Đề tài Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn bacillus subtilis, lactobacillus acidophilus Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học

Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, con người có xu hướng trở dần về với tính chất thiên nhiên thông qua việc sử dụng một số chất có hoạt tính sinh học hay các phương pháp sinh học để ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp, cải thiện môi trường và để chữa bệnh. Lý do đơn giản là con người đã hiểu được mặt trái khi sử dụng các chất hóa học, chất kháng sinh. Những chất này tuy có hiệu quả nhanh chóng nhưng hậu quả mà nó mang lại rất lớn. Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trước đây người ta thường dùng những chất kháng sinh để phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm và tôm, cá... Việc sử dụng kháng sinh trong một thời gian dài đã để lại nhiều hậu quả không mong muốn như sự kháng thuốc của vi khuẩn hoặc rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột làm bệnh tái phát nặng hơn và dẫn đến khó điều trị hơn. Nghiêm trọng hơn sự tồn dư kháng sinh trong thịt dẫn đến phẩm chất thịt giảm làm hạ giá thành sản phẩm gây thiệt hại rất lớn trong chăn nuôi. Để khắc phục được tình trạng này, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng trực tiếp những vi sinh vật sống, có lợi thường gọi là “probiotic”. Kết quả đã chứng minh được lợi ích của những vi khuẩn có lợi này trong việc phòng và điều trị một số bệnh trong chăn nuôi, thủy sản và cho cả con người. Điều quan trọng là nó không để lại những hậu quả hay di chứng khi sử dụng như các loại hóa chất và thuốc kháng sinh. Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học” để phục vụ trong chăn nuôi và thủy sản. 1.2. MỤC ĐÍCH Xác định được môi trường tối ưu của vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong chăn nuôi thú y và nuôi trồng thủy sản. 1.3. YÊU CẦU 1.3.1. Đối với Bacillus subtilis Thực hiện việc nuôi cấy Bacillus subtilis trên nhiều loại môi trường khác nhau để xác định xem môi trường nào làm cho vi khuẩn sinh enzyme protease và amylase nhiều nhất. Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis . Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản. 1.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus Phân lập từ chế phẩm Antibio do Hàn Quốc sản xuất. Tìm môi trường nhân giống thích hợp cho sinh khối và độ chua cao nhất. Sản xuất chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản. Phần 2. TỔNG QUAN 2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 2.1.1. Lịch sử Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi tổ chức y học Nari của Đức. Lúc đầu chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957 Henry và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “Subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hóa. 2.1.2. Phân loại và đặc điểm 2.1.2.1. Phân loại Theo khóa phân loại của Bergey vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc: Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis 2.1.2.2. Đặc điểm Vi khuẩn Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương (G+), kích thước 0,5 - 0,8 µm × 1,8 – 3 µm. Đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, sinh bào tử nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước bào tử 0,8 – 1,8 µm. Phát triển bằng cách nảy chồi do sự nứt của bào tử. Chúng là loại vi sinh vật hiếu khí, nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 36 - 50oC, tối đa khoảng 60oC, bào tử chịu nhiệt khá cao. Nồng độ muối ăn làm ngừng phát