Đề tài Sưu tập và xây dựng quỹ gen invitro một số giống hoa cúc phổ biến tại Đà Lạt

ự tái sinh phôi soma là sự hình thành cấu trúc lưỡng cực chứa cả chồi và rễ. Hầu hết các cây trồng có thể tái sinh cây theo cách phát sinh cơ quan hoặc phôi soma nhưng rất ít loài có thể được cả hai cách. Một số loài có thể tái sinh một cách dễ dàng từ nuôi cấy mô và tế bào trong khi một số loài chỉ có thể tái sinh bằng quá trình bất định. Sự tái sinh cây từ chồi nách hoặc chồi đỉnh được ứng dụng rộng rãi trong vi nhân giống do có sự biến dị ít nhất. Ngược lại sự phát sinh chồi bất định và sự tái sinh cây từ callus bởi sự phát sinh cơ quan hoặc bởi phôi soma có biến dị cao như tốc độ tái sinh của nó. 1.1.4.1. Các bước thực hiện trong kỹ thuật vi nhân giống Trong kỹ thuật vi nhân giống có 4 giai đoạn đặc trưng (Murashige 1974, George và cs. 1984). Giai đoạn 1: Lựa chọn mẫu cấy và nuôi cấy khởi đầu. Giai đoạn 2: Nhân nhanh chồi con hoặc chồi mầm từ mẫu ban đầu. Sự tái sinh chồi bất định là kỹ thuật nhân nhanh được sử dụng thường xuyên nhất trong vi nhân giống (Chu 1992). Môi trường nuôi cấy và điều kiện sinh trưởng trong giai đoạn này được cung cấp tối ưu để tỉ lệ nhân nhanh chồi đạt tối đa. Giai đoạn 3: là giai đoạn tái sinh rễ từ chồi con để tái sinh cây con. Giai đoạn này cần môi trường đặc trưng hoặc không, điều này phụ thuộc vào kiểu gen của loài. Giai đoạn 4: hoàn chỉnh cây con cho thích nghi trên điều kiện trồng trên hỗn hợp đất trong nhà kính để sau đó chuyển ra đồng ruộng. 1.1.4.2. Các nhân tố trong môi trường nuôi cấy invitro Mức độ thành công của bất kỳ một kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào hoặc nuôi 10 cấy cơ quan đều liên quan đến nhiều nhân tố. Nhân tố quan trọng là lựa chọn thành phần dinh dưỡng và chất điều tiết sinh trưởng. Trong hai đến ba thập kỷ qua đã có nhiều báo cáo về thành phần của các môi trường cơ bản (Sheet và Shillito, 1997; Perik 1987; Torres, 1989). 1.1.4.3. Môi trường nuôi cấy Có hơn 50 công thức môi trường khác nhau được sử dụng cho nuôi cấy in vitro nhiều loại cây khác nhau (Gamborg và cộng sự, 1976; Huang và Murashige, 1977). Trong đó môi trường MS được sử dụng phổ biến nhất, có cải biên bằng sự thay đổi thành phần các vi lượng (Chand và cs., 1977; Jha và Sen, 1985; Rout và cs., 1999; Saxena và cs., 1988). Môi trường dinh dưỡng bao gồm các loại muối vô cơ, nguồn cacbon, vitamin và chất điều tiết sinh trưởng. Một số thành phần khác có thể được bổ sung thêm như nitơ vô cơ, acid vô cơ và chất chiết cây trồng (Gamborg, 1986). Các muối khoáng được sử dụng như là thành phần của môi trường nuôi cấy mô tế bào. Hầu hết các môi trường chứa ít nhất 30mM nitơ vô cơ và kali vô cơ. Muối amonium có thể được sử sụng từ 2-20mM. Ảnh hưởng của muối amonium có thể thay đổi từ ức chế đến hiệu quả. Nồng độ Ca, SO4, photphat và muối Mg từ 1-3 mM là thích hợp. Ngoài ra trong môi trường cũng cần bổ sung thêm một số khoáng vi lượng. Môi trường MS (1962) hoặc Linsmainer và Skoog (1965) (LS) được sử dụng rộng rãi, đặc biệt là