Đề tài Tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá Nuclear Inclusion Body protein (NIb) của một số dòng virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ

MỞ ĐẦU Đu đủ (Carica papaya L.) là cây ăn quả có giá trị kinh tế cao, quả đu đủ rất giàu dinh dưỡng. Ngoài ra, nhựa đu đủ còn là nguồn nguyên liệu để tách papain, một loại enzym đã được thương mại hoá sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và thuộc da. Ở Việt Nam, diện tích trồng đu đủ khoảng 2500 ha, với sản lượng hàng năm khoảng 100 nghìn tấn, có giá trị tương đương 4,5 triệu USD [6,34]. Đu đủ là cây trồng nhiệt đới và cận nhiệt đới mắc rất nhiều bệnh, trong đó bệnh đốm vòng do papaya ringspot virus (PRSV) gây ra là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng suất và chất lượng quả đu đủ. Bệnh được truyền do các loài rệp cây nên lan rộng rất nhanh chóng. Đến nay, toàn bộ diện tích trồng đu đủ ở nước ta cũng như các vùng khác trên thế giới như Australia [39], Thái Lan [46]. Hawaii [37,45]… đều bị nhiễm bệnh virus đốm vòng. Những biện pháp truyền thống sử dụng để ngăn cản sự lan truyền của PRSV chỉ mang tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh này, hơn nữa lại đòi hỏi nhiều thời gian và công sức. Gần đây, với việc áp dụng những kỹ thuật tiên tiến của sinh học phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng, đặc biệt là sử dụng các vật liệu di truyền từ các virus gây bệnh chuyển vào cây để tạo ra các cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus đã thu được các kết quả đáng khích lệ, như đu đủ chuyển gen CP (coat protein) kháng PRSV đã được thương mại hoá trên thế giới [25], cây khoai tây chuyển gen NIb kháng PVY (potato virus Y) [18]... Một trong những thách thức vẫn còn tồn tại là phổ kháng bệnh của những cây chuyển gen này phụ thuộc vào độ tương đồng về mặt di truyền của chủng virus có gen được sử dụng để tạo cây chuyển gen và các dòng virus gây bệnh trong tự nhiên. Chẳng hạn các giống đu đủ chuyển gen CP của Hawaii hoàn toàn không có khả năng kháng lại các dòng PRSV của Việt Nam. Vì vậy, việc khảo sát tính đa dạng di truyền của gen chuyển có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus. Nghiên cứu về đánh giá tính đa dạng của các dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ của Việt Nam, Chu Hoàng Hà và cộng sự (2004) cho biết 16 dòng PRSV phân lập từ các khu vực khác nhau của Việt Nam có mức độ giống nhau về trình tự gen CP từ 89,7% đến 99,8%. Trong đó 4 dòng virus Tuyên Quang, Kon Tum, Sài Gòn và Cần Thơ có tính đại diện cao nhất [4]. Trên cơ sở đó, 4 chủng PRSV trên đã được lựa chọn cho nghiên cứu “Tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá Nuclear Inclusion Body protein (NIb) của một số dòng virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya Ringspot virus-PRSV) ở Việt Nam” nhằm tìm hiểu sự đa dạng ở mức độ phân tử ở gen NIb của các dòng virus này và tạo nguyên liệu cho nghiên cứu tạo cây đu đủ chuyển gen kháng PRSV ở Việt Nam. Ch­¬ng 1. Tæng quan tµi liÖu 1.1. Giíi thiÖu chung vÒ c©y ®u ®ñ 1.1.1. Ph©n lo¹i C©y ®u ®ñ (Carica papaya L.) thuéc ngµnh Méc lan (h¹t kÝn, Magnoliophyta), líp