Đề tài Nghiên cứu vòng đời của vi tảo lục Haematococcus pluvialis trong điều kiện phòng thí nghiệm

MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Vi tảo (Microalgae) là những loại tảo có kích thước hiển vi. Chúng có vai trò rất quan trọng trong tự nhiên và trong đời sống của con người. Trong các thuỷ vực tảo cung cấp oxy và là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn của thủy vực, cung cấp hầu hết thức ăn sơ cấp cho cá cũng như các động vật thuỷ hải sản khác. Nhiều loại tảo biển còn được khai thác để sản xuất thạch (agar), alginate, sản phẩm giàu iod, làm phân bón... Nhiều tảo đơn bào được nuôi trồng công nghiệp để tạo ra những nguồn thức ăn cho ngành nuôi trồng thủy sản hay thực phẩm chức năng bổ dưỡng giàu protein, vitamin và khoáng dùng cho người. Tảo còn là nguyên liệu trong các ngành Y, Dược, mỹ phẩm, được sử dụng trong xử lí ô nhiễm môi trường, làm phân bón, góp phần giảm nhẹ sự biến đổi khí hậu toàn cầu (sử dụng tảo để giảm thiểu hiệu ứng nhà kính), gớp phần trong việc giải quyết vấn đề an ninh năng lượng (sản xuất nhiên liệu sinh học từ tảo)... Tuy nhiên, ứng dụng phổ biến nhất hiện nay của vi tảo là làm thức ăn trong nuôi trồng thuỷ sản và tách chiết những chất có hoạt tính sinh học có thể thương mại hóa được. Trong những sản phẩm từ tảo thì astaxanthin có giá trị thương mại lớn do các ứng dụng đa dạng và giá thành cao (khoảng 2500 – 3000 USD/kg) [27]. Đây là một loại chất thuộc nhóm carotenoit, có thể tìm thấy trong nhiều loại hải sản như cá hồi, cá vền, tôm cua, trứng cá, một số loài chim [15]. Động vật có vú không thể tự tổng hợp được astaxanthin và phải được cung cấp từ khẩu phần ăn. Loài vi tảo lục Haematococcus pluvialis có khả năng tích luỹ astaxanthin cao nhất. Tuy nhiên, hiện nay công nghệ nuôi tảo Haematococcus pluvialis để cung cấp nguồn giống thuần cho các nghiên cứu chuyên sâu về khoa học cơ bản trên đối tượng này cũng như ứng dụng sinh  khối tảo trong thực tế vẫn đang là thách thức đối với các nhà khoa học của Việt Nam. Chính vì thế, để có thể chủ động nguồn giống phù hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam, chúng ta cần phải tiến hành: “Nghiên cứu vòng đời của vi tảo lục Haematococcus pluvialis trong điều kiện phòng thí nghiệm”. Công việc được thực hiện tại phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về tảo và vi tảo 1.1.1. Khái niệm về tảo và vi tảo Tảo (Algae) là những thực vật bậc thấp (thực vật có bào tử, cơ thể không phân chia thành thân, rễ, lá). Trong tế bào (TB) tảo có chứa diệp lục và chúng sống chủ yếu ở nước. Vi tảo (Microalgae) là tất cả các loại tảo có kích thức hiển vi tức là muốn quan sát được chúng thì phải sử dụng kính hiển vi. Trong số khoảng 50.000 loài tảo trên thế giới thì vi tảo chiếm khoảng 2/3. Vai trò quan trọng của vi tảo thể hiện qua quá trình quang hợp hấp thụ CO2, cung cấp O2 cho các sinh vật khác trên trái đất, khép kín vòng tuần hoàn vật chất và làm tăng tốc độ quay vòng của các chu trình đó [5]. Tảo có mặt ở khắp nơi trên trái đất, từ đỉnh núi cao cho đến dưới đáy biển sâu, thậm chí ở cả độ sâu khoảng 200m dưới biển nếu như nước biển ở đó rất sạch [9]. Những loài tảo sống trong các thuỷ vực được gọi là tảo phù du (phytoplankton) còn những tảo sống bám đáy thủy vực, bám trên các vật sống hay các thành tàu thuyền được gọi là tảo đáy (Phytobentos). Dạng tảo cộng sinh với nấm thành Địa y cũng là dạng phân bố rất rộng rãi và nhiều loài đã được khai thác dùng làm dược phẩm, nước hoa, phẩm nhuộm và các mục đích kinh tế khác (hiện đã biết tới 20.000 loài Địa y thuộc 400 chi khác nhau) [41]. 