Đề tài Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng

MỞ ĐẦU Mức độ gia tăng dân số nhanh chóng đã đẩy toàn nhân loại phải đối mặt với thách thức lớn lao, đó là khắc phục sự đói nghèo. Vấn đề làm sao để tăng sản lượng nông nghiệp, cung cấp lương thực ổn định cho con người luôn là mối quan tâm đặc biệt của nhiều quốc gia trên thế giới. Tình hình lương thực bấp bênh còn khá phổ biến ở nhiều nơi. Bên cạnh những nguyên nhân chính như nông nghiệp chưa được coi trọng đúng mức, đất đai chưa được sử dụng hợp lý, thì sâu bệnh, đặc biệt là côn trùng, là một trong những tác nhân gây thiệt hại chủ yếu cho mùa màng. Theo thống kê của Dean & Adang [65], Oerke & đtg [154], những tổn thất mùa màng nghiêm trọng trên toàn cầu do sâu bệnh gây ra ước tính chiếm từ 35 đến 42% tổng sản lượng nông nghiệp hàng năm, trong đó thiệt hại do côn trùng chiếm từ 13-16%. Mức độ thiệt hại có khi lên tới 70% nếu như cây trồng không được áp dụng các biện pháp bảo vệ. Hiện nay, rất nhiều loại thuốc trừ sâu hoá học đang được sử dụng để phòng trừ sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây độc hại cho sức khoẻ con người, vật nuôi. Để cải thiện tình hình này, chúng ta cần ứng dụng những kỹ thuật tiên tiến trong bảo vệ cây trồng nhằm xây dựng một nền nông nghiệp sạch, bền vững. Việc tạo ra các giống cây trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified Crops, GMOs) có khả năng kháng sâu bệnh và côn trùng nói riêng nhờ kỹ thuật tạo dòng phân tử, kỹ thuật chuyển gen thực vật được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng và đem lại lợi ích tối đa cho nền nông nghiệp. Hơn nữa, các tiến bộ đạt được còn khắc phục được những hạn chế khi sử dụng các biện pháp trừ sâu hoá học cũng như các biện pháp sinh học truyền thống, nâng mức độ an toàn cho con người, vật nuôi và cải thiện môi trường sinh thái. Bằng các kỹ thuật di truyền mới này, triển vọng tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính mong muốn trong thời gian tương đối ngắn đã trở thành hiện thực. Đến nay hàng loạt gen mã hoá protein có hoạt tính diệt côn trùng gây hại (gen kháng côn trùng) như gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hoá các chất ức chế proteaza và ỏ-amylaza… được chuyển vào thực vật nhờ các phương pháp thích hợp với sản phẩm là những cây trồng có khả năng tự kháng sâu bệnh. Trên thế giới, khá nhiều phương pháp chuyển gen thực vật đã được nghiên cứu và áp dụng thành công, như phương pháp vi tiêm, sử dụng súng bắn gen, xung điện. Trong đó, phương pháp có giá trị thực tiễn cao và được sử dụng rộng rãi nhất là phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens. Với ưu điểm như ít tốn kém, dễ áp dụng trên các đối tượng cây trồng nên phương pháp này rất phù hợp với điều kiện của các nước đang phát triển như Việt Nam [1]. Nhiều nơi trên thế giới, kỹ thuật chuyển và biểu hiện gen kháng côn trùng nói riêng và gen có lợi nói chung vào cây trồng thông qua phương pháp này đã và đang là công cụ hỗ trợ chính trong chọn giống thực vật. Ở nước ta, nghiên cứu chuyển gen thực vật mới chỉ bắt đầu, chủ yếu tại các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Sinh học và Viện Sinh học Nhiệt đới (thuộc Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia), Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng sông Cửu Long (thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn). Hầu hết các nghiên cứu sử dụng gen chỉ thị và một số gen khác trên các vectơ plasmit được thiết kế sẵn. Tuy nhiên, phần lớn các vectơ tái tổ hợp và các kết cấu gen được các nhà sáng chế và công ty/ cơ quan đăng ký sở hữu trí tuệ dưới dạng các sáng chế hoặc các giải pháp hữu ích. Về khía cạnh sở hữu trí tuệ, để được quyền sử dụng mỗi thành phần trong vectơ tái tổ hợp, thông thường người nhận phải liên lạc với các nhà sáng chế, cơ quan hoặc công ty sở hữu để ký các hợp đồng chuyển giao nguyên liệu (Material Transfer Agreement, MTA). Qua các hợp đồng này, chúng ta thường chỉ được sử dụng nguyên liệu cho mục đích nghiên cứu với rất nhiều ràng buộc về khía cạnh xuất bản, sản phẩm nghiên cứu, sở hữu, chuyển giao... Rõ ràng, để có được những vectơ mang gen tái tổ hợp có giá trị do nước ngoài thiết kế, bên cạnh những chi phí lớn, còn có nhiều khó khăn phức tạp trong chuyển giao nguyên liệu và công nghệ. Do vậy, một yêu cầu cấp bách đặt ra là chúng ta phải tự thiết kế được các vectơ chuyển gen thực vật nói chung và vectơ mang đoạn khởi động đặc hiệu để điều khiển biểu hiện gen kháng côn trùng nhằm mục đích chuyển và biểu hiện các gen này trong các đối tượng cây trồng ở nước ta. Trên cơ sở ý nghĩa lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng”, với các mục đích và nội dung nghiên cứu chính sau đây: Môc ®Ých nghiªn cøu Sö dông c¸c kü thuËt sinh häc ph©n tö vµ c«ng nghÖ gen ®Ó nghiªn cøu c¸c ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt vµ gen cã ho¹t tÝnh kh¸ng c«n trïng. Trªn c¬ së ®ã, thiÕt kÕ c¸c vect¬ Ti-plasmit vµ t¹o chñng A. tumefaciens phôc vô c«ng nghÖ chuyÓn gen nh»m môc ®Ých n©ng cao tÝnh kh¸ng s©u bÖnh cña c©y trång. Néi dung nghiªn cøu S­u tËp vµ ph©n lËp c¸c ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt vµ gen cã ho¹t tÝnh kh¸ng c«n trïng. ThiÕt kÕ c¸c vect¬ Ti-plasmit mang gen kh¸ng c«n trïng d­íi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng c¬ ®Þnh hoÆc ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt trong tÕ bµo E. coli. T¹o c¸c chñng A. tumefaciens mang c¸c vect¬ Ti-plasmit chøa gen kh¸ng c«n trïng ®Ó chuyÓn vµo c©y trång. ThiÕt kÕ vect¬ vµ biÓu hiÖn gen kh¸ng c«n trïng trong tÕ bµo E. coli. T¹o kh¸ng thÓ kh¸ng protein cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng phôc vô cho nghiªn cøu vµ gi¸m ®Þnh c©y chuyÓn gen. Nh÷ng ®ãng gãp míi cña luËn ¸n B¶n luËn ¸n nµy cã nh÷ng ®ãng gãp míi vÒ khoa häc vµ thùc tiÔn nh­ sau: §· nh©n, t¹o dßng vµ ®äc tr×nh tù ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza (sucrose synthase) ë gièng lóa C71 cã kh¶ n¨ng ®iÒu khiÓn sù biÓu hiÖn gen ®Æc hiÖu ë bã m¹ch. §©y lµ ®o¹n khëi ®éng gen ®Çu tiªn ®­îc ph©n lËp vµ ®äc tr×nh tù tõ mét gièng lóa ViÖt Nam. Tr×nh tù cña ®o¹n khëi ®éng nµy ®· ®­îc ®¨ng ký trong c¸c Ng©n hµng tr×nh tù gen quèc tÕ. §· t¹o ®­îc mét kÕt cÊu gen míi ®ã lµ gen cryIA(c) d­íi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu bã m¹ch C71S-P nh»m môc ®Ých chuyÓn vµo c¸c gièng lóa ViÖt Nam t¹o kh¶ n¨ng kh¸ng s©u ®ôc th©n lóa. §· thiÕt kÕ thµnh c«ng 4 vect¬ Ti-plasmit míi, cung cÊp nguyªn liÖu cho c¸c nghiªn cøu chuyÓn gen vµo c©y trång vµ nghiªn cøu ®o¹n khëi ®éng. Trong ®ã, gen cryIA(c) d­íi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng Ubiquitin hoÆc ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë gièng lóa C71 ®· ®­îc ®­a vµo vect¬ Ti-plasmit c¶i tiÕn vµ vect¬ chuyÓn gen thÕ hÖ míi nhÊt sö dông hÖ thèng chän läc tÝch cùc (Positive Selection System). §· hoµn thiÖn vµ sö dông ph­¬ng ph¸p xung ®iÖn vµ ph­¬ng ph¸p phèi ba bè mÑ ®Ó t¹o 4 chñng A. tumefaciens míi, trªn c¬ së c¸c chñng LBA4404 vµ EHA105, mang c¸c vect¬ Ti-plasmit chøa gen kh¸ng c«n trïng ®Ó chuyÓn vµo c©y trång. LÇn ®Çu tiªn trong ®iÒu kiÖn ViÖt Nam ®· thµnh c«ng trong viÖc biÓu hiÖn gen cryIA(c) tæng hîp ho¸ häc b»ng vi khuÈn E. coli. Protein CryIA(c) t¸i tæ hîp sau khi tinh chÕ ®· ®­îc dïng ®Ó s¶n xuÊt kh¸ng thÓ kh¸ng CryIA(c) nh»m môc ®Ých sö dông lµm c«ng cô kiÓm tra sù cã mÆt cña s¶n phÈm gen cryIA(c) ë c¸c c©y trång ®­îc chuyÓn gen. C¸c vect¬ Ti-plasmit míi ®· vµ ®ang ®­îc ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc chuyÓn vµo lóa vµ c¸c lo¹i c©y trång quan träng kh¸c. Ngoµi ra, 2 chñng A. tumefaciens míi còng ®· ®­îc chuyÓn giao cho ViÖn Nghiªn cøu Ng« (thuéc Bé N«ng nghiÖp vµ Ph¸t triÓn N«ng th«n) nh»m triÓn khai c¸c nghiªn cøu hîp t¸c chuyÓn gen cry vµo c©y ng« ViÖt Nam. Ch­¬ng 1. Tæng quan tµi liÖu 1.1 Vi khuÈn ®Êt A. tumefaciens vµ ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen vµo c©y trång 1.1.1 A. tumefaciens vµ hiÖn t­îng biÕn n¹p gen thùc vËt trong tù nhiªn Nh÷ng n¨m ®Çu thÕ kû 20, Smith vµ Townsend ®· ph¸t hiÖn ë mét sè c©y hai l¸ mÇm xuÊt hiÖn nh÷ng khèi u vµ t¸c nh©n g©y bÖnh chÝnh lµ vi khuÈn ®Êt A. tumefaciens. §Õn cuèi nh÷ng n¨m 1960, mèi quan hÖ gi÷a khèi u vµ vËt liÖu di truyÒn cña loµi vi khuÈn nµy ®· ®­îc Braun vµ Schilperoort kh¸m ph¸. A. tumefaciens cã kh¶ n¨ng x©m nhiÔm thùc vËt, kÝch thÝch t¹o khèi u ngay t¹i c¸c vÕt th­¬ng cña c©y chñ. Trong tù nhiªn, A. tumefaciens chñ yÕu tÊn c«ng c©y hai l¸ mÇm, ®Æc biÖt lµ nhãm thùc vËt cã hoa. Mét vµi loµi c©y mét l¸ mÇm thuéc hä hµnh tái vµ thuû tiªn mÉn c¶m yÕu víi A. tumefaciens [34]. Hoµn toµn kh¸c víi m« vµ tÕ bµo thùc vËt b×nh th­êng, khèi u do A. tumefaciens sinh ra ph¸t triÓn rÊt m¹nh ngay trong ®iÒu kiÖn thiÕu hoocmon sinh tr­ëng (auxin vµ cytokinin). Së dÜ nh­ vËy v× A. tumefaciens ®· chuyÓn mét ®o¹n ADN (Transfer DNA - T-ADN) sang tÕ bµo thùc vËt vµ T-ADN ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh sinh tæng hîp c¸c hîp chÊt ®ã. Ngoµi ra, c¸c khèi u còng sinh tæng hîp opin lµ c¸c axit amin (amino acid - aa) ®Æc biÖt vµ c¸c dÉn xuÊt cña ®­êng. D¹ng opin ®­îc tæng hîp cã thÓ lµ nopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin vµ agropin phô thuéc vµo tõng chñng Agrobacterium. Trong ®ã, octopin vµ nopalin lµ hai d¹ng opin phæ biÕn. Opin ®­îc vi khuÈn sö dông thay cho nguån cacbon vµ nit¬ nhê ho¹t ®éng cña gen chuyÓn ho¸ opin trªn plasmit g©y khèi u thùc vËt (Tumour inducing plasmid - Ti-plasmit) [44], [109]. C¬ chÕ ph©n tö cña sù h×nh thµnh khèi u ®· ®­îc quan t©m nghiªn cøu nh»m t×m ra ph­¬ng thøc phßng trõ bÖnh cho c©y. Tuy nhiªn, khi ph¸t hiÖn ra Ti-plasmit vµ kh¶ n¨ng tù chuyÓn T-ADN vµo genom thùc vËt, ng­êi ta ®· ®Æc biÖt chó ý vµ khai th¸c kh¶ n¨ng sö dông chóng nh­ mét vect¬ tù nhiªn ®Ó chuyÓn c¸c gen quan t©m vµo thùc vËt nh»m t¹o c©y trång mang nh÷ng tÝnh tr¹ng mong muèn [34], [37], [54]. 