triển của Bacilluss subtilis là 10 – 15% (Lương Đức Phẩm, 2000). Chúng phân bố rộng rãi trong ngoại cảnh, nhất là trên bề mặt thực vật (cỏ khô, khoai tây). Một đặc điểm dùng để phân biệt với các vi khuẩn khác là làm tan chảy gelatine nhanh chóng. Sữa cấy Bacillus subtilis trước tiên sau đó cấy men lactic trở nên acid nhanh chóng hơn sữa chỉ cấy men lactic. Vi khuẩn tác động bằng protease làm hình thành paraprotein từ casein, sữa cấy Bacillus subtilis bị kết tủa khi cho vào clorua calci (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978). Khi nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa Bacillus subtilis có khuẩn lạc tròn, không đều hay phân tán. Đường kính khuẩn lạc 3 – 5 mm, phát triển chậm, màu vàng xám ở giữa sậm màu, rìa có răng cưa. Sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Trong môi trường canh (nutrian broth) chúng phát triển làm đục môi trường, tạo thành màng nhăn trên bề mặt, lắng cặn, ít hoặc không tạo nhớt. Bacillus subtilis cho một số phản ứng sinh hóa: Lên men nhưng không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose. Indol (-), VP (+), nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+), có khả năng di động và hiếu khí. 2.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LACTIC Theo hệ thống phân loại của Bergey năm 1979 thì vi khuẩn lactic được phân loại như sau: Họ: Lactobacteriaceae Họ phụ: Streptococcaceae Giống: Streptococcus Leuconostoc Họ phụ: Lactobacteriaceae Giống: Lactobacterium 2.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 2.2.1.1. Lịch sử Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân của trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật. Ông đã mô tả được các đặc điểm trao đổi chất, phân loại cũng như chức năng của vi khuẩn này. Năm 1906 Metchnikoff xuất bản cuốn “The prolongation of life optinistic studies”. Ông chứng minh rằng vi khuẩn lactic trong yoghurt bulgarian như là nhân tố chống lại sự thối rữa ruột và sự lão hóa. Tuy nhiên sau đó người ta khám phá ra rằng chủng vi khuẩn này không thể sống sót khi qua dạ dày và ruột. Do đó người ta nhanh chóng thay thế chủng vi khuẩn này bằng chủng L. acidophilus như là một probiotic trong ruột. Họ thấy rằng có rất nhiều vi khuẩn Lactobacillus lên men đồng hình và dị hình sống trong ruột, miệng và âm đạo nhưng chiếm ưu thế nhất trong số đó là 6 loài Lactobacillus lên men đồng hình tạo thành nhóm gọi là phức hợp Lactobacillus acidophilus. 2.2.1.2. Đặc điểm Lactobacillus acidophilus thuộc họ vi khuẩn lactic. Chúng có dạng trực khuẩn dài và chịu nhiệt. Tế bào hình que, đầu tròn, kích thước 0,6 - 0,9 × 1,5 – 6 µm đứng riêng rẻ, xếp thành đôi hay thành chuỗi ngắn, không di động, không sinh bào tử, tế bào non bắt màu Gram dương khi nhuộm, tế bào già trở thành Gram âm. Vi hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37oC, không phát triển ở 20 - 22oC và 43 - 48oC. Trên môi trường nước chiết cà chua hay nước chiết nấm men khuẩn lạc có dạng tròn, nhỏ ở giữa dày và đục hơn mép ngoài. Trong môi trường thạch sâu khuẩn lạc nhỏ và có hình dạng không ổn định. Trên môi trường thạch nghiêng thì khuẩn lạc khô, phát triển kém và giới hạn theo vết cấy. Lên men lactic đồng hình, tích tụ 2,2% acid lactic trong môi trường, không phát triển trong môi trường hydratcarbon, môi trường khoai tây, phát triển tốt trên môi trường dịch thể cao nấm men. L. acidophilus là một dạng probiotic được sử dụng thường xuyên nhất. Là vi khuẩn có lợi cư trú trong ruột, âm đạo, trong phân người và động vật. Chúng có khả năng sinh Bacteriocin là chất có hoạt tính ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột. L. acidophilus có khả năng lên men các loại đường: glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose và không lên men xylose, arabinose, ramnose, glycerol, mannitol, sorbitol, inositol. Cho các phản ứng: methyl red (+), indol (-), VP (-), citrate (-), catalase (-), khả năng đông vón sữa (+). 