Méc lan (hai l¸ mÇm, Magnoliopsida), ph©n líp Sæ (Dilleniidae), liªn bé Hoa tÝm (Violananae), bé Hoa tÝm (Violales), hä §u ®ñ (Caricaceae) [11]. Carica là chi lín nhÊt trong hä víi 23 loµi. 1.1.2. Nguån gèc MÆc dï cã ý kiÕn cho r»ng nguån gèc cña C. papaya ë ch©u Mü nhiÖt ®íi [32], nh­ng nã cã thÓ b¾t nguån tõ vïng ®Êt thÊp thuéc phÝa ®«ng cña Trung Mü, tõ Mexico tíi Panama [38]. H¹t cña nã ®­îc ph¸t t¸n tíi Carribean vµ §«ng Nam ¸ nhê nh÷ng ng­êi th¸m hiÓm T©y Ban Nha vµo thÕ kû 16, tõ ®ã nã ®­îc lan ®i nhanh chãng tíi Ên §é, Th¸i B×nh D­¬ng vµ ch©u Phi [44]. §u ®ñ ®· ®­îc trång ë ViÖt Nam c¸ch ®©y vµi tr¨m n¨m vµ hiÖn nay ®ang ®­îc trång phæ biÕn trong c¸c v­ên c©y tõ B¾c chÝ Nam [10]. Theo c¸c nhµ khoa häc, nh÷ng gièng ®u ®ñ ®Çu tiªn nhËp vµo n­íc ta b»ng h¹t v× h¹t ®u ®ñ võa nhiÒu, võa nhá, l¹i cã thÓ b¶o qu¶n l©u. B¾t ®Çu tõ khi nh÷ng cha cè ng­êi Ph¸p, T©y Ban Nha kho¶ng thÕ kû 17, råi sau nµy c¸c chuyªn gia n«ng nghiÖp Ph¸p, Mü vµ nhiÒu quèc tÞch kh¸c, kh«ng ai biÕt bao nhiªu gièng ®u ®ñ ®· vµo ViÖt Nam. §u ®ñ l¹i lµ gièng c©y ¨n qu¶ ng¾n ngµy thô phÊn ngo¹i hoa, nhiÒu biÕn dÞ. NhiÒu gièng ®· h×nh thµnh tõ ®Þa ph­¬ng víi c¸c tªn gäi kh«ng thèng nhÊt [10]. 1.1.3. Gi¸ trÞ sö dông Tr­íc hÕt ®u ®ñ lµ mét lo¹i thùc phÈm th«ng dông giµu dinh d­ìng. Qu¶ chÝn lµ mét mãn ¨n bæ d­ìng cã vÞ th¬m ngon, chøa nhiÒu vitamin vµ muèi kho¸ng (B¶ng 1). Qu¶ ®u ®ñ cã thÓ dïng lµm r­îu, møt ®­êng, sÊy kh« vµ s¾c ®­êng kÝnh [44]. Qu¶ xanh, l¸ vµ hoa cã thÓ ®­îc sö dông nh­ mét lo¹i rau ¨n vµ chÕ biÕn mét sè mãn ¨n truyÒn thèng (nh­ hÇm thÞt v× trong qu¶ vµ l¸ xanh cã chøa nhiÒu enzym cã t¸c dông gièng nh­ pepsin cña d¹ dµy, nhÊt lµ gièng trypsin cña tôy trong viÖc tiªu ho¸ chÊt thÞt, hay nÊu ch¸o cïng th«ng th¶o, ý dÜ vµ mãng dß cho c¸c phô n÷ ®ang cho con bó, hay chÕ biÕn mãn bón ch¶ Hµ Néi rÊt næi tiÕng…). H¬n n÷a, ®u ®ñ cßn ®­îc sö dông trong c«ng nghiÖp. L¸ vµ qu¶ xanh cã chøa mét sè protein vµ alkaloid øng dông quan träng trong c«ng nghiÖp vµ d­îc phÈm. Trong ®ã papain lµ enzym thuû ph©n quan träng nhÊt ®­îc s¶n xuÊt tõ nhùa cña qu¶ non, xanh vµ ®· ®­îc th­¬ng m¹i ho¸, sö dông trong c«ng nghiÖp ®å uèng, thøc ¨n, vµ d­îc phÈm, bao gåm c¸c s¶n phÈm keo dÝnh, chØ thÞ bia l¹nh, lµm mÒm thÞt, thuèc ch÷a bÖnh tiªu ho¸ vµ chøng ho¹i th­. Papain cßn ®­îc sö dông trong c«ng nghiÖp dÖt ®Ó kÐo t¬, lµm mÒm len vµ trong c«ng nghiÖp mü phÈm, xµ phßng, dÇu géi ®Çu [39,44]. B¶ng 1. Thµnh phÇn dinh d­ìng cña qu¶ ®u ®ñ chÝn (trªn 100g) [43] STT  Thµnh phÇn  100g qu¶ chÝn   1  N¨ng l­îng  35 – 59 cal   2  N­íc  88,40 – 90,70 g   3  Protein  1,00 – 1,50 g   4  ChÊt bÐo  0,10 g   5  Carbonhydrat  7,10 – 13,50 g   6  Canxi  11 – 31 mg   7  Photpho  7 – 17 mg   8  S¾t  0,60 – 0,70 mg   9  Natri  2 – 3 mg   10  Kali  39 – 337 mg   11  Caroten  1,16 – 2,43 mg   12  Vitamin B1  0,03 – 0,08 mg   13  Vitamin B2  0,70 – 0,15 mg   14  Vitamin B5  0,10 mg   15  Vitamin C  69,30 – 71,00 mg   §Æc biÖt ®u ®ñ cßn cã t¸c dông nh­ mét vÞ thuèc. Papain cã tÝnh chÊt lµm dÔ tiªu ho¸ vµ gi¶i ®éc. Nã lµm triÖt tiªu progesteron, mét hormon sö dông cÇn thiÕt chuÈn bÞ cho tö cung thô thai vµ duy tr× sù