1.1.1.1 CÊu tróc vµ chøc n¨ng cña Ti-plasmit Zaenen & ®tg, §¹i häc Ghent (BØ) lµ nhãm t¸c gi¶ ®Çu tiªn ph¸t hiÖn A. tumefaciens mang mét cÊu tróc di truyÒn ngoµi nhiÔm s¾c thÓ chøa hÇu hÕt c¸c gen liªn quan ®Õn sù h×nh thµnh khèi u. Tuy nhiªn, hä nghÜ r»ng ®ã lµ b¶n sao cña mét lo¹i virut x©m nhiÔm vi khuÈn. Thùc tÕ, yÕu tè di truyÒn nµy chÝnh lµ mét plasmit khæng lå víi kÝch th­íc kho¶ng 200 kb. C¸c chñng vi khuÈn cã quan hÖ gÇn gòi, nh­ vi khuÈn t¹o nèt sÇn ë rÔ (Rhizobium trifolii) vµ ë l¸ (Phyllobacterium myrsinacearum) còng cã kh¶ n¨ng h×nh thµnh khèi u ë thùc vËt khi bÞ nhiÔm Ti-plasmit. §iÒu ®ã kh¼ng ®Þnh vai trß quan träng cña yÕu tè l©y nhiÔm n»m trªn Ti-plasmit ®èi víi sù h×nh thµnh khèi u ë c©y chñ [54]. Ti-plasmit (h×nh 1.1) ®­îc t×m thÊy ë tÊt c¶ c¸c chñng A. tumefaciens g©y nhiÔm vµ tån t¹i bÒn v÷ng ë nhiÖt ®é d­íi 300C. §©y lµ mét ph©n tö ADN m¹ch vßng, sîi kÐp vµ tån t¹i trong tÕ bµo nh­ mét ®¬n vÞ sao chÐp ®éc lËp. Ph©n tÝch di truyÒn cho thÊy, Ti-plasmit d¹ng octopin vµ d¹ng nopalin lµ hai d¹ng phæ biÕn nhÊt, ®Òu cã 4 vïng t­¬ng ®ång, trong ®ã vïng T-ADN vµ vïng g©y ®éc (Virulence Region - vïng VIR), liªn quan trùc tiÕp tíi sù h×nh thµnh khèi u ë thùc vËt. Hai vïng cßn l¹i chøa gen m· ho¸ cho viÖc sao chÐp plasmit (Origin of replication) vµ chuyÓn n¹p (Conjugative transfer) [34]. Trªn Ti-plasmit, chØ cã vïng T-ADN ®­îc chuyÓn tõ vi khuÈn sang genom cña c©y bÞ bÖnh vµ tån t¹i bÒn v÷ng ë ®ã [87]. Tuy nhiªn, vïng nµy l¹i kh«ng m· ho¸ nh÷ng s¶n phÈm lµm trung gian cho qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN mµ cÇn cã sù trî gióp ®Æc biÖt cña c¸c gen g©y khèi u n»m trªn vïng VIR vµ trªn nhiÔm s¾c thÓ vi khuÈn (chv genes). Vïng VIR dµi kho¶ng 40 kb ®¶m nhËn chøc n¨ng g©y nhiÔm. ë Ti-plasmit d¹ng octopin, vïng VIR chøa tíi 24 gen g©y ®éc. S¶n phÈm protein do c¸c gen nµy m· ho¸ ®· kÝch thÝch sù t¸ch biÖt T-ADN, bao bäc che chë vµ gióp chóng tiÕp cËn víi genom cña c©y chñ. Ngoµi c¸c gen vir, c¸c gen trªn nhiÔm s¾c thÓ cña A. tumefaciens (nh­ chvA vµ chvB) còng ®ãng vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh x©m nhËp cña A. tumefaciens vµo thµnh tÕ bµo thùc vËt [34], [109]. H×nh 1.1. B¶n ®å Ti-plasmit d¹ng octopin 1.1.1.2 CÊu tróc vµ chøc n¨ng cña ®o¹n T-ADN Trong genom cña c©y bÞ khèi u, sè l­îng b¶n sao cña T-ADN dao ®éng tõ mét vµi ®Õn h¬n 10. Chóng cã thÓ n»m trªn cïng mét locut hoÆc t¸ch rêi vµ g¾n víi c¸c vïng kh¸c nhau trªn genom thùc vËt mét c¸ch ngÉu nhiªn. ë cµ chua, 7 ®o¹n T-ADN ®· g¾n vµo 5 nhiÔm s¾c thÓ thùc vËt, trong khi ë Crepis capillaris, T-ADN chØ ®­îc t×m thÊy trªn 3 nhiÔm s¾c thÓ [109]. KÕt qu¶ ph©n tÝch tr×nh tù gen trªn T-ADN ë c¸c Ti-plasmit kh¸c nhau cho thÊy, T-ADN ®­îc giíi h¹n bëi mét ®o¹n tr×nh tù lÆp l¹i gÇn nh­ hoµn toµn tõ kho¶ng 25 bp vµ gäi lµ ®o¹n biªn. Chóng lµ dÊu hiÖu nhËn biÕt cho qu¸ tr×nh chuyÓn vµ x©m nhËp cña T-ADN vµo tÕ bµo thùc vËt. ë ®o¹n biªn ph¶i (Right Border - RB) cã yÕu tè ®iÒu khiÓn cis cÇn cho qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN. §o¹n