriah S, Hanafi M, Filaila E [25] đã nghiên cứu hoạt tính kháng tế bào gây độc trên lá cây Xa kê trồng ở Indonesia và thấy chất (43) có khả năng gây độc cao trên tế bào bạch cầu của chuột P-388. - Kháng tế bào ung thư [37]: 3 dẫn xuất geranyl của chalcone là chất Isolespeol (31), 5′-geranyl-2′,4,4′-trihydroxychalcone (50), 3,2′,4,4′-tetrahydroxy-3′- geranyldihydrochalcone (21), Lespeol (30) và Xanthoangelol được phân lập từ lá Xa kê nghiên cứu bằng in vitro có khả năng kháng ung thư. Các chất này có khả năng phát hiện tế bào ung thư gồm tế bào liposarcoma (SW 872) trong mô mỡ, colorectal carcinoma (HT-29, COLO 205), hepatocellullar carcinoma (PLC5, Huh7) và tế bào hepatoblastoma (HepG2, Hep3B) một loại ung thư gan ác tính. Trong đó thì Isolespeol hoạt động ức chế cao nhất với IC50 = 3.8 µM trong SW 872 tế bào mô mỡ. Isolespeol --29-- phản ứng với SW 872 làm mất khả năng của màng ty thể (DeltaPsim). Western còn chỉ ra rằng isolespeol kích thích sự gia tăng protein. Tỉ lệ giữa protein và chất thuộc họ kháng tế bào chết Bcl-2 được thay đổi do Isolespeol làm hoạt hoá caspase-9 và caspase-3, những chất bị cắt bởi poly (ADP-ribose) (PARP). Kết quả là Isolespeol đem lại tế bào chết trong mô SW 872. - Huỷ tiểu cầu [43]: những flavones dihydroartomunoxanthone, artomunoisoxanthone, cyclocomunomethonol, artochamins B và artocommunol CC ,được phân lập từ vỏ rễ cây xa kê có tác dụng ức chế mạnh sự kết hợp các tiểu huyết cầu trong huyết thanh PRP của người 300 µM so với aspirin. Ngoài ra dihydroartomunoxanthone (24), artochamins B (28) và artocommunol CC (29) ức chế quan trọng do kết hợp adrenaline và hiệu quả của việc huỷ tiểu cầu làm ức chế hoạt động của men cyclooxygenese-1 (COX-1) làm giảm sự hình thành thromboxane. Sự kết hợp tiểu cầu là nhân tố sinh bệnh quan trọng trong sự phát triển chứng xơ vữa động mạch cùng với chứng huyết khối ở người. Vì vậy, dihydroartomunoxanthone, artochamins B và artocommunol CC có khả năng là tác nhân chống huyết khối. - Kháng đái tháo đường [10]: Người ta nghiên cứu cao nước của vỏ rễ rất nhạy khi nồng độ glucose trong máu tăng quá mức ở chuột Wistar và dẫn đến phá huỷ sự trao đổi sinh hoá của tuyến tuỵ và gan ở chuột. - Kháng viêm [40]: Những hợp chất flavonoids cycloartomunin, cyclomorusin, dihydrocycloartomunin, dihydroisocycloartomunin, cudraflavone A, cyclocommunin, artomunoxanthone, cycloheterohyllin, artonin A, artonin B, artocarpanone, artocarpanone A, and heteroflavanones A, B, C có khả năng ức chế chất trung gian được đào thải từ tế bào lớn, bạch cầu trung tính, đại thực bào. Chất dihydroisocycloartomunin ức chế sự đào thải β-glucuronidase và histamine từ tế bào màng bụng của chuột hoạt động bởi P-methoxy-N-methylphenethylamine. Artocarpanone ức chế sự đào thải lysozyme từ bạch cầu trung tính của chuột nhờ formyl-Met-Leu-Phe (fMLP). Artonin B và Artocarpanone ức chế anion superoxide tạo thành fMLP trong khi cyclomorusin, dihydrocycloartomunin, cudraflavone A, và cyclocommunin kích thích sự phát sinh anion superoxide. Hợp chất artocarpanone còn ức chế các sản phẩm NO và iNOS (inducible nitric oxide synthase). --30-- Đặc biệt Lin JA, Fang SC, Wu CH, Huang SM, Yen GC [24] thử hoạt tính trên chất 5,7,4′-trihydroxy-6-geranylflavanone (59) cô lập được từ quả Xa kê với hoạt tính kháng viêm và kháng oxi hoá cao nồng độ ≤ 2.5 μM. Một nghiên cứu sử dụng phương pháp tảo carrageenan gây bệnh phù chân chuột [34] thử nghiệm trên thuốc sắc cao nước lá Xa kê so với