2.2.1.3. Quá trình trao đổi chất Hiện nay các thành viên của phức hợp Lactobacillus acidophilus được phân vào nhóm lên men đồng hình bắt buộc. Hexose được lên men để tạo thành acid lactic theo con đường EMP. Chúng có enzyme aldolase nhưng thiếu phosphoketolase, không lên men gluconat và pentose. Tất cả các loài đều tạo đồng phân dạng D và L của acid lactic (Lê Thị Hồng Tuyết, 2004). 2.2.1.4. Sự thay đổi thành phần của sữa trong quá trình lên men Trong quá trình lên men sữa tạo thành sản phẩm sữa chua có sự thay đổi sâu sắc các loại đường, casein và các thành phần khác. Sự thay đổi đường sữa Vi khuẩn lactic sử dụng đường lactose nhờ hệ thống enzyme lactase để chuyển hóa lactose thành glucose và galactose. Lactase là một endoenzyme nên khi lactose muốn được chuyển hóa thì phải qua màng vi khuẩn. Lactose sẽ được chuyển hóa theo hai con đường: Vi khuẩn sử dụng enzyme lactase (hay enzyme galactosidase) để bẻ gãy H2 chuyển lactose thành glucose và galactose. Lactose được oxi hóa thông qua enzyme lactosehydrogenase thành lactosebionat sau đó phân giải tiếp thành gluconat và galactose qua một giai đoạn diễn biến phức tạp, mỗi giai đoạn do một enzyme chuyên biệt phụ trách. Sự thay đổi protein sữa Trong quá trình lên men, lượng acid hữu cơ các loại càng tích lũy càng làm tăng quá trình tách calci ra khỏi casein tạo pH đẳng điện. Do đó, casein bị vón lại làm tăng quá trình lên men tạo pepton và các sản phẩm khác nhau. Con đường chuyển hóa chủ yếu của quá trình lên men sữa 2.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. 2.2.2.1. Trong công nghiệp Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu acid lactic. Có vị chua dễ chịu và có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt. Chúng được dùng để acid hóa rượu vang và hoa quả nghèo acid, ngoài ra còn được sử dụng trong công nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm, sơn và chất dẻo. 2.2.2.2. Trong nông nghiệp và môi trường Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium loại nấm gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp. Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây yếu đi và đây là cơ hội gây bệnh cho cây trồng. Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu nó bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic. Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường. 2.2.2.3. Trong y dược Vi khuẩn lactic được sử dụng trong y học để chữa bệnh đường ruột, dùng trong phẫu thuật chỉnh hình, nha khoa, bệnh phụ khoa… 2.2.2.4. Trong bảo quản và chế biến thực phẩm Trong bảo quản và chế biến thực phẩm vi khuẩn lactic được sử dụng để làm dưa chua, làm chua quả mà không làm mất màu tự nhiên của quả. Dùng sản xuất tương, đậu phụ hay lên men sữa chua. 2.3. KỸ THUẬT NUÔI CẤY VI SINH VẬT Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật thì trong môi trường lên men phải có chứa đầy đủ các thành phần sau (Lê Xuân Phương, 2001). Glucid: Là nguồn dinh dưỡng quan trọng để vi sinh vật thực hiện quá trình trao đổi chất xây dựng và đổi mới, ngoài ra glucid còn đóng vai trò chủ chốt trong việc tạo ra năng lượng cho tế bào. Glucid thường được sử dụng dưới dạng