1.1.2. Vài nét về đặc điểm sinh học của tảo Cơ thể tảo được gọi là tản (thallus) vì thiếu thân, rễ và lá nhưng chúng lại có chlorophyll a - sắc tố quang hợp điển hình. Hầu hết các loại tảo đều sống trong môi trường nước, từ nước ngọt đến nước mặn và nước lợ. Tảo có cấu trúc từ dạng đơn bào đến đa bào và tập đoàn. Nhìn chung tế bào tảo có một số đặc điểm cấu trúc tương tự như thực vật bậc cao: có vách TB cấu tạo từ cellulose, có lục lạp và chlorophyll [3]. Một số cấu trúc dạng tản của tảo mà chúng ta thường gặp là cấu trúc mônát, cấu trúc palmella, cấu trúc hạt, cấu trúc sợi, cấu trúc dạng bản và cấu trúc ống (siphon). Nhìn chung tảo có 3 phương thức sinh sản là sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính [3]. Phương thức dinh dưỡng của tảo được phân thành hai loại chính: quang tự dưỡng (photoautotrophy) và dị dưỡng (heterotrophy). Dạng trung gian của hai hình thức trên là tạp dưỡng (mixotrophy) [1]. Những tảo sống trên bề mặt thì cần ánh sáng để quang hợp. Quá trình quang hợp sử dụng CO2 và ánh sáng mặt trời để tạo ra các vật chất hữu cơ. Ở dạng tạp dưỡng, quang hợp vẫn là quá trình cơ bản để tạo chất hữu cơ nhưng trong một số trường hợp, tảo sử dụng được cả các chất hữu cơ có sẵn. Môi trường dinh dưỡng cho nuôi trồng tảo phải dựa theo nhu cầu dinh dưỡng của từng loài. Mặc dù vậy, việc xác định chính xác nồng độ của từng yếu tố dinh dưỡng cho một loài nào đó là rất khó khăn vì nồng độ dinh dưỡng tối ưu phụ thuộc rất nhiều vào mật độ quần thể, ánh sáng, nhiệt độ và pH môi trường. 1.1.3. Sinh trưởng của tảo: Sự tăng trưởng của tảo nuôi trồng trong điều kiện vô trùng được đặc trưng bởi 5 pha [30] được thể hiện ở hình 1.   Hình 1: Năm pha sinh trưởng của vi tảo   - Pha chậm hoặc cảm ứng (1): Tảo sinh trưởng chậm, mật độ TB tăng ít do phải thích nghi dần với môi trường sống mới. - Pha sinh trưởng theo hàm số mũ (2): Ở pha này mật độ TB tăng nhanh - Pha giảm tốc độ sinh trưởng (3): Sự phân chia TB sẽ chậm lại khi các chất dinh dưỡng, ánh sáng, độ pH, CO2 hoặc các yếu tố lý hóa khác bắt đầu hạn chế sự sinh trưởng. - Pha ổn định (4): Mật độ TB tương đối ổn định, không thay đổi do các yếu tố hạn chế và tốc độ sinh trưởng ở trạng thái cân bằng. - Pha tàn lụi (5): Chất lượng môi trường trở nên xấu đi, các chất dinh dưỡng suy kiệt tới mức không thể duy trì được sự sinh trưởng. Mật độ TB giảm mạnh. 1.1.4. Phân loại: Căn cứ vào màu sắc, sự có mặt của các chất dự trữ, thành phần vỏ, cấu tạo nhân TB người ta có thể chia tảo thành những ngành khác nhau. Vi tảo chủ yếu thuộc về các chi trong các ngành sau: 1- Ngành Chlorophyta (Tảo lục): Các chi Closterium, Coelastrum, Dyctyosphaerium, Scenedesmus, Pediastrum, Staurastrum, Dunaliella, Chlamydomonas, Haematococcus, Tetraselmis, Chlorella... 