nước muối bình thường cũng khảo sát tính kháng viêm. Kết quả cho thấy nước sắc từ lá Xa kê có hoạt tính kháng viêm mạnh 60 mg/kg thể trọng trong 0.5-4 giờ. - Ức chế hoạt động men tyrosinase [17]: Cao diethyl ether hay cao methanol từ ruột gỗ cây xa kê ở tỉnh Phitsanulok, Thái Lan chứa nhiều artocarpin có khả năng ức chế tyrosinase, ức chế quá trình tổng hợp melanin và khả năng kháng oxi hoá. Bên cạnh đó, Shimizu, K. Fukuda, M. Kondo, R. Sakai, K. [33] cũng nghiên cứu hoạt tính ức chế men tyrosinase của 23 loại gỗ ở Papua New Guinea trong đó có cây Xa kê và kết quả cho biết chất isoartocarpesin có trong cao MeOH của ruột gỗ cây Xa kê hoạt động ức chế mạnh nhất tương đương với acid kojic. Cao MeOH ức chế sinh tổng hợp melanin của tất cả các tế bào khối u ác tính B16 mà không gây bất kỳ độc tính nào thử trên lưng của con lợn nâu. Do đó, cao ruột gỗ cây Xa kê là nguyên liệu cho tác nhân làm trắng da và khắc phục chứng rối loạn sắc tố. - Ức chế hoạt động 5-lipoxygenase [22]: Được cô lập từ cây Xa kê ở Indonesia, chất AC-5-1 (1) có khả năng ức chế mạnh 5-lipoxygenase của u tế bào bón được thử nghiệm trên chuột. Bệnh phù tai chuột do acid Arachidonic trong một mẫu thử hoạt tính kháng viêm là do leukotriene gây ra. Chất AC-5-1 ở nồng độ 10-5M ức chế 96% C4 leukotriene tổng hợp tế bào phúc mạc chuột nhờ Canxi-ionophore. Đó còn là một phát hiện thú vị về leukotriene đối với hoạt tính kháng viêm và các hoạt tính sinh học khác. - Ức chế Cathepsin K [11]: Dihydrochalcon AC-5-1, Cycloaltilisin 6, Cycloaltilisin 7, AC-3-1, AC-3-3, trong đó Cycloaltilisin 6 ức chế mạnh nhất với IC50 = 98nM, còn Cycloaltilisin 7 với IC50 = 840nM. - Ức chế hoạt động của 5-α reductase [23]: Artocarpin được cô lập từ cao diethyl ether của ruột gỗ cây xa kê có khả năng ức chế 5-α reductase ức chế sự chuyển hoá testosterone thành 5-α-dihydro-Testosterone (IC50 = 37µM). Cùng lúc đó, Shimizu, K. Fukuda, M. Kondo, R. Sakai, K. [33] đã thử hoạt tính trên 9 chất cô lập được từ dịch chiết cao MeOH của ruột gỗ cây Xa kê và kết quả cho thấy Chlorophorin (IC50 = --31-- 37µM), Artocarpin (IC50 = 85 µM) ức chế mạnh hơn hẳn so với acid α-linoleic, chất ức chế mạnh trong tự nhiên. Trong đó chất prenylated stilbene được cô lập từ cao acetone của lá Xa kê [31] là 2′,3,4,4′-tetrahydroxy-3′-geranylchalcone (21) cũng có hoạt tính ức chế 5-α reductase với IC50 = 104µM. Cấu trúc của hợp chất cho thấy rằng sự hiện diện của một nhóm thế isoprene (prenyl hay geranyl) sẽ tăng khả năng ức chế 5α- reductase. - Giảm thiểu chứng xơ vữa động mạch [41]: Việc bảo vệ tế bào bình thường khác khi sử dụng hoá chất trị liệu được đánh giá trên tế bào U937 của người nuôi cấy bằng OxLDL dùng 4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1) oxi hoá. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong cao ethyl acetate của cây Xa kê có chứa thành phần của chất bảo vệ tế bào bình thường khác là β-sitosterol và 6 flavonoids. - Kháng oxi hoá: Kai-Wei Lin, Chiung-Hui Liu, Huang-Yao Tu, Horng-Huey Ko, Bai-Luh Wei [21] đã chứng minh hợp chất cyclogeracommunin, artoflavone A, artomunoisoxanthone, artocommunol CC, artochamin D , artochamin B , dihydroartomunoxanthone được cô lập từ vỏ rễ cây Xa kê có khả năng ức chế chất xúc tác phá huỷ DNA, chống lão hoá. - Trị chứng cao huyết áp: Siddesha J. M., D’Souza C. J. M., Viswanath B. S., Govil, J. N.,Singh, V. K [35] nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme chuyển hoá angiotensin làm tăng huyết