Đề tài Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn Ecoli DH5α

1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt Vấn Đề Cách đây hai thập kỷ, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đúng khi nhận thấy việc sử dụng DNA tái tổ hợp nhƣ là một công cụ hữu hiệu trong việc nâng cao năng suất cây trồng và chất lƣợng lƣơng thực, thực phẩm đồng thời vẫn thúc đẩy đƣợc một nền nông nghiệp bền vững. Tiếp theo những nhận định này là hàng loạt những đột phá trong nghiên cứu khoa học về các phƣơng pháp chuyển gen, trong việc phát hiện và bảo tồn những gen quý. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thƣờng gặp khó khăn lớn về số lƣợng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm. Để giải quyết vấn đề này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt đông của gen, sự biểu hiện ra protein và cấu trúc của protein, ngƣời ta chú trọng tới việc phân lập và thu nhận đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lƣợng lớn để tiến hành nghiên cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen chúng ta quan tâm thƣờng chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng ta không thể sử dụng các phƣơng pháp sinh hoá thông thƣờng để phân lập gen mục tiêu trên bộ gen. Những vấn đề trên có thể đƣợc giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen, tăng bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA dùng cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào thích hợp sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ gen của tế bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế bào chủ thƣờng đƣợc chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và các đặc tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi là dòng tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp hoặc dùng cho các thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA cloning. Mục đích của tạo dòng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn và tinh khiết các trình tự DNA hay thu nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu. Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến thức về kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tôi tiến hành thực hiện 2 đề tài “ Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α” trong khoá luận tốt nghiệp của mình. 1.2 Mục tiêu của đề tài Thiết lập quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescipt và chuyển đƣợc plasmid tái tổ hợp này vào tế bào ký chủ Ecoly DH5α. 1.3 Nội dung thực hiện 1.3.1 Phần 1 Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD600nm và mật số tế bào vi khuẩn dựa trên sự tƣơng quan của số tế bào theo thời gian nuôi cấy kết hợp với tƣơng quan của giá trị OD600nm theo thời gian nuôi cấy. Thiết lập quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất. Thiết lập phƣơng pháp biến nạp plasmid DNA chƣa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α bằng hóa chất và sốc nhiệt. Phƣơng pháp tách chiết plasmid chƣa tái tổ hợp bằng SDS-kiềm thể biến nạp, kết hợp với phản ứng cắt enzym giới hạn để kiểm tra. 1.3.2 Phần 2 Chuẩn bị đoạn DNA để chèn. Cắt và tinh sạch vector. Phản ứng sửa chữa sai sót trên đoạn DNA chèn, nhằm tạo ra đoạn DNA có đầu bằng. Phản ứng nối giữa vector và DNA chèn. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào. Kiểm tra thể biến nạp trên môi trƣờng có chứa Ampicillyn, X-gal, IPTG Kiểm tra lại kết quả biến nạp đoạn gen bằng phản ứng cắt, phản ứng PCR trên plasmid tách chiết từ thể biến nạp. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LYỆU 2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn 2.1.1 Hiện tƣợng biến nạp Biến nạp là hiện tƣợng tiếp nhận DNA từ bên ngoài vào tế bào vi khuẩn. Hiện tƣợng biến nạp đƣợc chứng minh lần đầu tiên trên vi khuẩn Streptococcus pneumoniae do Fred Griffiths, năm 1928, sau đó đƣợc kiểm chứng lại bởi Avery và cộng sự năm 1944 (viện Rocketfeller). Chủng vi khuẩn mà Griffiths và Avery sử dụng có trạng thái khả nạp tự nhiên, chúng có khả năng hấp thu DNA tự nhiên có sẵn ở môi trƣờng sống. Nguồn DNA này có đƣợc từ các tế bào chết hay các tế bào bị phân hủy. Kết quả thu đƣợc là vi khuẩn thể hiện một hoặc vài tính trạng mới, tính trạng này ổn định và có khả năng di truyền. Từ các nghiên cứu của Griffiths và Avery đã chỉ ra rằng tế bào vi khuẩn phải ở trạng thái sinh lý đặc biệt mới