2- Ngành Heterokontophyta (Tảo lông roi lệch): Các chi Melosira, Asterionella, Cymatopleurra, Somphonema, Fragilaria, Stephanodiscus, Navicula, Malomonas, Dinobryon, Peridinium, Isochrysis, Chaetoceros, Phaeodactylum, Skeletonema, Nitzschia...... 3- Ngành Euglenophyta (Tảo mắt): Các chi Phacus, Trachelomonas, Ceratium... 4- Ngành Rhodophyta (Tảo đỏ): Các chi Porphyridium, Rhodella... 1.1.5. Giá trị dinh dưỡng của vi tảo: Ưu điểm của vi tảo là kích thước nhỏ phù hợp, dễ tiêu hoá, ít gây ô nhiễm môi trường, nhiều loài không có độc tố, có thể chuyển hoá trong chuỗi thức ăn, tỷ lệ phát triển nhanh, có khả năng nuôi sinh khối lớn, cung cấp đầy đủ các dưỡng chất cần thiết cho động vật nuôi. Do đó đây là thức ăn sống đặc biệt quan trọng cho tất cả các giai đoạn phát triển của động vật thân mềm hai vỏ (Bivalvia) như: hầu, điệp, sò…; ấu trùng của hầu hết các loài tôm, cá, ốc và cho các động vật phù du. Nhìn chung hàm lượng protein của vi tảo dùng trong nuôi trồng thuỷ sản thay đổi từ 6 – 52%, carbohydrate: 5 - 23%, lipit: 7 - 23% [8]. Đến nay, tất cả các nghiên cứu đều xác định rằng các loài tảo khác nhau thì chúng có giá trị dinh dưỡng khác nhau. Một loài tảo có thể thiếu ít nhất một thành phần dinh dưỡng cần thiết. Vì vậy, việc sử dụng hỗn hợp các loài tảo làm thức ăn cho động vật, thuỷ sản sẽ cung cấp chất dinh dưỡng tốt hơn nhưng phải biết kết hợp các loài tảo cho hợp lý cả về tỷ lệ và thành phần, phù hợp với nhu cầu dinh dưỡng của từng đối tượng nuôi cụ thể thì mới đem lại hiệu quả cao. 1.2. Những ứng dụng chủ yếu của vi tảo: đó là hai mảng sau: 1.2.1. Sử dụng vi tảo làm nguồn thực phẩm cho con người và động vật: Vi tảo là nguồn thực phẩm chức năng quan trọng cho con người và động vật nuôi. Bất kì một loại protein đơn bào nào cũng phải trải qua thử nghiệm cẩn thận ở động vật thực nghiệm trước khi trở thành thức ăn cho người hoặc động vật. Ví dụ sinh khối tảo Spirulina đã được Chamorro (1980) tiến hành thử nghiệm độc tố ngắn hạn và trường diễn, nghiên cứu ảnh hưởng tới sự sinh sản, khả năng tiết sữa, đột biến và gây quái thai... Nhiều nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn đối với các loài tảo khác (Scenedesmus, Micractinium, Chlorella...) cũng không tìm thấy bất cứ một bằng chứng nào về khả năng hạn chế việc sử dụng sinh khối tảo trong dinh dưỡng [3]. Vào những năm gần đây việc sử dụng vi tảo nói làm nguồn dinh dưỡng cho con người đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, nhà sản xuất và người tiêu dùng. Sinh khối tảo có giá trị dinh dưỡng cao và không có độc tố. Nhưng hiện nay việc sử dụng tảo làm nguồn thực phẩm còn gặp nhiều hạn chế vì giá thành sản xuất cao, thử nghiệm dinh dưỡng chưa đủ thuyết phục, thiếu cơ chế kiểm tra chất lượng thường xuyên và thói quen sử dụng các loại thức ăn truyền thống của người tiêu dùng. Trong tương lai, vi tảo hứa hẹn là nguồn thực phẩm sử dụng phổ biến cho mọi gia đình. Chlorella, Miractinium, Scenedesmus, Oocystis và Siprulina là các loại vi tảo thường được sử dụng để bổ sung sinh khối vi tảo vào khẩu phần thức ăn của các loại gia cầm. Ngoài