biªn tr¸i (Left Border - LB) gi¸n tiÕp tham gia vµo qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN vµ lµ dÊu hiÖu ®Ó qu¸ tr×nh nµy kÕt thóc b×nh th­êng [147], [152]. ë Ti-plasmit d¹ng nopalin, T-ADN x©m nhËp vµo genom thùc vËt ë d¹ng mét ®o¹n liªn tôc dµi 22 kb. Trong khi, ë Ti-plasmit d¹ng octopin, ®o¹n T-ADN nµy chØ dµi 13 kb. ë mét sè m« thùc vËt, khèi u l¹i chøa mét ®o¹n ADN kÝch th­íc 8 kb [208]. T-ADN mang rÊt nhiÒu gen nh­: (1) C¸c gen m· ho¸ nh÷ng enzym cÇn thiÕt cho qu¸ tr×nh sinh tæng hîp opin; (2) C¸c gen g©y khèi u nh­ tms1, tms2, tmr m· ho¸ cho c¸c enzym liªn quan ®Õn qu¸ tr×nh sinh tæng hîp auxin vµ cytokinin [34], [109]. 1.1.1.3 Qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN vµo tÕ bµo thùc vËt C¸c tÕ bµo c©y bÞ tæn th­¬ng sÏ tiÕt ra c¸c hîp chÊt dÉn dô ho¸ häc vi khuÈn nh­ acetosyringon, α-hydroxy-acetosyringon. D­íi t¸c dông cña c¸c hîp chÊt nµy, A. tumefaciens nhËn biÕt råi b¸m vµo thµnh tÕ bµo chñ vµ chuyÓn T-ADN vµo tÕ bµo thùc vËt. Qu¸ tr×nh nµy ®­îc sù trî gióp ®Æc biÖt cña c¸c gen vir vµ ®o¹n biªn ph¶i, tr¸i [32], [34]. Còng chÝnh c¸c hîp chÊt nµy, víi vai trß c¶m øng, gióp cho c¸c gen vïng VIR ho¹t ®éng vµ t¨ng c­êng biÓu hiÖn. Khi vi khuÈn x©m nhiÔm tÕ bµo thùc vËt qua vÕt th­¬ng, s¶n phÈm gen virA sÏ nhËn biÕt sù cã mÆt vµ t­¬ng t¸c víi c¸c ph©n tö acetosyringon råi truyÒn th«ng tin ngo¹i bµo nµy vµo trong tÕ bµo dÉn ®Õn sù ho¹t ®éng cña c¸c protein VirG. TiÕp theo, VirG l¹i kÝch ho¹t c¸c gen g©y ®éc kh¸c nh­ virB, virC, virD vµ virE còng nh­ t¨ng c­êng møc ®é phiªn m· cña virG [34], [44], [144]. Sau ®ã, virD hç trî qu¸ tr×nh t¸ch T-ADN thµnh hai sîi ®¬n. Mét sîi sÏ chuyÓn sang tÕ bµo thùc vËt víi ®Çu 5' ®i tr­íc. Sîi ®¬n cßn l¹i sÏ lµm khu«n ®Ó tæng hîp nªn sîi ADN bæ sung míi. Trong qu¸ tr×nh di chuyÓn, sîi ADN ®¬n ®­îc g¾n víi protein VirE ®Ó chui qua rÊt nhiÒu mµng tr­íc khi vµo ®­îc ®Õn nh©n tÕ bµo thùc vËt. Protein VirB n»m trªn mµng tÕ bµo vi khuÈn cã nhiÖm vô chuyÓn trùc tiÕp T-ADN sîi ®¬n sang tÕ bµo thùc vËt (h×nh 1.2) [209], [210]. Qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN nµy gÇn gièng víi qu¸ tr×nh tiÕp hîp ë vi khuÈn, trong ®ã protein VirB t­¬ng ®­¬ng víi yÕu tè F, ho¹t ®éng nh­ mét cÇu nèi chuyÓn gen. Sau khi T-ADN qua mµng tÕ bµo, chóng ®i th¼ng vµo nh©n vµ kÕt hîp víi genom thùc vËt ë nh÷ng vÞ trÝ ngÉu nhiªn. T¹i ®ã, c¸c gen trªn T-ADN, nhê sù ®iÒu khiÓn cña gen thùc vËt, b¾t ®Çu ho¹t ®éng vµ s¶n sinh ra auxin, cytokinin vµ opin g©y nªn sù ph¸t triÓn th¸i qu¸ cña hµng lo¹t tÕ bµo l©n cËn dÉn ®Õn sù h×nh thµnh khèi u. H×nh 1.2. Qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN vµo tÕ bµo thùc vËt [208] 1.1.2 C«ng nghÖ gen thùc vËt vµ kü thuËt chuyÓn gen nhê A. tumefaciens 1.1.2.1 HÖ thèng chuyÓn gen nhê A. tumefaciens Nh×n chung, hÖ thèng chuyÓn gen nµy bao gåm c¸c giai ®o¹n: (i) ChuyÓn vïng T-ADN vµo genom thùc vËt; (ii) BiÓu hiÖn gen quan t©m (Gene of Interest) trong tÕ bµo thùc vËt; (iii) T¸i sinh tÕ bµo thùc vËt thµnh c©y hoµn chØnh. Nh÷ng yÕu tè quan träng vµ cÇn thiÕt cho hÖ thèng chuyÓn gen nµy bao gåm: (1) C¸c gen vir; (2) §o¹n biªn ph¶i vµ tr¸i; (3) Vïng T-ADN: ngoµi hai ®o¹n biªn, hÇu hÕt c¸c gen trªn T-ADN cã