trong quá trình tái sinh cây. Môi trường B5 (Gamborg và cs., 1968), N6 (Chu, 1978), Nisch và Nitsch (1969) (NN) và các dẫn xuất từ các môi trường này có thể được sử dụng rộng hơn cho nhiều loại cây. Theo Huang và cs., Indra D. Bhatt và Uppeandra Dhar (2000), cây dâu tây phát triển thích hợp trên môi trường MS. 1.1.4.4. Các chất điều tiết sinh trưởng Liều lượng chất điều tiết sinh trưởng lên môi trường nuôi cấy quyết định rất lớn đến sự thành công của nuôi cấy mô thực vật. Mor và Zieslin (1987), Rout và cs. 11 (2000) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và mối tương tác giữa chúng lên vi nhân giống của nhiều loại cây khác nhau, trong đó đã có báo cáo rất rõ về ảnh hưởng của auxin và cytokinin lên sự nhân nhanh chồi của nhiều loại cây khác nhau. Cytokinin là chất điều tiết sinh trưởng thích hợp cho việc nhân nhanh chồi. Theo Indra D. Bhatt và Uppeandra Dhar khi sử dụng BA, Kinetin trên môi trường MS, tốc độ nhân nhanh tốt nhất khi bổ sung BA. Theo kết quả nghiên cứu của Kang và cs. (1994), BA là chất điều tiết sinh trưởng thích hợp nhất cho sự nhân nhanh chồi từ mẫu lá của cây dâu Fragaria x ananassa. Loại dâu này sẽ cho số lượng chồi cao, hiệu quả nhất trên môi trường MS có bổ sung 4,0M BA kết hợp với 0,1M NAA. Tác động kết hợp giữa BA và auxin sẽ làm tăng số lượng chồi (Uppadhaya và Chandra, 1983). Hu và Wang (1983) cho rằng nồng độ cytokinin cao sẽ làm giảm số lượng chồi sinh sản, nhưng khi sử dụng nồng độ BA cao sẽ cho chất lượng chồi không tốt, chồi hình thành dạng hoa thị hoặc những nốt nhỏ ở cuối gốc. Trong nuôi cấy rễ in vitro,sự có mặt của cytokinin trên môi trường thường hạn chế khả năng ra rễ. Cây sẽ hình thành rễ trong môi trường có bổ sung auxin hoặc không cần bổ sung thêm auxin phụ thuộc vào kiểu gen của cây trồng (Rout và cs., 2000). 1.1.4.5. Nguồn cacbon và những cơ chất khác Nguồn cacbon được sử dụng trong môi trường thường từ 2-3 % đường saccaro hoặc glucose (nhưng rất ít). Những nguồn cacbon khác có thể là lactose, maltose, galactose nhưng rất ít sử dụng. Nguồn cacbon này đóng vai trò trong sự phát triển tế bào. Hầu hết các cây trồng có thể tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển nhưng với những vitamin đặc trưng như vitamin B1), vitamin B3, vitamin B6 và myo- inositol cần được bổ sung vào môi trường trong nuôi cấy in vitro để nâng cao sự sinh trưởng và sự phân hóa (Gamborg và cs., 1968). Agar được sử dụng rộng rãi trên các môi trường đặc và bán đặc, nhưng một vài egllin agent khác có thể sử dụng như gelatin, agrose, aglinate và gebrite. 12 Than hoạt tính được bổ sung vào môi trường ở các giai đoạn khác nhau của quá trình nuôi cấy in vitro. Than hoạt tính không phải là chất điều tiết sinh trưởng, nó đóng vai trò như là chất hút ẩm của môi trường. Than hoạt tính có khả năng hấp thụ một số chất không có lợi cho sự phát triển của cây như các chất được sản sinh ra trong quá trình khử trùng môi trường nuôi cấy hoặc một số chất do cây trồng tiết ra. Đôi lúc than hoạt tính cũng đóng vai trò như chất điều tiết sinh trưởng (Ebert và cs., 1993; Eymar và cs., 2000; George và Sherrington, 1984). Bổ sung thêm than hoạt tính vào môi trường có thể có lợi cho việc hình thành rễ của cây do than hoạt tính có tác dụng hạn chế mức độ chiếu sáng hoặc than hoạt tính có khả năng hấp thụ các chất ức chế sự ra rễ có trong môi trường nuôi cấy. (Dumas và cs.,1995; George và Sherrington, 1984). 