sèng cho bµo thai sau ®ã. H¹t ®u ®ñ chøa myrosin vµ kali myronat khi kÕt hîp víi nhau t¹o thµnh tinh dÇu mïi diªm sinh h¾c. Qu¶ xanh chØ ®­îc chØ ®Þnh dïng trong chøng thiÓu n¨ng tiªu ho¸, d¹ dµy vµ tôy, trong sù gi¶m dÞch vÞ hay sù lªn men d¹ dµy, trong viªm d¹ dµy m·n tÝnh, lªn men ruét vµ viªm d¹ dµy ruét non cña trÎ em. H¹t th­êng dïng lµm thuèc trÞ giun. RÔ dïng trÞ sèt rÐt vµ lµm thuèc lîi tiÓu. L¸ dïng tiªu môn nhät, l¸ nÊu n­íc dïng tÈy s¹ch vÕt m¸u ë v¶i vµ röa vÕt loÐt, vÕt th­¬ng, s¸t trïng. Nhùa b«i mÆt n¹ bÞ tµn nhang vµ c¸c vÕt nh¬ kh¸c ë da, h¾c lµo míi ph¸t, c¸c lo¹i lë sÇn da ngoan cè. Hoa ®ùc dïng trÞ ho gµ [2]. Nh­ vËy ®u ®ñ rÊt cã Ých cho con ng­êi, cã thÓ sö dông ë tÊt c¶ c¸c phÇn, tõ hoa, qu¶, l¸, rÔ cho ®Õn nhùa c©y. 1.1.4. N¨ng suÊt, chÊt l­îng S¶n l­îng qu¶ ®u ®ñ chÝn ë n­íc ta ­íc tÝnh ®¹t 100.000 tÊn/n¨m. Mçi kil«gam qu¶ chÝn trÞ gi¸ kho¶ng 2500® ®Õn 3500® th× tæng gi¸ trÞ ®¹t tõ 250 - 350 tØ ®ång (kho¶ng 15 -20 triÖu ®«la Mü) [34]. Tæng s¶n l­îng qu¶ ®u ®ñ t­¬i trªn thÕ giíi n¨m 1995 ­íc tÝnh ®¹t 5 triÖu tÊn, ®¹t gi¸ trÞ kho¶ng 1,5 ®Õn 2 tØ ®«la Mü [34]. B¶ng 2. S¶n l­îng qu¶ ®u ®ñ hµng n¨m cña mét sè n­íc [12] N­íc s¶n xuÊt  Tæng s¶n l­îng c¸c n¨m ( x1000 tÊn)    1989-1991  1995  1996  1997   ThÕ giíi  3625  5091  5011  5024   + ch©u Phi  786  780  786  780   + B¾c Mü  404  591  599  599   + Nam Mü  1263  2029  2090  2105   + ch©u ¸  1156  1610  1518  1520   - Indonexia  342  597  500  500   - Ên §é  399  490  500  500   - Trung Quèc  94  142  143  143   - Th¸i Lan  100  120  115  115   - ViÖt Nam  54  57  58  61   1.1.5. Ph©n bè B¶ng 3. Vïng ph©n bè tËp trung cña c©y ®u ®ñ ë ViÖt Nam STT  Vïng ph©n bè  DiÖn tÝch (ha)   1  Vïng nói vµ Trung du phÝa B¾c (S¬n La, L¹ng S¬n)  500   2  §ång b»ng s«ng Hång (Hµ Néi, H­ng Yªn, Nam Hµ, Ninh B×nh)  250   3  Ven biÓn miÒn Trung (NghÖ An, Thanh Ho¸)  100   4  §ång b»ng s«ng Mª K«ng (Ninh ThuËn, Nha Trang, T©y Ninh, TiÒn Giang)  500-550   §u ®ñ ®­îc trång ë tÊt c¶ c¸c n­íc nhiÖt ®íi vµ nhiÒu vïng cËn nhiÖt ®íi trªn thÕ giíi [39]. ë n­íc ta ®u ®ñ ®­îc trång trong v­ên nhµ (tõ 5 ®Õn 10 c©y) cña gÇn 50% hé n«ng d©n. §u ®ñ còng ®­îc trång tËp trung trong c¸c n«ng tr­êng hoÆc trang tr¹i vïng ®ång b»ng s«ng Hång, ven biÓn miÒn Trung, ®ång b»ng s«ng Mª K«ng vµ s­ên nói ®¸ v«i. Tæng diÖn tÝch vµo kho¶ng 2500 ha gåm kho¶ng 1250 ha trång tËp trung (B¶ng 3) vµ 1250 ha trång trong v­ên nhµ [34]. 1.1.6. BÖnh ë c©y ®u ®ñ - BÖnh ®èm vßng: Cßn gäi lµ bÖnh ®èm h×nh nhÉn lµ mét bÖnh rÊt phæ biÕn trªn c©y ®u ®ñ ë n­íc ta vµ nhiÒu n­íc kh¸c trªn thÕ giíi, ®­îc coi lµ mét trë ng¹i lín nhÊt cho nghÒ trång ®u ®ñ. Cã thÓ nãi ë ®©u cã trång ®u ®ñ lµ ë ®ã cã bÖnh nµy. BÖnh do papaya ringspot virus g©y ra. §Æc ®iÓm chÝnh cña bÖnh lµ lµm lïn c©y, s¶n l­îng qu¶ bÞ gi¶m, l¸ bÞ kh¶m vµ biÕn d¹ng, t¹o ®èm cã d¹ng nh­ mét c¸i vßng mµu xanh mê trªn qu¶, cuèng l¸ hay t¹o c¸c säc xanh trªn ngän th©n vµ cuèng l¸. ë qu¶ khi chÝn, c¸c vßng lé râ cã mµu vµng, qu¶ bÞ nh¹t, do virut ®· lµm gi¶m l­îng ®­êng trong qu¶. ë mÆt trªn cña c¸c l¸ gÇn ®Ønh sinh tr­ëng, vïng m« l¸ ë gi÷a g©n phô vµ g©n nh¸nh bÞ nh¨n phång. B×a l¸ non bÞ cuèn vßng