thÓ ®­îc lo¹i bá vµ thay thÕ b»ng c¸c gen quan t©m ®Ó chuyÓn vµo c©y trång. §o¹n T-ADN ®­îc c¶i biÕn di truyÒn nµy gäi lµ T-ADN bÞ v« hiÖu ho¸ (disarmed T-DNA), mÊt chøc n¨ng g©y khèi u; (4) Vïng mang c¸c yÕu tè ®iÒu khiÓn cis: nh­ ®o¹n khëi ®éng vµ ®o¹n kÕt thóc hç trî vµ ®iÒu khiÓn sù biÓu hiÖn c¸c gen; (5) C¸c gen chØ thÞ chän läc [71]. C¸c lo¹i vect¬ Ti-plasmit nh©n t¹o: Ti-plasmit tù nhiªn cã kÝch th­íc qu¸ lín nªn rÊt khã ®Ó sao chÐp ë møc ph©n tö còng nh­ kh«ng ®¬n gi¶n ®Ó tiÕn hµnh chuyÓn gen. MÆt kh¸c, chóng l¹i chøa c¸c gen tæng hîp hoocmon sinh tr­ëng thùc vËt vµ opin kh«ng cÇn thiÕt vµ g©y khèi u cho c©y bÞ x©m nhiÔm nªn kh«ng ®­îc dïng trùc tiÕp lµm vect¬. Trªn c¬ së nµy, Ti-plasmit ®· ®­îc nghiªn cøu c¶i biÕn nh­ c¾t bá c¸c gen kh«ng quan träng, l¾p thªm c¸c gen cÇn thiÕt vµo vïng t¹o dßng ®a n¨ng (Multi Cloning Site - MCS) t¹o hai hÖ thèng vect¬ chuyÓn gen hiÖu qu¶: vect¬ liªn hîp (co-integrate vector) vµ vect¬ hai nguån (binary vector) [197]. Nhê vËy, c©y trång ®­îc biÕn n¹p Ti-plasmit c¶i biÕn võa mang gen quan t©m, võa cã kh¶ n¨ng t¸i sinh vµ ph¸t triÓn b×nh th­êng [66], [90]. Vect¬ liªn hîp: ®­îc x©y dùng trªn c¬ së sù t¸i tæ hîp gi÷a vïng t­¬ng ®ång n»m trªn plasmit vi khuÈn (nh­ vect¬ cña E. coli) víi vïng T-ADN trªn Ti-plasmit cña A. tumefaciens. Trong ®ã, ng­êi ta gi÷ l¹i vïng VIR, lo¹i bá vïng m· ho¸ chøc n¨ng g©y khèi u vµ thay thÕ b»ng nh÷ng ®o¹n ADN míi trong Ti-plasmit (h×nh 1.3). Nh­ vËy, cã ba lo¹i vect¬ tham gia vµo hÖ thèng vect¬ liªn hîp: (1) Ti-plasmit: c¸c gen g©y khèi u ®· bÞ v« hiÖu ho¸ b»ng c¸ch thay thÕ vµo ®ã gen kh¸ng kanamycin cña vi khuÈn (HÖ thèng vect¬ SEV) hoÆc mét ®o¹n tr×nh tù cña vect¬ pBR322 (HÖ thèng vect¬ pGV); (2) Vect¬ trung gian: cã nguån gèc tõ pBR322 víi kÝch th­íc nhá vµ ®­îc sö dông ®Ó bæ trî chøc n¨ng kh«ng ­u viÖt cña Ti-plasmit (kÝch th­íc lín vµ thiÕu vïng MCS). Chóng ®­îc nh©n lªn trong E. coli vµ chuyÓn sang A. tumefaciens nhê qu¸ tr×nh tiÕp hîp. Do kh«ng thÓ sao chÐp trong A. tumefaciens nªn chóng mang nh÷ng ®o¹n ADN t­¬ng ®ång víi T-ADN. (3) Vect¬ trî gióp: tån t¹i trong E. coli, cã kÝch th­íc nhá, chøa c¸c gen di ®éng (mobilization) vµ gen chuyÓn (transfer) gióp cho qu¸ tr×nh tiÕp hîp vµ chuyÓn gen vµo A. tumefaciens [197]. Khi tiÕp hîp, Ti-plasmit vµ vect¬ trung gian ®· x¶y ra qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp, gen quan t©m ®­îc chuyÓn tõ E. coli sang vïng T-ADN cña A. tumefaciens ®Ó t¹o ra cÊu tróc T-ADN liªn hîp. Nh­ vËy, vect¬ liªn hîp th­êng bao gåm c¸c thµnh phÇn chÝnh: (1) C¸c vÞ trÝ t¹o dßng thÝch hîp; (2) C¸c gen vir; (3) §o¹n biªn ph¶i vµ tr¸i; (4) Gen quan t©m; (5) ChØ thÞ chän läc vi khuÈn ho¹t ®éng trong E. coli vµ A. tumefaciens; (6) ChØ thÞ chän läc thùc vËt; (7) Vïng sao chÐp trong E. coli [186]. Vect¬ pGV3850 lµ mét vect¬ liªn hîp ®iÓn h×nh do Zambryski & ®tg [207] thiÕt kÕ. C¸c gen g©y khèi u trªn Ti-plasmit d¹ng nopalin (C58) ®· bÞ lo¹i bá vµ thay thÕ b»ng pBR322. Gen quan t©m ®­îc t¹o dßng trong pBR322 vµ ®­îc ®­a vµo vïng T-ADN cña pGV3850 th«ng qua qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp víi sù trî gióp cña pGJ28 vµ pR64drd11 trong tÕ bµo E. coli GJ28. Ngoµi pGV3850, hµng lo¹t vect¬ liªn hîp kh¸c còng ®· ®­îc sö dông nh­ pMON200, pMON273, pGV831... MÆc dï, vect¬ liªn hîp ®­îc thiÕt kÕ cho phÐp sù t¸i tæ hîp ®Æc hiÖu vÞ trÝ dùa trªn hÖ thèng t¸i tæ hîp cña phag¬ P1 (nh­ thÕ hÖ wP1/ oxP-Cre), nh­ng vect¬ nµy Ýt ®­îc sö dông, do: Nh÷ng tr×nh tù t­¬ng ®ång rÊt dµi gi÷a Ti-plasmit vµ plasmit cña E. coli g©y khã kh¨n khi thao t¸c vµ sö dông; HiÖu qu¶ chuyÓn gen thÊp víi sè l­îng b¶n sao cña vect¬ rÊt Ýt [197]. H×nh 1.3. S¬ ®å vect¬ liªn hîp b) Vect¬ hai nguån: Trªn c¬ së ph¸t hiÖn vïng VIR kh«ng cÇn n»m trªn cïng mét plasmit víi vïng T-ADN mµ vÉn ®iÒu khiÓn ®­îc sù chuyÓn vµ x©m nhËp cña T-ADN vµo genom thùc vËt, ng­êi ta ®· nghiªn cøu vµ hoµn chØnh hÖ thèng chuyÓn gen thùc vËt nhê vect¬ hai nguån trong ®ã vïng T-ADN vµ vïng VIR n»m trªn hai plasmit kh¸c nhau nh­ng trong cïng mét chñng A. tumefaciens. Cã hai lo¹i vect¬ ®­îc sö dông trong hÖ thèng vect¬ hai nguån: (1) Plasmit nhá cã kh¶ n¨ng tù sao chÐp vµ cã phæ vËt chñ réng chøa gen quan t©m trªn T-ADN, ®o¹n biªn ph¶i vµ tr¸i, chØ thÞ chän läc vµ sao chÐp trong E. coli vµ A. tumefaciens, chØ thÞ chän läc thùc vËt; (2) Ti-plasmit trî gióp: n»m trong A. tumefaciens, víi toµn bé vïng VIR ®­îc gi÷ l¹i nh­ng lo¹i bá hoµn toµn vïng T-ADN vµ ®o¹n biªn ph¶i, tr¸i (h×nh 1.4) [104], [105]. H×nh 1.4. S¬ ®å vect¬ hai nguån Nh×n chung, qu¸ tr×nh biÕn n¹p ë vect¬ hai nguån diÔn ra nh­ sau: (i) Plasmit nhá ®­îc nh©n lªn trong E. coli, sau ®ã ®­îc chuyÓn trùc tiÕp hoÆc qua qu¸ tr×nh tiÕp hîp vµo tÕ bµo A. tumefaciens chøa s½n Ti-plasmit trî gióp; (ii) TÕ bµo thùc vËt ®­îc nu«i cÊy ®ång thêi víi A. tumefaciens ®Ó chuyÓn T-ADN vµo genom thùc vËt; (iii) Chän läc tÕ bµo thùc vËt trong nh÷ng ®iÒu kiÖn thÝch hîp [37]. Thùc tÕ cho thÊy, plasmit víi hai ®¬n vÞ sao chÐp cã thÓ kh«ng bÒn v÷ng trong E. coli khi c¶ hai vïng nµy cïng ho¹t ®éng. Tuy nhiªn, vect¬ hai nguån cã mét sè ­u ®iÓm nh­: (i) Kh«ng x¶y ra qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp gi÷a c¸c plasmit; (ii) KÝch th­íc vect¬ kh¸ nhá. Nhê vËy, hiÖu qu¶ qu¸ tr×nh chuyÓn gen tõ E. coli sang A. tumefaciens ®· t¨ng lªn. HiÖn nay, vect¬ hai nguån ®­îc sö dông réng r·i víi rÊt nhiÒu lo¹i ®­îc thiÕt kÕ phï hîp víi yªu cÇu cña qu¸ tr×nh chuyÓn gen nh­: ThÕ hÖ vect¬ pGA bao gåm: (1) Vïng sao chÐp trong E. coli vµ A. tumefaciens cã nguån gèc tõ RK2; (2) YÕu tè ®iÒu khiÓn cis cÇn cho qu¸ tr×nh tiÕp hîp; (3) §o¹n biªn ph¶i vµ tr¸i; (4) Gen m· ho¸ neomycin phosphotransferaza II (neomycin phosphotransferase II gene - nptII) kh¸ng kanamycin vµ G418 trong thùc vËt; (5) Vïng MCS. Mét sè vect¬ ®Æc biÖt trong thÕ hÖ pGA nh­ pGA580, pGA581-583 ®· ®­îc thiÕt kÕ víi: (i) vïng sao chÐp ColE1 ho¹t ®éng trong E. coli (nguån gèc tõ pBR322), vµ mét ®o¹n tr×nh tù chøa vÞ trÝ cos cña phag¬ Lambda nh»m ph©n lËp c¸c ®o¹n cã kÝch th­íc lín tíi 40kb; (ii) vïng MCS n»m kÒ gen m· ho¸ chloramphenicol acetyltransferaza (chloramphenicol acetyltransferase gene - cat) khuyÕt ®o¹n khëi ®éng t¹o ®iÒu kiÖn ®Ó nghiªn cøu cÊu tróc vµ chøc n¨ng cña ®o¹n khëi ®éng; (iii) Cã vïng MCS n»m gi÷a ®o¹n khëi ®éng thùc vËt vµ ®o¹n kÕt thóc ®Ó g¾n vµ biÓu hiÖn c¸c gen quan t©m [31]. HÖ thèng vect¬ pCG víi: (1) Vïng sao chÐp cã nguån gèc tõ pRiHRI cña A. rhizogenes gióp pCG bÒn v÷ng h¬n