1.1.4.6. Nhân nhanh chồi Đây là giai đoạn cốt lõi quyết định đến sự thành công trong nuôi cấy in vitro. Có 3 cách thường được sử dụng trong vi nhân giống : thông qua callus, sự hình thành chồi bất định và chồi nách (Bhojwani và cs., 1996). Trong trường thông qua nuôi cấy chối nách, tốc độ nhân nhanh phụ thuộc vào nồng độ cytokinin thích hợp trên môi trường và sự cấy chuyển trong quá trình tái sinh cây. Trên cây dâu tây Fragaria x ananasa, tốc độ nhân nhanh chồi đạt kết quả tốt nhất khi bổ sung vào môi trường MS các chất điều tiết sinh trưởng BAP (4,0M) và NAA (0,1M) sau 60 ngày nuôi cấy. Nhưng khi bổ sung vào môi trường nồng độ BA cao hơn 4,0M cùng với 0,1M NAA sẽ làm cho chồi sinh trưởng không tốt và chất lượng chồi xấu, do đó tốc độ nhân nhanh cũng giảm. 1.1.4.7. Sự hình thành rễ Sự hình thành rễ của nhiều loài cây có thể không cần bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng (Saxena và cs., 1998). Rễ của nhiều loài cây có thể được hình thành dễ dàng khi nồng độ các muối khoáng giảm đi một nữa hoặc giảm hơn, và nồng độ đường giảm từ 2 hoặc 3% đến 0.5%. (Webb và Street, 1977). Theo Indra D. Bhatt và Uppeandra Dhar khi nghiên cứu ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA) lên sự hình thành rễ của loài Fragaria x ananasa, cây ra rễ tốt nhất khi sử dụng NAA với liều lượng thấp 13 (0.1mg/l). Rễ của một số loài cây có thể được hình thành dễ dàng hơn khi bổ sung thêm than hoạt tính vào môi trường, đôi khi có bổ sung thêm auxin. Than hoạt tínhlàm nâng cao sự phát triển của rễ khi rễ đầu tiên vừa được hình thành (Marthur và cs., 1999). Sự phát triển của rễ tốt hơn khi trong môi trường có chất hút các chất ức chế ra rễ hoặc làm giảm mức độ chiếu sáng bằng cách bổ sung than hoạt tính (Druart và cs., 1993; George và Sherrington, 1984). Sự phát triển sung mãn của hệ rễ của cây con trong nuôi cấy in vitro là điều kiện thiết yếu cho sự phát triển tốt của cây con trong điều kiện nhà kính và trên đồng ruộng. 1.2. Sơ lược về lịch sử nghiên cứu, đặc điểm chung và phân loại về họ cúc 1.2.1. Tình hình sản xuất hoa cúc 1.2.1.1. Trên thế giới Trong ngành sản xuất hoa toàn cầu, hoa cúc là loài quan trọng thứ hai sau hoa hồng. Cúc còn được xem như là một trong những loài hoa trang trí được ưa chuộng nhất trên toàn thế giới. Ở Nhật Bản, hoa cúc là quốc hoa từ năm 910 (L.Naeve, và D. Nelson, 2005), nên ngành sản xuất hoa cúc đã mang về lợi nhuận tăng hơn hai lần, chỉ trong vài thập niên gần đây, nhờ áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật, cũng như do nhu cầu thưởng thức cuộc sống của người dân tăng nhanh. Hoa cúc ở Nhật Bản chiếm đến 35% tổng sản