dịch chiết có đường, mật rỉ, tinh bột (phải thủy phân thành đường trước khi lên men). Phosphat vô cơ: Đóng vai trò quan trọng trong sự trao đổi năng lượng và tổng hợp acid nucleic. Trong lên men các muối phosphat vô cơ được dùng phổ biến là phosphat amon và phosphat kali. Nitơ: Tham gia vào quá trình tạo protein, acid nucleic và chất có đặc tính sinh học khác của tế bào vi sinh vật. Nitơ thường sử dụng trong lên men dưới dạng muối nitrat, các hợp chất amon hoặc một số chất có nguồn gốc vi sinh vật. Các chất sinh trưởng và các nguyên tố vi lượng: Vitamin và các nguyên tố vi lượng là những chất cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật. Chúng thường được sử dụng với lượng nhỏ nhưng tác dụng rất lớn và đa dạng không thể thiếu được đối với hoạt động sống bình thường của vi sinh vật. 2.3.1. Đối với Bacillus subtilis 2.3.1.1. Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cao Không phải tất cả các vi sinh vật đều có khả năng sinh enzyme như nhau và ngay cả những chủng cùng một giống cũng không cùng hoạt tính sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy khi tuyển chọn vi sinh vật phải tiến hành tìm kiếm, phân lập và lựa chọn hàng chục, hàng trăm những giống vi sinh vật để có được những chủng có hoạt độ cao trong việc tạo thành những enzyme cần thiết. Người ta thấy rằng enzyme thu nhận từ vi khuẩn có nhiệt độ tối ưu và khả năng chịu nhiệt cao hơn enzyme thu nhận từ nấm mốc (Lương Đức Phẩm, 1998). Trong đất có rất nhiều bào tử và tế bào vi sinh vật trong số đó người ta nhận thấy rằng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp enzyme α-amylase và protease. 2.3.1.2. Nguyên liệu để sản xuất enzyme α-amylase từ vi khuẩn. Nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme từ vi sinh vật là những nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm. Vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn để thu nhận α-amylase có thể dùng tinh bột, maltose, saccarose, glucose và glycerin. Ngoài ra người ta còn cho thêm các acid amin ở dạng phức hợp hoặc riêng từng cơ chất (pepton, protein thủy phân dịch chiết mầm mạch, các acid amin...) Nếu môi trường có CaCO3 làm tác nhân điều chỉnh pH và pepton thì α-amylase được tổng hợp gấp hai lần. Trong một phân tử gam α-amylase của Bacillus subtilis có 4g nguyên tử calci. Trong thành phần dinh dưỡng ion Ca có tác dụng nâng cao khả năng tổng hợp α-amylase, làm ổn định enzyme có tác dụng bảo vệ enzyme này đối với protease (Lương Đức Phẩm, 1998). Trong môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật sinh enzyme nói chung cần phải có mặt của các nguyên tố khoáng trong các dạng muối magie, phospho, kali, và các ion mangan, kẽm, và các nguyên tố vi lượng khác. Nồng độ thích hợp để tổng hợp α-amylase của MnSO4 là 0,05%. Thiếu muối α-amylase không được hình thành. Hoạt độ α-amylase được nâng cao ở nồng độ KH2PO4 là 1%. Ion Mg2+ có tác dụng ổn định amylase ở nhiệt độ cao. Lưu huỳnh cũng có tác dụng đến sinh tổng hợp α-amylase. Các nguồn lưu huỳnh là các acid amin (methionin, sistein, sistin) và các muối sunfat (trừ sunfat đồng), trong đó nguồn lưu huỳnh tốt nhất là methionin. 