trong A. tumefaciens so víi vïng sao chÐp tõ RK2; (2) Vïng ColE1 ho¹t ®éng trong E. coli [140]. ThÕ hÖ vect¬ pCIT: cã chøa vïng MCS vµ chØ thÞ chän läc thùc vËt, nh­ gen m· ho¸ hygromycin phosphotransferaza (hygromycin phosphotransferase gene - hpt) kh¸ng hygromycin ë vect¬ pCIT30, hoÆc nptII ë vect¬ pCIT101-104. C¸c vect¬ kh¸c cã vÞ trÝ Lambda cos cho phÐp ph©n lËp c¸c ®o¹n cã kÝch th­íc lín tíi 46 kb vµ chøa c¸c vïng cÇn thiÕt ®Ó chuyÓn gen nhê A. tumefaciens [137]. pGPTV: chøa gen chän läc thùc vËt, nh­ nptII, hpt, gen m· ho¸ phosphinothricin acetyl transferaza (phosphinothricin acetyl transferase gene - bar) n»m kÒ vÞ trÝ LB nh»m t¨ng c­êng kh¶ n¨ng chuyÓn gen quan t©m vµo tÕ bµo thùc vËt vµ biÓu hiÖn gen chØ thÞ chän läc [37]. pPZP: cã kÝch th­íc nhá vµ rÊt ®a n¨ng víi c¸c ®Æc tÝnh: (1) Chøa ®o¹n biªn ph¶i vµ tr¸i cña pTiT37; (2) C¸c vïng ColE1 vµ pVS1 ®Ó sao chÐp trong E. coli vµ A. tumefaciens; (3) ChØ thÞ chän läc vi khuÈn nh­ chloramphenicol (pPZP100) hoÆc Spectinomycin (pPZP200); (4) ChØ thÞ chän läc thùc vËt nh­ gen kh¸ng kanamycin, gentamycin; (5) Ngoµi ra, pPZP cßn chøa ®o¹n lacZ víi vïng MCS cña pUC18 n»m gi÷a ®o¹n biªn ph¶i vµ gen chän läc thùc vËt [90]. pBECK2000: cã chøa ®o¹n biªn ph¶i vµ tr¸i tæng hîp nh©n t¹o vµ gen bar. H¬n n÷a, chóng sö dông hÖ thèng t¸i tæ hîp ®Æc hiÖu vÞ trÝ phag¬ P1 Cre/ lox P cho phÐp qu¸ tr×nh chuyÓn vµ x©m nhËp gen chän läc vµ gen quan t©m vµo genom thùc vËt ®­îc diÔn ra ®ång thêi (trªn cïng T-ADN) hoÆc trªn hai ®o¹n T-ADN kh¸c nhau cña A. tumefaciens. ThÕ hÖ vect¬ nµy còng cho phÐp c¾t bá gen chän läc khái genom thùc vËt ë nh÷ng vÞ trÝ ®Æc hiÖu sau khi chóng ®· ®­îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo thùc vËt [142]. Vect¬ hai nguån BAC (Binary-BAC: BiBAC): rÊt phï hîp ®Ó chuyÓn c¸c ph©n tö ADN cã kÝch th­íc lín tíi 150 kb vµo genom thùc vËt. BiBAC cã chøa vïng sao chÐp ®¬n trong E. coli vµ A. tumefaciens. Plasmit trî gióp mang nhiÒu b¶n sao cña c¸c gen vir gióp cho T-ADN kÝch th­íc rÊt lín vÉn ®­îc chuyÓn nguyªn vÑn vµo genom thùc vËt [93], [94]. pGREEN: lµ plasmit kÝch th­íc nhá víi: (1) Vïng sao chÐp cã phæ vËt chñ réng ORI pSa vµ vïng ColE1 cã nguån gèc tõ pUC; (2) Gen rep A m· ho¸ chøc n¨ng sao chÐp trong E. coli vµ A. tumefaciens n»m trªn plasmit t­¬ng thÝch (pSoup) trong A. tumefaciens; (3) Vïng MCS tõ pBlueScript cho phÐp s¾p xÕp c¸c gen chän läc vµ gen quan t©m theo ý muèn [96], [97]. 1.1.2.2 Thµnh tùu chuyÓn gen vµo c©y trång nhê A. tumefaciens Mét trong nh÷ng thÝ nghiÖm chuyÓn gen ®Çu tiªn ®· sö dông A. tumefaciens ®Ó ®­a gen kh¸ng kh¸ng sinh vµo c©y thuèc l¸ [99]. Sau ®ã, A. tumefaciens ®· ®­îc chøng minh lµ mét ph­¬ng tiÖn rÊt hiÖu qu¶ ®Ó ®­a gen quan t©m vµo rÊt nhiÒu loµi c©y trång quan träng [57]. ChuyÓn gen vµo c©y hai l¸ mÇm: §Õn nay, trªn ®èi t­îng c©y hai l¸ mÇm, ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen nhê A. tumefaciens ®­îc ®¸nh gi¸ lµ hiÖu qu¶ nhÊt vµ ®­îc thùc hiÖn kh¸ ®¬n gi¶n víi sù hç trî cña c¸c chØ thÞ chän läc. §Çu nh÷ng n¨m 1980, c¸c c©y thuèc l¸ mang T-ADN víi gen m· ho¸ alcohol dehydrogenaza (alcohol dehydrogenase - Adh) cña nÊm men vµ nptII ®· ®­îc t¸i sinh [110]. Firoozabady & ®tg còng ®· thu ®­îc c©y b«ng chuyÓn gen