phẩm hoa cắt cành trong nước (Boase và cs, 1997). Trên thế giới, hàng năm, Nhật Bản cũng là quốc gia sản xuất hoa cúc nhiều nhất, với 2 tỉ cành, tiếp theo là Hà Lan với 800 triệu; Colombia 600 triệu; Italia: 500 triệu; Hoa Kì:300 triệu (Boase và cs, 1997). Ở nước Anh, hoa cúc là loại hoa cắt cành quan trọng đứng thứ hai trên thị trường (Flowers and Plants Association, 2001). Tại Nhật Bản, hoa cúc cắt cành được sử dụng khá phổ biến: 40% được dùng làm quà tặng; 25% được dùng để trang trí tại các khách sạn hay trong các lễ hội; 25% được dùng để trang trí trong gia đình và cúng theo đạo Phật; và 10% phục vụ trong việc giảng dạy nghiên cứu (Jaime, 2003). 14 Cải cúc (C.coronarium L.) được trồng rất phổ biến ở Nhật Bản, Trung Quốc và vùng Đông Nam Á, như một loại rau ăn hàng ngày khá phổ biến (Oka và cs., 1999). Một số loài cúc khác có chứa một hàm lượng tinh dầu đáng kể, nên một số loài được trồng để khai thác tinh dầu (Schwinn và cs., 1994). 1.2.1.2. Tại Việt Nam Ở nước ta, có nhiều loài cây dại thuộc họ cúc mọc ở nhiều nơi. Một số loài được dùng làm thuốc trong y học cổ truyền, ví dụ như bồ công anh (Lactuca laciniata L.). Hoa cúc làm cảnh được đưa vào trồng ở nước ta vào khoảng từ thế kỉ XV đến đầu thế kỉ XVI. Lúc đó chủ yếu dùng làm cảnh. Mãi đến sau này, cúc mới được trồng như một loại cây thương mại. Ở nước ta, Hà Nội và Lâm Đồng là nơi có diện tích trồng hoa cúc nhiều nhất cà nước (N.Q. Trạch và Đ.V.Đông, 2002). 1.2.1.3. Tại Lâm Đồng Hầu hết diện tích trồng hoa cúc ở Lâm Đồng tập trung ở thành phố Đà Lạt, ở các huyện Đơn Dương, Đức Trọng, Lạc Dương, diện tích không đáng kể. Mặc dù được trồng từ khá lâu, nhưng hoa cúc trở thành một sản phẩm thương mại mới từ năm 1995. Diện tích trồng hoa cúc ở Đà Lạt đã tăng nhanh trong những năm gần đây. Diện tích trồng hoa cúc chiếm đến 40-50% diện tích trồng hoa nói chung. Trong việc trồng hoa cúc, bà con nông dân đã áp dụng nhiều biện pháp kĩ thuật, như dùng hệ thống đèn chiếu sáng, hệ thống tưới phun sương, nhà kính. Đa số hoa cúc ở Đà Lạt được trồng với mục đích cắt cành. Mỗi năm, Đà Lạt cung cấp cho thị trường từ 10- 15 triệu cành. Tại Đà Lạt, hiện có khoảng 70 giống, được du nhập chủ yếu ở Hà Lan, theo nhiều con đường khác nhau: chính thức và không chính thức. Do đó, việc xác định tên thương phẩm và chủng loại cho từng chủng loại cúc là rất khó khăn. 1.2.2. Đặc điểm sinh học họ cúc (Asteraceae hay Compositae) 1.2.2.1. Nguồn gốc và vị trí phân loại Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978, họ cúc thuộc: 15 - Giới thực vật - Ngành Magnoliophyta (Angiospermae) - Ngọc Lan (hạt kín) - Lớp Magnoliopsida (Dicotyledonea) - Ngọc Lan (hai lá mầm) - Bộ Asterales (cúc). Bộ cúc có một họ duy nhất là họ cúc (Asteraceae hay Compositae) được xem là họ lớn nhất của ngành hạt kín và giới thực vật nói chung. Bao gồm gần 1.000 chi và hơn 20.000 loài, có những chi có tới 1.000 loài. Họ cúc phân bố trên khắp nơi trên Trái Đất, sống được trong nhiều điều kiện khí hậu, môi trường, đất đai khác nhau. Dạng sống