vµo theo mÆt d­íi l¸. B×a l¸ giµ th× cuèn lªn [5]. - BÖnh kh¶m: do papaya mosaic virus g©y ra. Gièng nh­ bÖnh ®èm vßng, bÖnh kh¶m còng lµ mét bÖnh rÊt phæ biÕn trªn c©y ®u ®ñ. C©y bÖnh cã l¸ bÞ kh¶m gåm nhiÒu vÕt xanh vµng lÉn lén, kh¶m cµng nÆng, l¸ cµng biÕn sang mµu vµng. L¸ bÖnh bÞ nhá l¹i, biÕn d¹ng, sè thuú l¸ gia t¨ng, nh¨n phång. L¸ bÞ rông nhiÒu, chØ trõ l¹i chïm l¸ bÞ kh¶m vµng ë ngän. Qu¶ nhá biÕn d¹ng, chai s­îng [5]. - BÖnh thèi gèc: do nÊm Pythium spp g©y ra, lµm cho l¸ vµng vµ qu¶ bÞ rông, gèc th©n n¬i tiÕp gi¸p mÆt ®Êt bÞ óng råi thèi, c©y sÏ bÞ ®æ vµ chÕt. - BÖnh ch¸y l¸: do nÊm Helminthosporium g©y ra, lµm chãp l¸ bÞ ®èm óng n­íc, råi lan dÇn vµo bªn trong l¸, lµm l¸ bÞ n©u vµ kh«. NÕu nhiÔm nÆng, cuèng l¸ bÞ hÐo, mÒm vµ l¸ bÞ rông [5]. - BÖnh ®èm l¸: do nÊm Phyllosticta sulata g©y ra. Trªn l¸ ®èm bÖnh cã h×nh trßn, h×nh trøng hoÆc thon dµi hay bÊt d¹ng. Vïng gi÷a vÕt bÖnh cã mµu b¹c tr¾ng, viÒn cã mµu vµng hay n©u, vïng bÖnh kh« vµ máng dÇn råi bÞ t¸ch [5]. - BÖnh phÊn tr¾ng: do nÊm Odium caricae g©y h¹i. L¸ bÖnh bÞ ®ãng phÊn mµu tr¾ng ë mÆt d­íi, nÕu nÆng l¸ sÏ ph¸t triÓn kÐm, biÕn d¹ng Ýt. Qu¶ còng bÞ c¸c ®èm phÊn tr¾ng trßn hoÆc bÇu dôc vµ ph¸t triÓn kÐm. - BÖnh thèi qu¶: do nhiÒu lo¹i nÊm (Rhizopus, Colletotrichum, Ascochyta, Botryodiplodia, Phomopsis, Macrophoma, Fusarium, Alternaria) g©y c¸c triÖu chøng kh¸c nhau [5]. - BÖnh do tuyÕn trïng (Meloidogyne incognita vµ Rotylenchulus reniformis): ph¸ h¹i rÔ. C©y con nhiÔm nÆng cã thÓ bÞ chÕt vµ c©y lín cã thÓ gi¶m søc t¨ng tr­ëng, cã thÓ dïng c¸c thuèc trÞ tuyÕn trïng nh­ Mocap t­íi xung quanh vïng rÔ [5]. 1.2. Giíi thiÖu vÒ virut g©y bÖnh ®èm vßng ë ®u ®ñ (PRSV) 1.2.1. Ph©n lo¹i PRSV lµ virut thùc vËt, thuéc chi potyvirus, hä potyviridae [29]. PRSV ®­îc chia thµnh hai chñng dùa trªn kh¶ n¨ng l©y nhiÔm cña chóng lµ: PRSV-w vµ PRSV-p. PRSV-p lµ virut phæ biÕn vµ g©y thiÖt h¹i lín nhÊt tíi ®u ®ñ vµ bÇu bÝ kh¾p thÕ giíi, cßn PRSV-w chØ ¶nh h­ëng tíi hä bÇu bÝ, nh­ng trªn thùc tÕ kh«ng t×m thÊy PRSV-P trªn c©y bÇu bÝ, mµ chØ t×m thÊy qua c¸c thÝ nghiÖm [18]. PRSV ®­îc t×m thÊy lÇn ®Çu tiªn vµo n¨m 1949 khi ph©n lËp virut tõ ®u ®ñ Hawaii vµ sau ®ã ®­îc t×m thÊy ë nhiÒu n­íc kh¸c trªn thÕ giíi [30]. Hai chñng nµy cã quan hÖ rÊt gÇn gòi víi nhau, cã thÓ PRSV-p tiÕn ho¸ tõ PRSV-w do ®ét biÕn [16]. 1.2.2. CÊu tróc PRSV kh«ng cã vá bäc, nucleocapsid cã d¹ng h×nh sîi, xo¾n, víi chiÒu dµi trän vÑn 760-800nm, ®­êng kÝnh 12nm (H×nh 2). Virion chøa 5,5% axit nucleic lµ mét sîi ARN ®¬n d­¬ng liªn kÕt víi protein (VPg) ë ®Çu 5’ vµ cã ®u«i poly(A) ®Çu 3’ [19,29]. HÖ gen cña PRSV dµi kho¶ng 10326 nucleotit, ngo¹i trõ ®Çu poly(A), vµ chøa mét khung ®äc më lín b¾t ®Çu tõ vÞ trÝ nucleotit 86-88 vµ kÕt thóc ë vÞ trÝ 10118-10120, m· ho¸ cho mét polyprotein víi 3344 axit amin [24]. Polyprotein nµy ®­îc tù thuû ph©n t¹o 12 protein trong ®ã cã protein NIb, lµ enzym polymerase cÇn thiÕt cho sù t¸i b¶n cña ARN virut. Tr×nh tù b¶o thñ cao AAAUAAAANANCUCAACACAUA ë ®Çu 5’ cña PRSV còng ®ãng vai trß quan träng cho sù t¸i b¶n cña potyvirus. Tæ chøc gen cña PRSV ®­îc ®­a ra t¹m thêi lµ VPg-5’ leader-63K NT-52K HC-Pro-46K-72K