ra vi tảo cũng được sử dụng có hiệu quả trong nghề nuôi tằm và nuôi cá cảnh. Việc đưa sinh khối tảo như Chlorella (protein chiếm 40 – 60% TLK), Scenedesmus (protein chiếm trên 30%), Siprulina (protein chiếm 65 – 70% TLK) [4] vào khẩu phần thức ăn của gà với tỷ lệ 7,5-10% là giải pháp có lợi về kinh tế. Các nhà khoa học đã thử nghiệm việc đưa sinh khối tảo Siprulina vào thức ăn của cá mè trắng, trắm cỏ, rô phi với tỷ lệ 5% làm tăng tỉ lệ sống và tốc độ tăng trưởng của cá. Những thí nghiệm gần đây cho thấy việc bổ sung tảo tươi vào khẩu phần thức ăn của gà mái đẻ giúp tăng tỷ lệ đẻ và hàm lượng VTM A có trong trứng [3]. Do đó, việc ứng dụng vi tảo vào ngành chăn nuôi đang được coi là một hướng đi đầy tiềm năng và có triển vọng nhất. 1.2.2. Khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ tảo: Nhiều VTM hoà tan trong nước (B1, B12, B6, Biotin, C) được tìm thấy trong dịch nuôi tảo lam, tảo silic và tảo lục. Những loại VTM này được phát hiện dưới dạng các chất trao đổi trung gian như α-, β-, γ-tocopherol (VTM E) ở tảo lam và α-tocopherol và VTM K ở Pophyridium cruentum. Hàm lượng VTM trong sinh khối tảo phụ thuộc vào kiểu gen, chu trình sinh trưởng, điều kiện nuôi trồng và các thao tác di truyền. Hiện nay ở nhiều nước như Đài Loan, Nhật Bản, các chủng tảo Chlorella, Pophyridium đã được nuôi để sản xuất VTM. Trong vi tảo cũng chứa nhiều chất béo tương tự như ở dầu thực vật. Hàm lượng lipit trong tảo dao động từ 20-40% TLK. Trong một số điều kiện nhất định, tảo có thể chứa tới 85% lipit theo TLK. Ngoài chlorophyll, vi tảo còn chứa một số sắc tố bổ trợ như phycobiliprotein và carotenoit. Các loại carotenoit thông thường chỉ chiếm 0,1% TLK của vi tảo nhưng ở một số loài, chúng có thể đạt từ 5-14% TLK. Các sắc tố này có thể đánh dấu kháng thể đơn dòng ứng dụng trong nghiên cứu miễn dịch. Mặt khác, phycobiliprotein và β-caroten được biết đến như những yếu tố nâng cao sức đề kháng của cơ thể và là chất hỗ trợ phòng chống bệnh ung thư. Vi tảo còn chứa một lượng lớn carbonhydrat dưới dạng sản phẩm dự trữ (tinh bột, glycogen) hoặc các chất điều hoà thẩm thấu (glyceron, trehalose, glucose…). Ngoài ra có thể liệt kê một số chất chống oxy hoá có mặt trong sinh khối tảo như carotenoit (sắc tố), tocopherol, VTM C (VTM), superoxydismutase, catalase và glutation peroxydase (enzyme). Các vi tảo - nguồn các chất chống oxy hoá có triển vọng đang được khai thác là: Dunaliella salina: để sản xuất β-caroten, Heamatococcus pluvialis: để sản xuất astaxanthin, Porphyridium cruentum: để sản xuất Superoxydismutase (SOD). Vi tảo còn là nguồn cung cấp các chất có hoạt tính kháng sinh (như kháng vi khuẩn, nấm). Ví dụ như: axit acrylic thu từ vi tảo Phaecystis, axit (- linoleic trong dịch chiết methanol từ tảo Spirulina platensis, Chrococcum... Testraselamiss suecia là một chất ức chế hình thành virus Vibrio sp.,. Một lượng lớn các chất tách từ vi tảo biển có vai trò diệt tảo độc hoặc thuốc trừ sâu như cyanobacterin tách từ Scytonema hofmanni đã được công bố [7]. 