chủ yếu là thân thảo, cây bụi, hiếm khi thân gỗ, nhưng thân gỗ thấp bé. (Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978; H.T.Sản và P.N.Hồng, 1986). Trong họ cúc được chia thành hai phân họ: hoa ống (Asteroideae = Tubiliflorae) và thìa lìa (Cichorioideae = Liguliflorae). Phân họ hoa ống có đặc điểm là tất cả hoa trong cụm hoa đầu tiên hình ống (ống phễu, ống sợi, ống hình chuông), hoặc hoa hai môi, hoặc hoa có hoa hình ống ở giữa và hoa thìa lìa giả xung quanh. Trong phân họ hoa ống có gần 740 chi, và rất nhiều loài với các cây quen thuộc như là: ngãi cứu (Artemisia vulgarisL. var.indica Willd.) DC.), thanh hao (Artemisia carvifloria Wall.), nhọ nồi (Eclipta prostrata L.) thược dược (Dahila pinnata Cav.). Trong đó, chi Chrysanthemum được trồng phổ biến như một loài hoa trồng chậu hay hoa cắt cành. Hoa cúc là một loài hoa cắt cành phổ biến trên toàn thế giới, nó đa dạng về các thứ và có hàng ngàn kiểu dáng khác nhau (Cockshull, 1985). Ngoài ra một số loài khác trong chi này còn được dùng làm rau ăn, làm thuốc an thần, thuốc chữa bệnh như là: cải cúc (C.coronarium L.), bạch cúc (C. moriforium Ramatj, kim cúc (C. indicum L.). Phân họ thìa lìa có đặc điểm là tất cả hoa trong cụm đầu tiên là hoa thìa lìa. Phân họ này có ít loài hơn. Một số loài rất quen thuộc như là rau diếp, rau xà lách (Lactuca sativaL.), rau diếp xoăn (Cichorium endivia L.), bồ công anh (Lactuca laciniata L.) (Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978). 16 1.2.2.2. Đặc điểm thực vật học Theo Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, 1978; H.T.Sản và P.N.Hồng, 1986; N.Q. Trạch và Đ.V.Đông, 2002 thì cúc có các đặc điểm sau: Rễ - Cúc có hệ rễ chùm, mọc cạn, theo chiều ngang, đâm sâu khoảng 10-20 cm. rễ cúc có kích thước khá đều nhau, với số lượng rễ lớn, nên khả năng hút nước và chất dinh dướng rất mạnh. Do cúc được nhân giống bằng phương pháp vô tính, nên rễ mọc ngang từ các mấu thân ở gần mặt đất. Thân - Thân hoa cúc là thân thảo nhỏ, nhiều đốt, mọng nước, giòn, dễ gãy. Trên thân non một số loài có phủ một lớp lông tơ. Một số loài có dạng thân bò. Chiều cao thân tuỳ loài. Nhưng đa số các giống nhập có thân to, thẳng, giòn. Còn các giống nội địa có thân nhỏ, mảnh, cong. Lá - Lá cúc thuộc loại lá đơn, không có lá kèm, mọc so le. Bản lá có xẻ thuỳ hình lông chim. Phiến lá mỏng, mặt dưới có phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn. Gân lá hình mạng. Mỗi cây có khoảng 30 - 50 lá. Hoa, quả - Hoa cúc về cơ bản là hoa lưỡng tính. Hoa cúc có nhiều màu sắc khác nhau, thích nghi với thụ phấn nhờ sâu bọ. Hoa nhỏ, sít nhau và luôn luôn tập hợp thành cụm hoa đầu, để một sâu bọ thụ phấn được cho nhiều hoa cùng một lúc. Đế hoa lồi lên. Hoa ở giữa là hoa hình ống, hoa ở ngoài là hoa thìa lìa giả. Ở cúc, quả là quả bế. Chỉ có một hạt mầm nằm trong khoang của quả và đôi khi dính với vỏ quả. Vỏ hạt rất mỏng, phôi lớn và thẳng không có nội nhũ. Quả phát tán nhờ gió và động vật. 17 Hình 1.1 Các dạng hoa cúc (Nguồn:RHS A-Z Encyclopedia of Garden