CI-6K-48K NIa-59K NIb-35K coat protein- kh«ng m· hãa 3’- vïng poly(A) (H×nh 3) [48]. H×nh 3. B¶n ®å tæ chøc genom cña PRSV 1.2.3. §Æc tÝnh g©y bÖnh PRSV g©y bÖnh kh«ng truyÒn qua h¹t gièng, chóng l©y b»ng hai c¸ch: Mét lµ do tiÕp xóc c¬ giíi (th«ng qua c¸c vÕt th­¬ng c¬ giíi do trong qu¸ tr×nh canh t¸c con ng­êi v« ý t¹o ra, do m­a giã g©y x©y s¸t hay do c«n trïng hay ®éng vËt kh¸c). Hai lµ do c«n trïng m«i giíi chñ yÕu lµ c¸c loµi rÖp thuéc hä Aphididae nh­ Aphis gosipii, Aphis crasivora, ®Æc biÖt loµi rÖp Myzus persicae, loµi rÖp nµy còng th­êng g©y h¹i nhiÒu cho c¸c lo¹i rau c¶i, bÇu bÝ, m­íp, d­a... BÖnh l©y lan rÊt nhanh, nhÊt lµ nh÷ng c©y ®­îc 5-6 th¸ng tuæi trë lªn [13]. 1.3. Gen NIb cña PRSV 1.3.1. CÊu tróc cña gen NIb Gen NIb (nuclear inclusion body) n»m gi÷a gen NIa vµ gen CP, cã kÝch th­íc kho¶ng 1554 bp, n»m tõ vÞ trÝ nucleotit 7646 ®Õn 9199. 1.3.2. Vai trß cña protein NIb Protein NIb lµ ARN polymerase phô thuéc ARN (RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) cña virut, chÞu tr¸ch nhiÖm t¸i b¶n ph©n tö ARN d­¬ng vµ ©m cña virut [20]. Cã mét vµi dÉn chøng thùc nghiÖm trùc tiÕp vÒ protein NIb potyvirus: Thø nhÊt, ®Æc ®iÓm tr×nh tù næi bËt nhÊt cña protein NIb lµ mét motif glycine-aspartate-aspartate (GDD) ®Æc tr­ng cho phÇn lín virut ARN ë vi khuÈn, ®éng vËt vµ thùc vËt [32]. Khi so s¸nh tr×nh tù RdRp cña virut ARN d­¬ng vµ ph©n tÝch sù tiÕn ho¸ cña nã cã thÓ ph©n lo¹i tÊt c¶ c¸c virut thµnh líp, bé, hä vµ chi [32,33,17]. Thø hai, gÇn ®©y ng­êi ta ®· chøng minh ®­îc protein NIb cã ho¹t ®éng RdRp [36]. Hä còng ®· t×m thÊy protein NIb cã t­¬ng t¸c víi c¶ protein NIa vµ CP trong tÕ bµo nÊm men. Protein NIb t­¬ng t¸c víi vïng VPg cña protein NIa vµ t­¬ng t¸c nµy ®ßi hái mét vÞ trÝ g¾n ARN chøc n¨ng. T­¬ng t¸c nµy cã thÓ quan träng cho viÖc kÝch thÝch tæng hîp ARN virut trong c¸c tÕ bµo nhiÔm. Ho¹t ®éng polymerase cña protein NIb cã thÓ ®­îc kÝch thÝch bëi protein NIa vµ VPg. T­¬ng t¸c protein CP víi NIb cã kh¶ n¨ng thay ®æi motif GDD. Vai trß cña t­¬ng t¸c nµy tíi ho¹t ®éng enzym cña protein NIb hoÆc chøc n¨ng cña CP ch­a râ rµng, nh­ng cã thÓ cÇn thiÕt cho viÖc tæng hîp ARN trong tÕ bµo nhiÔm virut [22,27]. Ngoµi chøc n¨ng RdRp, protein NIb cña TEV (tobacco etch virus) cßn cã nh÷ng chøc n¨ng kh¸c, bao gåm nh÷ng ho¹t ®éng dÞch chuyÓn nh©n [35]. NIb chøa hai dÊu hiÖu ®Þnh vÞ nh©n ®éc lËp (NLS I vµ NLS II). NLS I n»m ë vÞ trÝ axit amin 1 tíi 17, vµ NLS II n»m gi÷a axit amin 292 vµ 316. §ét biÕn ®iÓm céng gép dÉn ®Õn thay thÕ nh÷ng gèc c¬ b¶n trong c¸c NLS, lµm mÊt ho¹t ®éng dÞch chuyÓn nh©n. Nh÷ng ®ét biÕn nµy còng lµm mÊt sù khuÕch ®¹i ARN TEV khi ®­îc ®­a vµo genom cña virut. ViÖc mÊt kh¶ n¨ng khuÕch ®¹i lµ do mçi ®ét biÕn NLS ®­îc bæ sung vµo sù dÞch chuyÓn (in trans) c¸c tÕ bµo truyÒn tin biÓu hiÖn protein NIb chøc n¨ng. §iÒu nµy chøng tá c¸c NLS chång líp cÇn thiÕt cho chøc n¨ng dÞch chuyÓn-ho¹t ®éng cña NIb. Thùc tÕ chøc n¨ng in trans cña NIb cã nghÜa lµ nã ph¶i t­¬ng t¸c víi mét hoÆc nhiÒu thµnh phÇn kh¸c cña bé m¸y sao chÐp cña genom. §ét biÕn ®iÓm céng gép ¶nh h­ëng motif GDD hoÆc NLS II trong vïng trung t©m cña protein