1.3. Thực trạng nghiên cứu - nuôi trồng vi tảo hiện nay: 1.3.1. Trên thế giới: Tảo được trồng đại trà ở các nước trên thế giới từ những năm 1972, các nước sản xuất vi tảo chủ yếu tập trung ở Châu Á và vành đai Thái Bình Dương. Những khu vực và vùng lãnh thổ có sản lượng vi tảo lớn là Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc, Thái Lan, Isarel, Hoa Kỳ, Mexico… Nhiều nhất là ở Mexico và Mỹ, nơi sản xuất tảo lớn nhất là ở Hawaii (khoảng 25 ha) và mới đây là Trung Quốc (16 ha). Trên thế giới còn có các trang trại nuôi trồng tảo với quy mô lớn, chất lượng cao như: Trang trại Twin Tauong (Myanmar) - Trang trại Sosa Texcoco (Mehico) - Công ty tảo Siam (Thái Lan) - Trang trại Chenhai (Trung Quốc) - Nông trại Hawai (HoaKỳ)… Tảo Spirulina được sử dụng như thực phẩm dinh dưỡng ở hơn 70 quốc gia trên thế giới. Người ta chỉ ra rằng ở hơn 30 trung tâm dinh dưỡng và bệnh viện ở các nước đang phát triển đã sử dụng chế phẩm từ tảo Spirulina làm thức ăn với hàm lượng 10g/ngày, kết quả cho thấy các bệnh nhân hồi phục trạng thái suy dinh dưỡng chỉ sau 1- 3 tuần lễ. Hiện có hơn 1000 bài báo khoa học được xuất bản đề cập đến hiệu quả sinh học của loài tảo này [40]. 1.3.2. Ở Việt Nam: Việt Nam có lợi thế là nước nhiệt đới, khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật, nhất là tảo ngày càng phát triển. Từ năm 1972 các nhà khoa học bắt đầu đặt vấn đề nghiên cứu tảo do cố GS.TSKH. Nguyễn Hữu Thước làm chủ trì. Năm 1976, việc thử nghiêm nuôi trồng tảo đã được tiến hành trong 4 - 5 tháng ở Nghĩa Đô, Hà Nội và thu được kết quả khá khả quan. Năm 1985, Sở Y Tế thành phố Hồ Chí Minh đã tiếp nhận giống tảo đầu tiên do ông bà R.D.Fox tặng. Sau đó, tảo giống được giao cho trạm nghiên cứu dược liệu giữ giống và nuôi trồng [39]. Hiện có 2 nơi nuôi trồng tảo ở nước ta, đó là: Công ty cổ phần nước khoáng Vĩnh Hảo (Bình Thuận) - đơn vị tiên phong trong việc nuôi trồng và sản xuất tảo lớn nhất nước ta. Ngoài ra còn một cơ sở ở Bình Chánh, thành phố Hồ Chí Minh. Nhìn chung, lịch sử nghiên cứu và nuôi trồng tảo ở nước ta đã có từ lâu và thu được nhiều kết quả ban đầu đáng khích lệ. Nhưng cho đến nay việc nuôi trồng đa số vẫn mang tính nhỏ lẻ, lạc hậu, không đáp ứng được nhu cầu sử dụng tảo ngày càng tăng cao. Vì vậy, trước những giá trị về mọi mặt mà tảo mang lại, cần phải tiến hành cải thiện, thúc đẩy ngành công nghiệp nuôi trồng tảo nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu ra thị trường nước ngoài. 1.4. Tổng quan về Haematococcus pluvialis Haematococcus pluvialis là một loài vi tảo lục, nước ngọt, đơn bào, sinh sản vô tính bằng cách nhân đôi, có thể di chuyển được [14]. Đây là một loài tảo có tiềm năng rất lớn vì khả năng tổng hợp astaxanthin của nó. Lượng astaxanthin tối đa mà loài tảo này có thể đạt được lên tới 5-6% TLK [11; 12]. Astaxanthin là một sắc tố được sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản, giúp tăng chất lượng và màu sắc thịt cá hồi và làm cá cảnh có màu sắc rực rỡ. Tuy nhiên để có thể nuôi trồng thành công và đạt được hàm lượng astaxanthin cao thì chúng ta phải biết về các giai đoạn sinh trưởng cũng như các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển của loài tảo H.pluvialis trong từng giai đoạn ấy. 1.4.1. Vị trí phân loại của Haematococcus pluvialis Vị trí của Haematococcus pluvialis trong hệ thống phân loại như sau [33]: Giới: Eukaryota Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Bộ: Volvocales                   Họ:  Chlamydomonadales Chi:  Haematococcus  Loài: Haematococcus pluvialis. 