áp từ các cây thuốc, kết quả cho thấy trong cao ethanol và cao methanol của lá Xa kê có hiệu quả cao hơn so với cao nước và cao acetone. - Kháng vi sinh: Victor Kuete, Patrick Y Ango, Ghislain W Fotso, Gilbert DWF Kapche, Jean P Dzoyem, Arlette G Wouking, Bonaventure T Ngadjui, Berhanu M Abegaz [39] dùng phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC và nồng độ thấp nhất tiêu diệt vi sinh MMC để đánh giá. Kết quả là giá trị MIC thấp nhất trên cao tổng 64 μg/ml đối với khuẩn Staphylococcus aureus ATCC 25922 và khuẩn Escherichia coli ATCC 8739. Tương ứng MIC đạt 32 μg/ml khi thử cả 2 chất (58), (59) trên khuẩn Pseudomonas aeruginosa PA01và thử (59) trên khuẩn E.coli ATCC 8739. - Trừ giun sán: Carine Marie-Magdeleine, Maurice Mahieu, Marie-Laure Lastel, Harry Archimede [13] đã đưa ra đánh giá dựa trên thí nghiệm đối với lá của quả Xa kê có hạt và không hạt thử trên loài giun đỏ Haemonchus contortus, kết quả định lượng cho thấy hàm lượng polyphenol và tannin chứa trong cao nước, cao MeOH của lá già --32-- và lá tươi của cây Xa kê có hạt và không hạt rất nhiều, do đó lá Xa kê có khả năng diệt trừ giun sán. - Diệt côn trùng: Nghiên cứu khả năng diệt côn trùng trên vỏ lá Xa kê của Williams, L.A.D.; Mansingh, Ajai [42] bằng cách sử dụng loài bọ trưởng thành Cylas formicarius. Kết quả cho biết trong vỏ lá có chứa một triterpene pentacyclic có liên kết đôi ở vị trí 12 và 13 có khả năng chống côn trùng và độc tính giảm theo mỗi phân đoạn chiết cao. LC50 (mg/g thể trọng) trong 48 giờ của các cao tương ứng, cao tổng 3,9 mg/g; cao Hexan 5,5 mg/g; cao MeOH 7,8 mg/g; chất triterpene 11,5mg/g. Còn trong cao EtOAc thì lại không có khả năng ức chế, người ta thử với liều trên 10,0 mg/g nhưng chỉ cho hiệu quả ức chế 20%. Đặc biệt hiệu quả tăng gấp 6 lần khi pha dẫn xuất triterpene 1% DMSO trong acetone kết quả cho LC50 = 1,9 mg/g. --33-- CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ 2.1.1. Phương pháp sắc ký bản mỏng [7] Sắc ký bản mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography) dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ. Bình sắc ký là bình bằng thủy tinh trong suốt, hình dạng đa dạng, có nắp đậy. Pha tĩnh là một lớp mỏng silica gel khoảng 0,25mm phủ lên bề mặt một tấm nhôm phẳng. Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển chầm chậm dọc theo tấm bản mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển lên cao nhờ vào tính mao quản. mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mức dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào hiện tượng hấp thu của pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. Mẫu cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1μl dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình. 2.1.2. Phương pháp sắc ký cột [7] Sử dụng phương pháp sắc ký cột hấp thu (Adsorption chromatography). Pha tĩnh là hạt silica gel thường và hạt silica gel pha đảo C18 được nạp nén chặt vào cột inox hoặc cột thuỷ tinh. Pha động là chất lỏng, dung môi hoặc hệ các dung môi khác nhau. Trong sắc kí hấp thu, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu lên bề mặt của chất rắn pha tĩnh. Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh, hệ quả là trong quá trình pha động di chuyển chúng sẽ tách xa nhau ra. Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực (tương tác lưỡng cực - lưỡng cực), do sự tương tác giữa những phân tử có mang những nhóm phân cực đối với pha rắn là chất rất phân cực. Trong sắc ký cột hấp thu pha rắn thường --34-- là những hạt silica gel. Trên bề mặt những hạt này có mang nhiều nhóm -OH nên đây là những pha tĩnh có tính rất phân cực. 2.1.3. Phương pháp phổ [7] Sử dụng phổ cộng hưởng từ để xác định cấu trúc của một hợp chất hữu cơ. Phổ 1H-NMR Cho thông tin về các proton 1H có trong phân tử. Các thông số của phổ 1H-NMR cho biết độ dịch chuyển hóa học δ, hình dạng tín hiệu và hằng số tương tác (J) spin - spin giữa các proton không tương đương kế cận nhau sẽ cho các kiểu ghép vân phổ (tín hiệu bội), cường độ tích phân của tín hiệu thể hiện số lượng proton tương ứng với tín hiệu đó. Phổ 13C-NMR Cho thông tin về các cacbon có trong phân tử. Các tín hiệu phổ 13C-NMR xuất hiện trong khoảng thang chia độ rộng (0 - 250 ppm) (có thể đến 600ppm cho trường hợp đặc biệt) nên các tín hiệu tách rõ ràng, mũi đơn dễ quan sát. Mỗi loại cacbon trong hợp chất hữu cơ có độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của cacbon trong phổ 13C-NMR, có thể dự đoán được loại cacbon và liên kết của cacbon đó. Kỹ thuật ghi phổ 13C-NMR khử ghép DEPT cũng là một dạng phổ 13C-NMR, thực hiện đồng thời trên cả 2 kênh 1H-NMR và 13C-NMR. Phổ 13C-NMR DEPT cho các tín hiệu cacbon gắn với 1, 2 hoặc 3 hydro. - DEPT-45 mỗi cacbon có mang hydrogen đều cho hiện 1 mũi trên phổ đồ. - DEPT-90 chỉ những cacbon loại metin -CH cho mũi dương. - DEPT-135 cho xuất hiện mũi dương các cacbon metin -CH và metil -CH3, xuất hiện mũi âm các cacbon metilen CH2, cacbon tứ cấp không cho mũi trong phổ. Phổ 2 chiều gồm HSQC, HMBC và COSY Phổ HSQC: khảo sát hạt nhân 1H ghép cặp với 13C, cho tín hiệu của cacbon gắn trực tiếp vào proton, nghĩa là tương tác ngang qua 1 nối hóa trị. --35-- α-glucosidase Phổ HMBC: cho biết tương tác xa, ngang qua 2 hoặc 3 nối hóa trị và không xuất hiện tín hiệu tương tác ngang qua 1 nối hóa trị. Phổ COSY: cho biết mối liên quan giữa các proton với nhau: proton gem (2 proton gắn trên cùng một cacbon), proton vic (2 proton gắn trên 2 cacbon kề nhau), mối liên quan giữa các nguyên tử H trong một phân tử. 2.2. THỬ HOẠT TÍNH Phương pháp nghiên cứu hoạt tính ức chế men α-glucosidase trong điều trị đái tháo đường loại 2 là phương pháp được chúng tôi ưu tiên sử dụng vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hoá chứ không tham gia vào quá trình chuyển hoá đường hay cải thiện chức năng của insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của tế bào beta tuyến tuỵ như các phương pháp khác. Phương pháp dựa trên nguyên tắc : - Men α-glucosidase khi gặp nối α-D-glucose sẽ cắt đứt liên kết để giải phóng đường D-glucose - Sử dụng chất nền có liên kết α với đường D-glucose như p-nitrophenyl-α-D- glucopyranoside, dưới tác dụng của men α-glucosidase sẽ bị thuỷ phân cho ra đường D-glucose và p-nitrophenol. - p-nitrophenol hấp thu trong ánh sáng nhìn thấy được nên tiến hành đo độ hấp thu A ở bước sóng λ= 405nm. Từ đó xác định lượng D-glucose sinh ra. - p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside  α-D-glucopyranoside + p-nitrophenol O HO HO OH O OH O HO HO OH OH OH + OH NO2 NO2 Theo phản ứng lượng glucose sinh ra tỉ lệ với PNP. Vì vậy có thể đo độ hấp thu A của PNP ở bước sóng 405nm để xác định lượng glucose sinh ra. So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu ức chế và không ức chế để xác định % ức chế. Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50. --36-- Phần trăm ức chế và chỉ số IC50 Phần trăm ức chế I% Hoạt tính ức chế của các cao chiết và chất sạch được tính theo công thức: Do [Glc] = [PNP] nên Vì [PNP] tuyến tính bậc 1 với A nên Trong đó: [PNP]o nồng độ PNP sinh ra khi không sử dụng chất ức chế (mM) [PNP]i nồng độ PNP sinh ra khi sử dụng chất ức chế ở nồng độ i (mM) [A]o độ hấp thu trung bình khi không sử dụng chất ức chế [A]i độ hấp thu trung bình khi sử dụng chất ức chế ở nồng độ i. Chỉ số IC50 Chỉ số IC50 là nồng độ của một mẫu ức chế mà tại đó nó ức chế 50% enzym α- glucosidase. Giá trị IC50 là giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế (mạnh hay yếu) của hoạt chất. Mẫu có hoạt tính ức chế ức chế càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. Có thể tính chỉ số IC50 dựa vào đồ thị hoặc từ phương trình đường cong phần trăm ức chế theo nồng độ chất ức chế. [A]o x100 I % = [A]o – [A]i [PNP]o x 100% [PNP]o – [PNP]i I % = I % = [Glc]o x 100% [Glc]o – [Glc]i --37-- CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. HOÁ CHẤT THIẾT BỊ 3.1.1. Hoá chất Chloroform (T) Trung Quốc. Ethyl acetate (T) Trung Quốc. Methanol (T) Trung Quốc. n-Hexan(T) Trung Quốc. Ethanol 96o (T) Việt Nam. DMSO (A) Merck. Nước tinh khiết HPLC. Acid Formic (A) Prolabo Thuốc thử hiện hình bản mỏng: dung dịch H2SO4 10% trong EtOH. Pha 50ml H2SO4 đậm đặc trong 500ml EtOH 95%. p-nitrophenol (PA) Merck. p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PA) Merck. α-glucosidase 0,9 U/ml (Sigma). Na2HPO4 (PA) Prolabo. KH2PO4 (PA) Prolabo. Nước khử ion. Thuốc viên trị tiểu đường Arcabose 50mg. 3.1.2. Thiết bị Máy siêu âm Elma S100 H Elmasonic. Máy cô quay chân không BUCHI Ratavapor R-200. Sắc ký bản mỏng (TLC) Merck-GF60 F254, kích thước 20x20cm, độ dày lớp hấp phụ 0,2mm (Merck, Germany). Bình phun xịt thuốc thử. Bếp điện dùng nướng bản mỏng Blacker®. --38-- Máy soi UV: MINERALIGHT ® LAMP, U.S.A dùng bước sóng 254nm. Cột sắc ký trung áp dùng silicagel 60, Merck, đường kính hạt 0,040-0,063 mm. Cột sắc ký điều chế cột pha đảo dùng silicsgel 60, Merck, cỡ hạt: 15 µm. Cân điện tử TANITA KD-200 và PRECISA XB 220ª. Máy đo mật độ quang Elx800 Bio Tek, dùng máy đọc đĩa 96 giếng. Máy đo pH inoLab 720. Tủ sấy UE 400. Micropipette 20-200 µl và 100 – 1000 µl. LC-MS đo trên máy Agilent 1260/6120. Phổ cộng hưởng từ đo trên máy Brucker Advant 500 MHz. --39-- Hình 7: TLC Hình 9: Sắc kí điều chế P-HPLC Hình 8: MPLC Hình 10: Máy đo mật độ quang Hình 11: Máy đo pH Hình 6: Máy cô quay chân không --40-- 3.2. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CHẤT 3.2.1. Điều chế cao thô từ lá Xa kê Nguyên liệu Thu thập mẫu: lá Xa kê tươi được thu hái ở Cần Thơ vào tháng 8 năm 2011. Lá được thu hái phải còn xanh nguyên không bị úa vàng. Xử lý mẫu: cắt bỏ phần héo úa, dập nát, đem rửa sạch với nước. Điều chế cao Lá Xa kê tươi (5kg) sau khi được xử lí đem chiết với EtOH 96% theo phương pháp siêu âm, phần dịch chiết đem cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao EtOH (276 g) ở dạng sệt. Toàn bộ cao EtOH đem đi siêu âm nhiều lần với n-hexan chia làm hai phần: Phần tan trong n-hexan đem lọc lấy dịch cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp được cao Hexan (54 g) ở dạng sệt. Phần không tan trong n-hexan tiếp tục siêu âm nhiều lần với dung môi EtOAc thu được hai phần: Phần tan trong EtOAc đem lọc lấy dịch cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp được cao EtOAc (17 g) ở dạng sệt. Hình 12: Lá Xa kê tươi đem chiết Hình 13: Lá Xa kê héo không chiết --41-- Phần không tan trong EtOAc tiếp tục được siêu â