NIb, nh­ng kh«ng ph¶i ®ét biÕn nµo còng ¶nh h­ëng tíi NLS I gÇn ®Çu N, lµm gi¶m hoÆc mÊt t­¬ng t¸c. Vïng C-terminal proteinase (Pro) cña NIa, chø kh«ng ph¶i vïng N-terminal VPg, t­¬ng t¸c víi NIb. T¸c ®éng cña nh÷ng ®ét biÕn NIb trong vïng NLS I, NLS II, vµ motif GDD tíi t­¬ng t¸c gi÷a NIb vµ Pro-domain gièng víi ¶nh h­ëng cña nh÷ng ®ét biÕn nµy tíi t­¬ng t¸c gi÷a chiÒu dµi ®Çy ®ñ cña NIb vµ NIa [36]. NIb ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh t¸i b¶n phøc t¹p th«ng qua mét t­¬ng t¸c víi Pro-domain cña NIa. RdRp cÇn thiÕt cho sù sao chÐp genom cña virut. RdRp cïng c¸c thµnh phÇn kh¸c cña virut vµ tÕ bµo chñ, t¹o thµnh mét phøc hîp sao chÐp thùc hiÖn qu¸ tr×nh t¸i b¶n genom virut. RdRp ®ãng vai trß quan träng trong giai ®o¹n sím cña sù t¸i b¶n virut vµ lµm t¨ng kh¶ n¨ng øc chÕ cña enzym nµy, ®­îc xem nh­ ch×a kho¸ tæng hîp mét ph©n tö ®Æc biÖt, vÝ dô scFv øc chÕ ho¹t ®éng enzym RdRp. Nãi c¸ch kh¸c, viÖc ng¨n hay øc chÕ ho¹t ®éng RdRp cã thÓ ph¸ vì sù t¸i b¶n cña virut ë giai ®o¹n sím hiÖu qu¶ h¬n [26]. 1.4. C¸c nghiªn cøu t¹o c©y chuyÓn gen kh¸ng virut PRSV lµ mét trong nh÷ng nguyªn nh©n chÝnh g©y thiÖt h¹i lín tíi n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng c©y ®u ®ñ vµ nhiÒu lo¹i c©y trång kh¸c cã gi¸ trÞ ë ViÖt Nam còng nh­ thÕ giíi. V× vËy, trªn thÕ giíi ®· cã rÊt nhiÒu n¬i nghiªn cøu vÒ PRSV. Mét sè gen cña PRSV nh­ gen CP ®· ®­îc nghiªn cøu rÊt kü vµ ®· chuyÓn vµo c©y ®Ó t¹o c©y ®u ®ñ chuyÓn gen. Næi bËt lµ phßng thÝ nghiÖm t¹i tr­êng ®¹i häc Hawaii vµ ®¹i häc Cornell, Mü. Hai n¬i nµy ®· ®i tiªn phong trong viÖc chuyÓn gen CP vµo ®u ®ñ ®Ó kh¸ng bÖnh ®èm vßng vµ ®· më ra mét ph­¬ng ph¸p míi cho viÖc t¹o c¸c gièng c©y trång kh¸ng bÖnh virut. C¸c nhµ khoa häc ë ®©y ®· ®­a gen CP cña dßng virut PRSV HA 5-1 vµo vect¬ pGA482 vµ chuyÓn thµnh c«ng vµo gièng ®u ®ñ "Sunset" b»ng sóng b¾n gen, t¹o ra hai dßng ®u ®ñ mang tªn 55-1 vµ 63-1 cã mang gen CP trong genom vµ ®· kiÓm tra b»ng lai Southern vµ ELISA. KÕt qu¶ thö nghiÖm kh¶ n¨ng kh¸ng bÖnh cña thÕ hÖ R1 tõ dßng 55-1 cho thÊy chóng cã tÝnh kh¸ng bÖnh rÊt cao (chØ cã 5% cña 128 c©y ®­îc thö nhiÔm bÖnh) ®èi víi c¸c dßng virut ph©n lËp ë Hawaii, nh­ng kh«ng kh¸ng ®­îc c¸c dßng ph©n lËp tõ n¬i kh¸c. Dßng 55-1 nµy ®· ®­îc lai víi gièng Kapoho t¹o ra gièng ®u ®ñ "Rainbow" ®· ®­îc ®¨ng ký b¶n quyÒn vµ trë thµnh gièng ®u ®ñ chuyÓn gen th­¬ng m¹i ho¸ ®Çu tiªn trªn thÕ giíi cã kh¶ n¨ng kh¸ng l¹i PRSV [9]. Ngoµi ra, gen NIb cña PRSV còng ®­îc quan t©m nghiªn cøu. §· cã nhiÒu n­íc ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù gen NIb nh­ ë Th¸i Lan, Poonpipit vµ céng sù (2001) ®· ph©n lËp ®­îc gen NIb cña PRSV cã kÝch th­íc 1596bp [40]; ë Trung Quèc, Ye vµ céng sù (2002) ph©n lËp ®­îc gen NIb cña PRSV cã kÝch th­íc 1600bp [47]... Nh­ng hiÖn nay viÖc nghiªn cøu chuyÓn gen NIb vµo c©y ®u ®ñ ®Ó t¹o c©y kh¸ng bÖnh vÉn cßn ®ang ®­îc tiÕp tôc tiÕn hµnh, ch­a cã gièng th­¬ng phÈm nµo ®­îc ®­a ra thÞ tr­êng. Tuy nhiªn, ®· cã nhiÒu c©y trång chuyÓn gen NIb kh¸ng virut g©y bÖnh kh¸c nhau trªn thÕ giíi ®­îc t¹o ra nh­ c©y ®Ëu, c©y thuèc l¸, c©y khoai t©y... N¨m 1998, Jones vµ céng sù ®· t¹o ra ®­îc