1.4.2. Đặc điểm hình thái và sự thay đổi các thành phần nội bào trong vòng đời của vi tảo lục H.pluvialis: Tảo đơn bào nước ngọt Heamatococcus pluvialis (H. pluvialis) thuộc nhóm tảo lục hai roi và có khả năng chuyển động ở giai đoạn sinh dưỡng [32]. Sinh sản vô tính bằng cách nhân đôi. Hình thái TB của H.pluvialis có sự biến đổi khác nhau trong chu trình sống của chúng. TB có 2 dạng, tương ứng với đặc điểm sinh trưởng: TB sinh dưỡng và nang bào tử (cyst). Trong đó: Hình 2. a. Tế bào H.pluvialis ở dạng sinh dưỡng, b. Tế bào H.pluvialis ở dạng nang bàng tử (cyst)[36]   - TB sinh dưỡng: màu xanh, dạng cầu hoặc elip với đường kính khoảng 10-20 µm, có thể chuyển động nhờ 2 roi. Trong điều kiện thuận lợi, phần lớn TB ở dạng sinh dưỡng, có hàm lượng chlorophyll a, b và tiền carotenoit, đặc biệt là β-carotene và lutein cao [47]. Sinh trưởng quang tự dưỡng khi có ánh sáng [11] và dị dưỡng trong tối [32]. - Nang bào tử: Khi gặp điều kiện bất lợi (cạn kiệt dinh dưỡng, cường độ ánh sáng cao, nhiệt độ cao, stress muối….) TB sẽ cảm ứng hình thành nang bào tử và hình thái thay đổi sang dạng cyst. TB dạng này hình cầu, mất roi, không còn khả năng di động. Thành TB dầy lên. Đường kính của TB tăng lên đột ngột tới 40-50 µm [27]. Ngoài ra, những TB nang này có hàm lượng carotenoit thứ cấp như echinenone, canthaxanthin và astaxanthin cao trong khi đó hàm lượng chlorophyll và tiền carotenoit lại giảm [13]. Tốc độ sinh trưởng của H. pluvialis ở giai đoạn này giảm, TB tích luỹ một lượng lớn astaxanthin. Ban đầu, astaxanthin chủ yếu được hình thành tập trung quanh nhân và quá trình được tiếp diễn tới khi toàn bộ TB chuyển sang màu đỏ [26]. Các TB dạng cyst có hàm lượng astaxanthin đạt khoảng 5% TLK [31]. Thời gian chuyển pha mất khoảng vài tuần dưới điều kiện quang tự dưỡng [14]. Cùng lúc với sự thay đổi hình thái và kích thước TB là sự thay đổi hàm lượng sắc tố và protein nội bào, trong đó diễn ra sự tích lũy asxanthin cao. Theo một số công bố cho thấy hàm lượng chlorophyll không thay đổi trong suốt quá trình tích lũy astaxanthin, [17] nhưng trong nghiên cứu của Spery, 1970 [34] lại cho rằng hàm lượng này có xu hướng giảm đi. Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới về vòng đời của vi tảo H.pluvialis đã chỉ ra rằng sinh trưởng của loài tảo này trải qua 4 giai đoạn với hình thái, kích thước TB, hàm lượng sắc tố và protein nội bào khác nhau. Theo Kobayashi và cs., [24] vòng đời của H. pluvialis trải qua các giai đoạn như sau (hình 3): Hình 3. Sự thay đổi hình thái trong vòng đời của H.pluvialis   (I) Giai đoạn TB sinh dưỡng: TB hình elip, chuyển động bằng hai roi, phân chia TB để gia tăng số lượng. Hàm lượng carotenoit trong TB thấp. (II) Giai đoạn tạo bào nang: Các TB sinh dưỡng chuyển sang dạng màu nâu, hình khối cầu, mất roi. Trong suốt giai đoạn nang bào, mức độ sinh tổng hợp carotenoid và protein tăng lên [25]. (III) Giai đoạn TB nang hoàn chỉnh: TB nang đã hoàn chỉnh, bất động, tích lũy hàm lượng carotenoit cao nhất. (IV) Giai đoạn nảy mầm: Xảy ra sự tổng hợp chlorophyll và protein, xuất hiện sự phân giải carotenoit. Trong vòng đời của tảo, TB sinh dưỡng chứa hàm lượng cao chlorophyll và protein nhưng hàm lượng carotenoit rất thấp. Khi quá trình bao nang kèm theo việc giảm sút hàm lượng cholophyll và protein. TB trưởng thành và tăng quá trình sinh tổng hợp carotenoit, giảm protein. Sự nảy mầm cùng với tổng hợp chlorophyll, protein và giảm carotenoit. Sự bao nang, trưởng thành và chín thường được quan sát dưới kính hiển vi. Sự tích lũy carotenoit/chlorophyll được thể hiện qua các thông số để phân biệt giữa các TB sinh dưỡng (lục), các TB còn non (nâu), và TB chín (đỏ). Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a vào khoảng 0.5; 1.0 và 7.0 trong TB sinh dưỡng, non và chín [25]. 1.4.2. Tổng quan về astaxanthin: Carotenoit là dẫn xuất của các hợp chất isopropenoit. Chúng tạo nên các màu sắc khác nhau trong tự nhiên và có các chức năng sinh học thiết yếu đối với động vật. Astaxanthin (- 3,3’-dihydroxy-β,β’-carotene-4,4’-dione) là một oxycarotenoit, có công thức phân tử C40H52O4, khối lượng phân tử M = 595, điểm nóng chảy xấp xỉ 224˚C, một chất thuộc nhóm carotenoit. Astaxanthin được tìm thấy trong nhiều loại hải sản như cá hồi, cá vền (seabream), tôm, cua, trứng cá, đôi khi nó cũng được phát hiện ở một số loài chim [18]. Ngoài tự nhiên, astaxanthin tồn tại ở dạng liên kết với protein tạo phức chất màu xanh đen. Khi gia nhiệt hay bị oxy hoá, liên kết bị cắt đứt, giải phóng astaxanthin tự do có màu đỏ cam. Động vật có vú không có khả năng tổng hợp astaxanthin mà phải được cung cấp từ khẩu phần ăn. Ở H. pluvialis, astaxanthin được tổng hợp ở giai đoạn tạo bào nang và là loại sắc tố rất đặc trưng, có giá trị kinh tế cao. Astaxanthin có vai trò là một chất chống oxi hóa với hoạt tính cao hơn các carotenoit khác nhiều lần nên được gọi là một “siêu VTM E”. Màu sắc của các loại giáp xác bắt nguồn từ loại carotenoit chúng thu nhận trong thức ăn, chính là astaxanthin. Nó còn có vai trò thúc đẩy sự thành thục, tăng tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ sống sót của trứng và cải thiện sự phát triển của phôi [18]. 1.4.3. Các yếu tố môi trường khác nhau: * Ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng của H. Pluvialis: gồm các yếu tố sau: Ánh sáng: Cường độ ánh sáng tối ưu cho sinh trưởng của H. pluvialis dao động từ 2-24 klux [15; 16; 23]. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của H. pluvialis dao động từ 15-27˚C [26; 33]. pH tối ưu cho sự phát triển của H. pluvialis nằm trong khoảng từ 6,5-8 [27]. Cuối cùng là nguồn dinh dưỡng: Bao gồm đa lượng và vi lượng. Dinh dưỡng đa lượng phải được cung cấp với lượng lớn (carbon, nitơ, phospho, canxi...). Tốc độ sinh trưởng của H. pluvialis cao khi nồng độ nitơ và phospho cao. Các nguyên tố vi lượng chỉ cần cung cấp với hàm lượng thấp, dao động từ mức μg/l đến mg/l. Một số dinh dưỡng vi lượng cần thiết cho sinh trưởng của tảo đã được biết gồm sắt, boron, mangan, đồng và các VTM... [23]. * Ảnh