Plants (c) DK Images) 1.2.2.3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển Khí hậu - Đa số hoa cúc thích hợp với điều kiện khí hậu ôn hoà, mát mẻ, lượng mưa đầy đủ, nhất là những hoa được nhập từ vùng ôn đới. Với nhiệt độ trên 250C, cúc sinh trưởng và phát triển kém (L.Naeve, và D. Nelson, 2005). Đất đai - Cúc ít đòi hỏi về điều kiện đất đai. Thích hợp với đất acid nhẹ, pH khoảng5 - 6.5. Nhìn chung, cúc sẽ phát triển tốt trên đất có độ ẩm tốt, thoáng khí, giàu chất hữu cơ, đặc biệt là có phân chuồng. Trước khi trồng, cần làm đất tốt, cày sâu 20- 40 cm để đảm bảo độ thoáng khí và bón lót đầy đủ phân hữu cơ (M.N. Dana và B. R. Lerner, 1996; M.Top và B. Tatura, 2002; L.Naeve, và D. Nelson, 2005). Phân bón - Cúc là cây đòi hỏi một lượng phân bón khá lớn, vì vậy, cần bón 2 lần NPK, với tỷ lệ 10:10:10. Mỗi lần bón khoảng 25 kg/ 100m2. Tốt hơn là bón lót 18 trong giai đoạn chuẩn bị đất một lượng phân hữu cơ (M.N. Dana và B.R.Lerner, 1996; M.Top và B. Tatura, 2002). Cần chú ý không bón phân để cây bước vào giai đoạn ra hoa (L.Naeve, và D. Nelson, 2005). Nước tưới - Cúc chỉ có thể sống sót trong thời gian khô hạn ngắn, nếu khô hạn kéo dài sẽ ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây. Vì vậy, tưới nước rất quan trọng đối với cúc, nhất là trong mùa khô (L.Naeve, và D. Nelson, 2005). Cần tưới một cách đều đặn và kỹ lưỡng, đảm bảo nước phải thấm sâu xuống đất ít nhất 12-15cm. Cần chú ý tránh làm tổn thương cây do những tia nước mạnh quá. Những tổn thương này là nguyên nhân để các virus xâm nhập, các vi khuẩn và nấm phát triển (M.N. Dana và B. R. Lerner, 1996). Sâu bệnh hại - Một số côn trùng gây hại trên cúc thường xuyên là rệp muội, sâu vẽ bùa, nhện...Các bệnh thường gặp là: đốm lá, thối thân rễ, mốc sương...(M.N. Dana và B. R. Lerner, 1996; L.Naeve, và D. Nelson, 2005). Trong trường hợp sâu hại không nhiều lắm thì không cần thiết phải sử dụng thuốc hoá học. Nên áp dụng biện pháp phòng ngừa tổng hợp, bằng thiên địch, bằng bẫy côn trùng. (M.N. Dana và B. R. Lerner, 1996) 19 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu Đặc thù của đề tài là nghiên cứu xây dựng quỹ gen invitro một số giống hoa cúc phổ biến tại Đà Lạt, riêng giống cúc nhập vào Đà lạt đã có hơn 70 giống. Chính vì vậy, để phục vụ nghiên cứu tôi chỉ thực hiện trên 10 mẫu giống cúc được trồng phổ biến tại Đà Lạt. 2.2.2. Hóa chất nghiên cứu  Hóa chất xử lý và khử trùng mẫu Các hóa chất khử trùng chính được sử dụng là HgCl2 0,1%; NaOCl 10%.  Hoá chất sử dụng trong nuôi cấy mô Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung đường saccarose, agar và các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau như 2,4D; BAP, KI, NAA, than hoạt tính (THT) tuỳ thuộc vào mục đích nuôi cấy. Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường MS Thành phần Nồng độ (mg/l) CaCl2.2H2O 440 KH2PO4 170 Muối khoáng đa lượng KNO3 1900 MgSO4.7H2O 370 NH4NO3 1650 MnSO4.4H2O 22.3 ZnSO4.7H2O 8.6 H3BO3 6.2 KI 0.83 Muối khoáng vi lượng N2MoO4.2H2O 0.25 FeSO4.7H2O 27.8 Na2EDTA 37.3 20 Cu SO4.5H2O 0.025 CoCI2.6H2O 0.025 Glyxin 2 Myo-inositol 100 Vitamin và các thành phần hữu cơ Acid nicotinic (Niaxin) 0.5 Thiamin HCl (vitamin Bi) 0.1 Pyridoxine HCl (vitamim B6) 0.5 2.2.3. Thiết bị nghiên cứu Các thiết bị chủ yếu của nghiên cứu: - Máy cất nước 1 lần. - Tủ sấy 60-6000C. - Nồi hấp môi trường (Autoclave). - Laminar. - Quạt thông gió. - Bộ dụng cụ cấy gồm dụng cụ cấy và bộ khử trùng. - Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có chỗ chiếu sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux. Ở đây ta sử dụng đèn compact 18W có hệ thống cài thời gian tự động, tận dụng tối đa ánh sáng tự nhiên bằng các cửa kính. - Máy đo pH. - Cân phân tích 10-4g - Cân kỹ thuật 10-2g - Bếp điện 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vô trùng mô nuôi cây Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các hóa chất có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận thực vật có nhiều bụi đất, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng dưới dòng nước chảy. Khi xử lý xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (3-5 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần 21 phải cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản MS (Murahige & Skoog, 1962 với 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose và pH = 5.8). Các thí nghiệm nhân nhanh, tạo cây hoàn chỉnh mẫu được nuôi cấy trong bình thủy tinh hoặc bì kiếng chịu nhiệt. Tất cả các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh độ pH bằng 5.8 trước khi tiệt trùng và được khử trùng ở 1210C, 1,5 atm, trong thời gian 20 phút. Mẫu được nuôi cấy ở nhiệt độ 20 - 22 0C, ẩm độ 70%, cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày. Các công thức thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, chia làm 3 lần nhắc lại. 2.2.3. Phương pháp phân tích số liệu Số liệu thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê trên phần mềm Microsoft Excel. 2.3 Nội dung nghiên cứu  Nội dung 1: Điều tra, thu thập mẫu giống nghiên cứu. 10 mẫu giống cúc được trồng phổ biến tại Đà Lạt sẽ được thu thập để phục vụ cho việc nghiên cứu. Đồng thời điều tra đặc tính hình thái, tính chống chịu của mẫu giống thu thập.  Nội dung 2: Nghiên cứu tạo nguồn mẫu vô trùng cho nuôi cấy invitro. Vô trùng là một trong những điều kiện bắt buộc của quá trình nuôi cấy in vitro, là yếu tố quyết định tới thành công của thí nghiệm. Vì vậy, trước khi nuôi cấy in vitro thì mẫu cấy phải được khử trùng sạch nấm và vi khuẩn bằng hóa chất. Các hóa chất sát trùng thường được sử dụng là HgCl2 0,1%; NaOCl 10%. 