ba dßng ®Ëu chuyÓn gen NIb kh¸ng PSbMV (pea seed-borne mosaic potyvirus), trong ®ã dßng PSbMV-DPD1 biÓu hiÖn tÝnh kh¸ng cao ngay lÇn nhiÔm ®Çu tiªn. Theo «ng, tÝnh kh¸ng cña c©y ®Ëu phô thuéc vµo mËt ®é cña virut nhiÔm trªn c©y vµ sè b¶n copy cña gen NIb [31]. Khoai t©y còng lµ ®èi t­îng c©y trång ®­îc nghiªn cøu nhiÒu vÒ chuyÓn gen NIb kh¸ng c¸c lo¹i virut kh¸c nhau nh­ PVY (potato virus Y), PLRV (potato leafroll virus)... N¨m 2004, Schubert vµ céng sù ®· t¹o ra ®­îc c©y khoai t©y chuyÓn gen NIb kh¸ng PVY trong nhµ kÝnh [18,21]. ë c©y thuèc l¸, Suzuki vµ céng sù còng ®· chuyÓn gen sao chÐp ARNs 1 vµ 2 cña CMV (cucumber mosaic virus) thµnh c«ng t¹o ra nh÷ng dßng thuèc l¸ V1 vµ V2, sau ®ã ®em lai hai dßng nµy víi nhau t¹o ra dßng V1V2. KÕt qu¶ lµ dßng V1V2 cã tÝnh kh¸ng cao h¬n so víi dßng V1 vµ V2 [41]. 1.5. Mét sè kü thuËt sinh häc ph©n tö øng dông trong nghiªn cøu bÖnh virut 1.5.1. Kü thuËt RT-PCR Kü thuËt RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) lµ sù kÕt hîp cña hai ph¶n øng sao m· ng­îc (reverse transcription) vµ PCR ®Ó nh©n lªn mét ®o¹n gen quan t©m tõ ARN (H×nh 4). Kü thuËt nµy gåm hai giai ®o¹n: Tæng hîp sîi cADN thø nhÊt: Nguyªn lý cña ph­¬ng ph¸p nµy lµ sö dông enzym sao m· ng­îc (reverse transcriptase) ®Ó tæng hîp nªn sîi cADN thø nhÊt tõ ARN. Tïy theo môc ®Ých cña thÝ nghiÖm mµ c¸c lo¹i ARN ®­îc sö dông kh¸c nhau. NÕu muèn nh©n mét ®o¹n gen cña sinh vËt bËc cao mµ kh«ng cã intron th× ng­êi ta th­êng tæng hîp cADN tõ mARN víi måi oligo(dT)s. NÕu lµ sinh vËt bËc thÊp nh­ vi khuÈn, virut... ng­êi ta cã thÓ tæng hîp cADN tõ ARN tæng sè víi måi ngÉu nhiªn hoÆc måi ®Æc hiÖu cho gen cÇn nh©n lªn. Khi måi g¾n bæ sung víi sîi ARN khu«n enzym sao m· ng­îc sÏ xóc t¸c cho qu¸ tr×nh tæng hîp cADN tõ c¸c nucleotit tù do cã trong thµnh phÇn ph¶n øng ë mét nhiÖt ®é thÝch hîp. Ph¶n øng tæng hîp cADN chØ x¶y ra trong mét chu kú, theo lý thuyÕt sau khi kÕt thóc ph¶n øng ta sÏ thu ®­îc l­îng cADN t­¬ng øng víi l­îng ARN khu«n ban ®Çu. §Ó t¨ng hiÖu qu¶ cña qu¸ tr×nh tæng hîp, l­îng måi ®­îc cho vµo lín h¬n rÊt nhiÒu l­îng ARN khu«n vµ chÊt k×m h·m RNase còng ®­îc ®­a vµo ®Ó b¶o vÖ cho ARN khái bÞ c¾t bëi RNase. KhuÕch ®¹i gen b»ng PCR: Sö dông cADN lµm khu«n ®Ó khuÕch ®¹i gen quan t©m b»ng ph¶n øng PCR víi cÆp måi ®Æc hiÖu (Primer-F vµ Primer-R). Nguyªn t¾c cña kü thuËt PCR ®­îc tr×nh bµy ë môc 1.5.2. 1.5.2. Kü thuËt PCR Kü thuËt PCR (Polymerase Chain Reaction – chuçi ph¶n øng trïng hîp) ®­îc Mullis vµ céng sù m« t¶ ®Çu tiªn n¨m 1985. §©y lµ kü thuËt in vitro, t­¬ng ®èi ®¬n gi¶n cho phÐp nh©n nhanh mét sè l­îng kh«ng h¹n chÕ nguyªn b¶n mét ®o¹n ADN nhÊt ®Þnh trong mét kho¶ng thêi gian ng¾n, nhê sù xóc t¸c cña ADN polymerase. TÊt c¶ c¸c ADN polymerase khi ho¹t ®éng tæng hîp mét m¹ch ADN míi tõ m¹ch khu«n ®Òu cÇn sù hiÖn diÖn cña nh÷ng måi ®Æc hiÖu. Måi lµ nh÷ng ®o¹n ADN ng¾n cã kh¶ n¨ng b¾t cÆp bæ sung víi mét ®Çu cña m¹ch khu«n vµ ADN polymerase sÏ nèi dµi måi ®Ó h×nh thµnh m¹ch míi. Qu¸ tr×nh nh©n b¶n b»ng enzym nµy bao gåm 3 b­íc ®­îc lÆp l¹i nhiÒu lÇn: - BiÕn tÝnh ADN tõ d¹ng sîi kÐp thµnh d¹ng sîi ®¬n b»ng c¸ch n©ng cao nhiÖt ®é lªn 94-950C trong