hưởng tới sự tích luỹ astaxanthin ở H. pluvialis Khả năng tích luỹ astaxanthin ở H. pluvialis cũng bị phụ thuộc rất nhiều vào những thông số môi trường sau [22]: Ánh sáng là yếu tố quan trọng kích thích quá trình sinh tổng hợp carotenoit, đặc biệt là astaxanthin ở H. pluvialis. Cường độ ánh sáng tối ưu cho tổng hợp - tích luỹ astaxanthin ở H. pluvialis dao động từ 75-100 klux. Tuy nhiên khả năng sinh tổng hợp carotenoit còn phụ thuộc vào chất lượng ánh sáng (dưới ánh sáng xanh hiệu quả hơn ánh sáng đỏ). Nhiệt độ: việc tổng hợp và tích luỹ astaxanthin tăng lên dần dần khi tảo được nuôi trồng ở điều kiện nhiệt độ cao. Nhiệt độ tối ưu cho sự tổng hợp astaxanthin là trên 30˚C [36; 15]. Cuối cùng là các yếu tố dinh dưỡng: Nguồn carbon và nitơ: Đối với H. pluvialis, giới hạn nguồn nitơ là yếu tố chìa khoá cho tổng hợp và tích luỹ astaxanthin [24]; Phospho: Trong điều kiện thiếu hụt phosphate, H. pluvialis có thể tích luỹ một lượng lớn astaxanthin [19; 10]; Stress độ mặn: dưới điều kiện stress độ mặn, tích luỹ astaxanthin trong bào nang xảy ra cả trong tối và ngoài sáng. 1.5. Nguồn cung cấp astaxanthin: 1.5.1. Nguồn astaxanthin tổng hợp hoá học Hiện nay, astaxanthin tổng hợp là nguồn cung cấp chủ yếu cho nuôi trồng thuỷ sản. Hơn 95% astaxanthin tổng hợp trên thị trường được sử dụng làm thức ăn, tạo ra các màu sắc khác nhau. Dù vậy, nguồn astaxanthin này có giá thành rất cao, không tinh khiết và tiềm ẩn nhiều sản phẩm phụ có nguy cơ gây hại. 1.5.1. Các nguồn astaxanthin trong tự nhiên Nguồn astaxanthin được tìm thấy trong nhiều đối tượng như từ phế liệu giáp xác thuỷ sản: (astaxanthin tập trung chủ yếu ở phần vỏ ngoài, chiếm 58-87% carotenoit tổng số) [11], từ nấm men Phaffia rhodozyma [6], một số loại vi khuẩn như Mycobacterium lacticola, Brevibacterium sp. và một số chủng nấm mốc thuộc chi Peniophora cũng có khả năng tích luỹ astaxanthin (khoảng 30 μg/g TB) [14]. Tuy nhiên hàm lượng astaxanthin tích lũy được lại ít, quá trình sinh trưởng – phát triển diễn ra chậm nên không thích hợp để sản xuất trên quy mô công nghiệp. Ngoài ra còn một nguồn cung cấp astaxanthin khác có triển vọng hơn những đối tượng trên, đó là vi tảo: Astaxanthin có thể được sản xuất từ nhiều loại vi tảo khác nhau như Ankitrodesmus branuii, Chlorella zofingiensis, Dunaliella salina, Chlamydomonas (<50 μg/g TB)... nhưng hàm lượng astaxanthin ở những đối tượng này lại khá thấp và không thích hợp để sản xuất thương mại. Trong khi đó loại tảo lục Heamatococcus pluvialis đã thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà nghiên cứu và sản xuất ứng dụng vì chúng có khả năng tích luỹ 1 lượng lớn astaxanthin (7.000-55.000 μg/g TB, tương ứng 0,7-5,5% SKK) [37]. Trước đây, giá thành sản xuất vi tảo rất cao (khoảng 5-20 USD/kg SKK) nên khó có thể sử dụng nguồn H. pluvialis để sản xuất astaxanthin cho mục đích thương mại. Gần đây, nhờ sự phát triển mạnh mẽ các kĩ thuật, công nghệ trong nuôi trồng vi tảo nên giá thành sản xuất H. pluvialis đã giảm đáng kể và làm cho loại vi tảo này thực sự trở thành một trong những nguồn astaxanthin tự nhiên quan trọng, có tiềm năng thương mại lớn nhất hiện nay.