22  Nội dung 3: Nghiên cứu môi trường nuôi cấy, tái sinh invitro mẫu giống nghiên cứu. Các mẫu đã khử trùng có khả năng sống được chuyển sang môi trường tạo callus. Môi trường tạo callus là môi trường MS có bổ sung các chất sinh trưởng khác nhau như 2,4D; BAP, NAA. Sau 4 tuần nuôi cấy đánh giá kết quả thu được. Các callus hình thành được sử dụng để nuôi cấy trên các môi trường khác nhau để thăm dò khả năng tái sinh. Các chồi tái sinh trên callus cần được nhân nhanh để tạo số lượng lớn cần thiết để có thể đánh giá được ở các giai đoạn tiếp theo. Vì vậy cần phải khảo sát môi trường nhân nhanh tốt nhất với chồi hoa cúc. Theo các nghiên cứu trước đây cho thấy BAP là chất có khả năng cảm ứng tạo sinh chồi rất tốt đối với cây hoa cúc, chính vì vậy BAP được sử dụng trong thí nghiệm này để đánh giá khả năng nhân nhanh của các chồi cúc tái sinh. Các chồi trên môi trường nhân nhanh được đưa vào nuôi cấy trên môi trường tạo rễ để có thể tạo được cây hoàn chỉnh trước khi cho ra vườn ươm.  Nội dung 4: Nghiên cứu môi trường lưu giữ quỹ gen invitro mẫu giống nghiên cứu. Nguồn gen invitro mẫu giống hoa cúc có thể được lưu giữ invitro bằng phương thức sinh trưởng chậm để kéo dài khoản thời gian cấy chuyền giữ mẫu. Ở giai đoạn này, việc nghiên cứu môi trường lưu giữ invitro bằng phương thức sinh trưởng chậm là cần thiết.  Nội dung 5: Thiết lập quy trình xây dựng, cấy chuyền lưu giữ và sử dụng quỹ gen invitro mẫu giống nghiên cứu đã xây dựng. Dựa vào kết quả thu được của những nội dung nghiên cứu trên, ta tiến hành thiết lập một quy trình xây dựng, lưu giữ và sử dụng quỹ gen invitro mẫu giống đã nghiên cứu. 23 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Thu thập và lựa chọn mẫu giống cúc 10 mẫu giống cúc được trồng phổ biến ở Đà Lạt đã được thu thập để phục vụ cho nghiên cứu. Đặc điểm chính của các giống cúc đã thu thập được trình bày ở bảng dưới đây. Bảng 3.1 Một số đặc điểm của các giống cúc được thu thập Stt Giống Mã hóa Đặc điểm hình thái Nguồn gốc giống Thời gian từ trồng tới ra hoa (ngày) Chiều cao TB (cm) Chống chịu bệnh 1 Đại đóa Vàng C01 Thân cao, cong, mảnh; thân màu xanh; lá mỏng to; hoa màu vàng cam, cánh dài xếp lỏng. Hà Nội 85 - 135 75 - 80 +++ 2 Đại đóa Trắng C02 Thân cao, cong, mảnh; thân màu xanh; lá mỏng, màu tím nhạt, cánh dài cong xếp lỏng. to; hoa. Hà Nội 93 - 136 72 - 80 +++ 3 Thạch bích C03 Hoa màu đỏ tím, Cánh kép, cánh phiến, đầu cánh tưa, thuộc nhóm cúc đông; lá xẻ thùy nhiều. Đài Loan 90 - 135 75 - 80 ++ 24 4 Art C04 Thân cao, mập thẳng; lá dày to; hoa màu vàng nghệ, cánh dày xếp chặt. Đài Loan 105 - 157 77- 85 +++ 5 Farm tím C05 Cây cao trung bình, thân màu xanh; lá to trung bình; bông chùm, màu tím, cánh dày xếp chặt. Hà Lan 95 - 112 65 - 75 ++ 6 Farm vàng C06 Cây cao trung bình, thân màu xanh; lá to trung bình; bông chùm, màu vàng, cánh dày xếp chặt. Hà Lan 101 - 147 75 - 80 +++ 7 Farm trắng C07 Cây cao trung bình, thân màu xanh; lá to trung bình; bông chùm, màu trắng, cánh dày xếp chặt. Hà Lan 92 - 120 62 - 70 + 8 Pha lê vàng C08 Thân thấp, mập trung bình, cứng cây, xanh; lá dày, to vừa, xẻ thùy sâu, xanh đậm; bông chùm, vàng pha lê, cánh đều, xếp chặt. Đài Loan 90 - 135 60 - 65 +++ 25 9 Mai đỏ C09 Cây cao trung bình, thân màu xanh; lá to; bông chùm, màu trắng đỏ. Singapore 90 - 111 62 - 68 + 10 Pha lê trắng C10 Thân thấp, mập trung bình, cứng cây, xanh; lá dày, to vừa, xẻ thùy sâu, xanh đậm; bông chùm, trắng pha lê, cánh đều, xếp chặt. Singap