2.3.1.3. Nguyên liệu để sản xuất enzyme protease từ vi khuẩn Trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh protease thì cần phải có các chất cảm ứng, các nguồn nitơ hữu cơ (bột ngô, bột đậu tương, bột mì, cám mì, mầm mạch, dịch chiết nấm men, pepton, protein....). Vi khuẩn Bacillus subtilis tổng hợp protease có hoạt độ cao ở môi trường có tinh bột, nếu giảm nồng độ tinh bột từ 8 – 2% thì hoạt độ protease giảm vài lần. Ngoài các nguồn nitơ hữu cơ thì nguồn nitơ vô cơ cũng ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp protease như HNO3, HNO2. Trong số các nguồn nitơ vô cơ ta chỉ thấy có phosphat amon dibazic là tốt hơn cả. Những muối khác như NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO3, KNO3, Ca(NO3)2 làm giảm hoạt độ protease tới 30 – 50% còn α-amylase giảm tới 7 – 10 lần. Trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ thì hoạt độ protease và amylase cũng thấp hơn trong môi trường đối chứng có (NH4)2HPO4 và nước chiết đậu tương (Lương Đức Phẩm, 1998). Các acid amin ức chế đến tổng hợp enzyme protease ở Bacillus subtilis là methionin, acid glutamic, alanin, leucin... 2.3.1.4. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật có khả năng sinh enzyme Phương pháp nuôi cấy bề mặt Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Môi trường sử dụng là môi trường lỏng hoặc sử dụng môi trường đặc (môi trường bán rắn). Môi trường lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành váng khuẩn ngăn cách pha lỏng và pha khí. Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Ở môi trường đặc để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường. Vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Độ ẩm thích hợp ở môi trường đặc là 55 – 65%. Ưu điểm của phương pháp bề mặt là dễ thực hiện và khi bị nhiễm vi sinh vật lạ thường xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ vì vậy ta dễ dàng xử lý. Nhưng nhược điểm là tốn nhiều diện tích và khó cơ giới hóa, tự động hóa. Phương pháp nuôi cấy chìm Phương pháp này người ta sử dụng môi trường lỏng và được thực hiện trong những thùng lên men. Trong các thiết bị lên men thường lắp đặt hệ thống cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh pH và nồng độ các chất dinh dưỡng. Trong đó hệ thống điều hòa không khí và khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn do chúng làm xáo trộn môi trường làm tế bào vi sinh vật phân bố đều, tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và tế bào vi sinh vật đồng thời dòng khí được cung cấp và thải ra liên tục giúp cho sự sinh sản và phát triển, làm tăng khả năng tạo enzyme của vi sinh vật. Ưu điểm của phương pháp này là ít tốn diện tích và dễ cơ giới hóa nhưng có nhược điểm là dễ bị nhiễm và khó kiểm soát. 2.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus 2.3.2.1. Nhu cầu sinh trưởng Lactobacillus acidophilus là loài vi hiếu khí nên có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí và trong điều kiện nuôi cấy tĩnh không lắc, ở điều kiện kị khí thì sự phát triển thích hợp hơn. Chúng phát triển mạnh trong môi trường agar ở điều kiện khí chuẩn (5% CO2, 10% H2 và 85% N2). 2.3.2.2. Nhu cầu dinh dưỡng Nhu cầu dinh dưỡng của Lactobacillus acidophilus phản ánh bản chất rất khó của những vi khuẩn này. Môi trường nuôi cấy chuẩn thường rất giàu acid amin và vitamin như pepton, trypton, dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt bò, ngoài ra còn chứa sorbitol, monooleat (Tween 80), sodium acetat và muối magie kích thích sự tăng trưởng. Môi trường nuôi cấy thường sử dụng là MRS lỏng (De Man, Rogosa và Sharpe). 