kho¶ng thêi gian 30 gi©y ®Õn 1 phót. - G¾n måi (primer) víi ®o¹n ADN cÇn nh©n th«ng qua h¹ nhiÖt ®é xuèng 40-600C, trong kho¶ng thêi gian 30 gi©y ®Õn 1 phót, phô thuéc vµo ®é dµi vµ tØ lÖ G+C cña ®o¹n måi. - Ph¶n øng polymerase tæng hîp ph©n tö ADN kÐo dµi tõ ®o¹n måi. Hai ph©n tö ADN míi ®­îc tæng hîp theo nguyªn t¾c bæ sung tõ hai ®Çu ph©n tö khu«n ban ®Çu. Thêi gian kÐo dµi tõ 30 gi©y ®Õn vµi phót. §Ó tr¸nh hiÖn t­îng b¾t cÆp kh«ng ®Æc thï, ph¶n øng tæng hîp nªn ®­îc thùc hiÖn ë 720C. Lo¹i polymerase dïng trong PCR lµ lo¹i chÞu nhiÖt (Taq polymerase) ®­îc t¸ch chiÕt tõ vi khuÈn Thermus aquaticus, mét lo¹i vi khuÈn ®­îc ph©n lËp tõ suèi n­íc nãng. HiÖn nay, enzym nµy chñ yÕu ®­îc s¶n xuÊt theo con ®­êng t¸i tæ hîp. Nh­ vËy, sau mçi chu kú ph¶n øng l­îng ADN cÇn nh©n b¶n sÏ t¨ng gÊp ®«i, víi N sîi khu«n ban ®Çu sau n chu kú sÏ cã Nx2n sîi ADN ®­îc nh©n lªn. VÝ dô, sau kho¶ng 20 chu kú cã tíi trªn 30 triÖu b¶n ®­îc nh©n lªn tõ mét sîi khu«n ban ®Çu [1,3]. 1.5.3. Kü thuËt biÕn n¹p plasmit vµo E. coli BiÕn n¹p theo nghÜa réng lµ: ®­a bÊt kú ADN nµo vµo bÊt kú tÕ bµo nµo. Trong tr­êng hîp c¸c tÕ bµo E. coli th× biÕn n¹p cã nghÜa lµ ®­a ADN plasmit vµo trong tÕ bµo. LÇn ®Çu tiªn biÕn n¹p ë vi khuÈn ®­îc Frederick Griffith m« t¶ vµo n¨m 1928 trong thÝ nghiÖm næi tiÕng cña «ng vÒ c¸i gäi lµ “nguyªn lý biÕn n¹p”. Trªn thùc tÕ, ph¸t minh nµy vÒ sau ®· chøng minh r»ng c¸c gen ®­îc cÊu thµnh tõ ADN. Tuy nhiªn, kh«ng ph¶i tÊt c¶ c¸c vi khuÈn ®Òu cã thÓ ®­îc biÕn n¹p mét c¸ch dÔ dµng. §Ó cho biÕn n¹p ë E. coli cã hiÖu qu¶, c¸c tÕ bµo cÇn trë nªn kh¶ biÕn (competent). §Ó ®¹t ®­îc ®iÒu nµy, ng­êi ta ng©m c¸c tÕ bµo trong dung dÞch CaCl2 l¹nh trong ®¸, khi ®ã c¸c tÕ bµo trë nªn kh¶ biÕn theo mét c¸ch mµ cho ®Õn nay vÉn ch­a râ nguyªn nh©n. ViÖc biÕn n¹p c¸c tÕ bµo kh¶ biÕn ®­îc thùc hiÖn b»ng c¸ch trén ADN plasmit víi c¸c tÕ bµo, råi ñ trong ®¸ 20-30 phót, sau ®ã t¹o mét sèc nhiÖt ng¾n (kho¶ng 1 phót ë 420C), lµm nh­ vËy ADN sÏ chui vµo tÕ bµo. Sau khi biÕn n¹p, vi khuÈn ®­îc nu«i phôc håi trong m«i tr­êng LB ë 370C trong vßng 60 ®Õn 90 phót. Sau ®ã, c¸c tÕ bµo ®­îc ®­a lªn m«i tr­êng chän läc ®Ó nh©n lªn c¸c tÕ bµo cã plasmit. Trong qu¸ tr×nh biÕn n¹p, chØ cã mét phÇn rÊt nhá c¸c tÕ bµo kh¶ biÕn ®­îc biÕn n¹p. MÆc dï cã nh­îc ®iÓm rÊt lín nµy, biÕn n¹p vÉn lµ mét kü thuËt quan träng, nã cã thÓ t¹o ra tíi 109 c¸c tÕ bµo biÕn n¹p (tøc c¸c thÓ biÕn n¹p) khi ®­a 1 microgam ADN vµo thÝ nghiÖm. Th­êng trªn thùc tÕ víi 1 microgam ADN ng­êi ta t¹o ra ®­îc 106 ®Õn 107 tÕ bµo biÕn n¹p [8]. 1.5.4. Kü thuËt t¸ch dßng T¸ch dßng gen lµ mét c«ng cô h÷u hiÖu ®­îc sö dông trong kü thuËt di truyÒn vµ lµ b­íc khëi nguån cho c¸c kü thuËt sau nµy [7]. Môc ®Ých cña viÖc t¸ch dßng lµ nh»m thu ®­îc mét l­îng lín b¶n sao cña tr×nh tù gen quan t©m. §Çu tiªn, ADN ngo¹i lai ®­îc nèi vµo mét vect¬ nh»m t¹o ra ADN t¸i tæ hîp. Vect¬ sö dông lµ plasmit thÝch øng cña vi khuÈn E. coli. Sau ®ã vect¬ t¸i tæ hîp ®­îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo chñ vµ tÕ bµo chñ ®­îc nu«i cÊy trong m«i tr­êng thÝch hîp ®Ó nh©n vi khuÈn lªn nhiÒu lÇn. TÕ bµo chñ ë ®©y lµ vi khuÈn E. coli. Cuèi cïng qua