2.3.2.3. Môi trường sản xuất Trong sản xuất sinh khối người ta thường sử dụng sữa bò hay từ sữa đậu nành. Do trong sữa bò và sữa đậu nành có nhiều casein và nhiều thành phần dinh dưỡng khác nhau: Thành phần của sữa bò Trong sữa bò gồm có thành phần chính là protein bao gồm casein, lactoalbumin, lactoglobulin. Casein là loại protein phức tạp (phosphoprotein). Trong sữa ngưng kết casein ở dạng phức chất caseinat-calci-phosphat. Trong sữa tươi, casein ở dạng hòa tan là caseinogen, nếu sữa acid (pH = 4,5 - 4,7) thì casein lắng xuống, sữa ngưng kết thành khối. Khi bị tác dụng của pepsin hay chymozin thì casein chuyển thành dạng không hòa tan. Trong sữa còn có triglyceric, acid béo bay hơi và acid béo không bay hơi chủ yếu là acid oleic (40,6%), acid palmitic và stearic (50,9%), các glyceric khác chiếm 8,5%. Ngoài ra còn có vết lecithin, cholesterol (Trần Thị Dân, 2000). Thành phần hóa học của sữa đậu nành Trong đậu nành có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng nhưng người ta quan tâm nhiều nhất là hàm lượng protein và lipid, nhóm glucid của đậu nành không thuộc loại có giá trị cao về dinh dưỡng. Protein đậu nành chiếm trên 40%, nó gấp 10 lần so với sữa, gấp 2 lần so với thịt bò. Ngoài ra protein đậu nành còn có chứa đủ các acid amin thiết yếu như lysine, methionin, isoleucin, tryptophan.... Lipid đậu nành chiếm 20%, chủ yếu chứa hai thành phần quý là trylycerid và lecithin, hàm lượng acid béo không no cao (khoảng 85%), acid béo no thấp (15%). Trong đậu nành còn chứa các vitamin A, E, K, B1, B2 chiếm khoảng dưới 1% và các khoáng chất chiếm khoảng 5% nhưng chất lượng dinh dưỡng của các khoáng chất từ đậu nành thấp hơn so với các khoáng chất của động vật. Ngoài ra trong đậu nành còn chứa một số chất không có lợi khác như chất ức chế trypsin, chất này làm giảm sự sinh trưởng gây phình to tụy tạng động vật... Những chất như hemaglutinins gây đông tế bào máu, cản trở sự hoạt động của hồng cầu. Chất goitrogens gây phình to tuyến giáp, urease gây phân giải protein thành amoniac gây độc cho cơ thể... Các chất độc này đa số tập trung ở màng ngoài của hạt đậu nành (Nguyễn Thị Hiền, 2004). 2.3.2.4. Điều kiện sản xuất Trước khi lên men, sữa phải được thanh trùng để loại bỏ những vi sinh vật tạp nhiễm có trong sữa. Người ta thường sử dụng phương pháp Pasteur để thanh trùng sữa (65oC trong 30 phút hoặc 72 – 75oC trong 10 - 20 giây). Sau khi thanh trùng người ta cấy vi khuẩn lactic vào sữa, lượng giống cho vào từ 5 - 10%. Sau một thời gian lên men thì sữa có độ chua khá cao thường là 90 – 120oT (oT = độ chua Therne) và đông vón lại. 2.4. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PROBIOTIC (Trích dẫn của Lã Văn Kính, 1998). 2.4.1. Định nghĩa probiotic Thuật ngữ probiotic được đưa ra lần đầu tiên bởi Lilly và Stillwel (1965) để mô tả những yếu tố kích thích sinh trưởng được sản sinh bởi vi sinh vật. Probiotic được bắt nguồn từ gốc Hylạp với nghĩa “tiền sự sống” (prolife). Năm 1989 Fuller định nghĩa probiotic như là một thức ăn bổ sung vi sinh vật sống có tác động có lợi đến động vật chủ thông qua việc cải tiến cân bằng vi sinh vật của nó. Năm 1992 Havenar et al chỉ ra rằng định nghĩa probiotic của Fuller bị hạn chế ở những thức ăn bổ sung cho động vật qua đường ruột. Ông nới rộng định nghĩa probiotic của Fuller như là một lứa cấy đơn hay hỗn hợp của các vi sinh vật sống mà chúng (dùng áp dụng cho người và động vật) có ảnh hưởng có lợi đối với vật chủ bằng cách cải thiện những tính chất của hệ vi sinh vật bản xứ. 2.4.2. Cơ chế tác động 2.4.2.1. Duy trì hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột Động vật khỏe mạnh có hệ thống tiêu hóa hoạt động tốt. Đó là cơ sở cho sự chuyển hóa có hiệu quả thức ăn cho duy trì và sản xuất. Đặc tính quan trọng nhất của đường tiêu hóa hoạt động tốt là sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong nó. Vi khuẩn lactic có mặt khắp đường ruột và trong một số điều kiện nó là vi khuẩn chiếm ưu thế (Fuller, 1977; Jin et al,1997). Sự cân bằng trong đường ruột bị phá vỡ khi các động vật bị stress như nhiệt độ cao, độ ẩm cao, thay đổi thức ăn, vận chuyển…Việc cho con vật ăn thường xuyên probiotic giúp duy trì hệ vi sinh vật bằng hai con đường: Chống lại vi sinh vật gây bệnh và bằng hoạt động đối kháng. 2.4.2.2. Hoạt động đối kháng Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng vi khuẩn sinh acid lactic có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật truyền nhiễm ở gia cầm. Chateau et al (1993) phân lập được 103 chủng Lactobacillus ssp từ hai sản phẩm DFM (cho ăn trực tiếp) thương mại và kiểm tra khả năng ức chế hai chủng Salmonella. Khoảng 47% Lactobacillus của sản phẩm A và 70% của sản phẩm B có thể ức chế tất cả 6 serotype E. coli. Ozayabal và Coner (1995) báo cáo rằng 3 chủng thương mại (L. acidophilus, L. casei và L. faecium) có thể ức chế sự phát triển của của 6 serotype Salmonella. Jin et al (1996) phát hiện ra rằng tất cả 12 chủng Lactobacillus có thể ức chế sự phát triển của 5 chủng Salmonella và 3 chủng E. coli . Các sản phẩm vi sinh từ Lactobacillus có Bacteriocin, acid hữu cơ và hydroperoxyd. Bacteriocin là hỗn hợp của các sản phẩm vi sinh vật có các thành phần protein sinh học chủ động và hoạt động vi sinh (Tag et al, 1976). Các chủng Lactobacillus có ở đường ruột của người và một số động vật thí nghiệm khác cũng sản xuất các chất giống Bacteriocin được gọi là Lactocidin (Vincent et al., 1995). Chất này họat động ở pH 5 - 7,8 và không mẫn cảm với các hoạt động xúc tác. Lactocidin thô có các hoạt động ức chế nhiều loại vi khuẩn bao gồm Proteus spp, Salmonelle spp, E. coli và Staphylococcus spp. Vì Lactocidin có phổ kháng khuẩn rất rộng. Vincent et al (1959) kết luận rằng L. acidophilus có thể đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các vi sinh vật có hại trong đường ruột của gia súc và người. Hoạt động đối kháng bởi vi khuẩn lactic có liên quan chặt chẽ với sản phẩm cuối của quá trình trao đổi chất. Hàng loạt các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi do Lactobacillus có khả năng có hoạt động đối kháng (trong phòng thí nghiệm). Các sản phẩm phụ được biết tới nhiều nhất là các acid hữu cơ như acid lactic, acetic (Trammer, 1966; Sorrel và speck, 1970) và hydro peroxid (Wheater et al, 1952) Dahiafa và Speck, 1968); Price và Lee, 1970). Các acid acetic, lactic ức chế sự phát triển của nhiều vi sinh vật gây bệnh Gram âm (Sorrel và Speck, 1970; Herrick, 1972): Adams và Hall (1988) phát hiện ra các hoạt động của các acid này phụ thuộc vào độ pH. Nếu độ pH thấp sẽ tăng mức độ acid ở dạng không hòa tan. 2.4.2.3. Sự loại trừ cạnh tranh Fuller (1977) báo cáo rằng các chủng Lactobacillus 59 và 74/1 có khả năng giảm E. coli trong diều và ruột non nhưng không làm giảm trong ruột già của gà. Muralidhara (1977) tìm ra rằng tính đồng nhất của các mô bào ruột non được cung cấp Lactobacillus lactic đã có nhiều Lactobacilli hơn và ít E. coli hơn các động vật bình thường hoặc tiêu chảy. Francis (1978) kết luận rằng việc thêm các chế phẩm Lactobacillus ở mức 75 mg/kg thức ăn đã giảm đáng kể (p < 0,05) số lượng Coliform trong ruột non và ruột thừa ở gà tây. Watkin (1982) và Miller (1983) đã thấy sự giảm đáng kể E. coli trong đường dạ dày ruột của gà đã được cho ăn, uống Lactobacillus acidophilus. Tuy nhiên có nhiều yếu tố cần phải lưu ý nếu muốn nhận được kết quả tốt khi sử dụng probiotic. Trong đa số các trường hợp cần phải biết chắc chắn rằng