có khả năng hấp thu DNA, đó là “trạng thái khả nạp”. Trạng thái khả nạp xuất hiện tự nhiên ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ chất dinh dƣỡng và oxy trong môi trƣờng sống của chúng giảm xuống thấp. Trong thực tế nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào vi khuẩn để chúng có khả năng hấp thu DNA. 2.1.2 Vai trò và ứng dụng của biến nạp gen 2.1.2.1 Vai trò Hiện tƣợng biến nạp giúp các loài vi khuẩn có thêm các tính trạng mới dễ thích nghi với môi trƣờng sống. Đó là cơ sở của tiến hóa và đa dạng vi sinh vật. 2.1.2.2 Ứng dụng Biến nạp DNA vào vi khuẩn còn là bƣớc đầu trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Từ rất lâu, vi sinh vật đã đƣợc xem và sử dụng nhƣ nhà máy sinh học (lyving factories) tạo ra các sản phẩm sinh học phục vụ nhu cầu con ngƣời, ví dụ kháng sinh Penicillyn đƣợc chiết xuất từ nấm Penicillyum và Streptomycin tạo ra từ vi khuẩn Streptomyces griseus. Kỹ thuật tái tổ hợp cho phép chuyển một gen từ động vật, cây trồng vào vi khuẩn và ở đó một lƣợng lớn sản phẩm mong muốn của gen sẽ đƣợc tạo ra, sau đó kết hợp với các phƣơng pháp chiết xuất và tinh sạch để phục vụ cho mục đích của con 4 ngƣời. Nhiều loại vaccine dùng trong y học và thú y, nhiều giống cây trồng chứa gen kháng bệnh đã đƣợc tạo ra thay thế cho những phƣơng pháp cổ điển. Biến nạp gen vào vi khuẩn còn giúp thực hiên những nghiên cứu khác nhƣ đọc trình tự gen, kiểm tra đa dạng sinh học, hay bảo quản sự ổn định của đọan gen đƣợc dễ dàng. 2.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiên tƣợng biến nạp Hiện tƣợng biến nạp đòi hỏi sự thể hiện của gen mã hóa cho những thành phần mà DNA gắn vào, sau đó sẽ đƣợc hấp thụ. Trong tự nhiên, khi nồng độ các chất dinh dƣỡng hay nồng độ oxy giảm đến mức tối thiểu ảnh hƣởng đến sự sống của vi khuẩn, lúc này tế bào sẽ bị thay đổi về cấu trúc cũng nhƣ đặc tính sinh lý sinh hóa, màng tế bào bị biến tính dẫn đến sự hình thành các kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA sẽ theo các kênh này đi vào nhờ việc tiếp xúc với màng và nhận đƣợc sự hỗ trợ của hệ thống vận chuyển bên trong tế bào. Hệ thống vận chuyển này đƣợc hình thành trên cơ sở enzym gây biến tính một số protein màng. Enzym ComC có bản chất là một peptidase phân cắt protein ComG của màng tế bào làm cho nó không còn tính trọn vẹn của một protein màng, từ đó chúng đƣợc hoạt hoá. Có 7 protein cùng dạng với ComG, tất cả chúng đều có thể tạo ra cấu trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA. ComEA là thể nhận để DNA đi vào tế bào. ComEC có thể tạo ra kênh vận chuyển dạng dịch và qua đó DNA đi vào tế bào (Leendert W.Hamoen và cộng sự, 1998). ComFA là một dạng helycase có chức năng phối hợp với ComEA và ComEC để đƣa sợi DNA mạch đơn vào tế bào. Trong quá trình chuyển nạp sợi DNA mạch đôi bám vào đầu Carboxyl của ComEA và đƣợc phân ra thành những đoạn dƣới tác động của endonuclease (hiện nay đã xác định đó là NucA), phần đầu cuối mới đƣợc cắt ra này đƣợc đƣa tới ComEC và ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào. Sự phiên mã của gen “late competence” mã hoá cho bộ máy gắn kết và hấp thụ DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) cũng nhƣ các yếu tố cần cho sự tái tổ hợp (recA, addAB) đòi hỏi một yếu tố có khả năng kých hoạt sự phiên mã. ComK là yếu tố hoạt hoá sự phiên mã. ComK đƣợc điều chỉnh chính xác sự biểu hiện của nó. Sự biểu hiện của ComK đƣợc quy định bởi một mạng lƣới phức tạp bao gồm AbrB, ComA, sinR và MecAB. Trong các thí nghiệm thực hiện năm 1998, Leendert W.Hamoen và cộng sự đã chỉ ra rằng ComK nhận biết một vùng trình tự 5 ngắn giàu A/T, đƣợc sắp xếp trong một khung đọc đặc trƣng và lynh động dọc theo sợi xoắn DNA. Phân tích footfrinting các gốc hydroxyl của ComK bám vào addAB promoter cho phép họ kết luận rằng ComK bám vào vùng trình tự giàu A/T AAAAN5TTTT. ComK đƣợc điều hoà âm bởi sự bám vào của AbrB và CodY, đƣợc hoạt hoá dƣơng bởi AbrB, sinR, DegU. CodY là một GTP-binding protein nhạy cảm với nồng độ GTP nội bào nhƣ là một chỉ thị về dinh dƣỡng, nó điều hoà sự phiên mã ở phần đầu phare ổn định và sự phiên mã của gen quy định sự hình thành bào tử. Từ đó, cho phép tế bào thích nghi với những giới hạn về dinh dƣỡng. DegU giúp cho ComK bám chặt hơn vào ComK promoter, điều này đảm bảo sự phiên mã chính xác ngay cả khi nồng độ ComK thấp. 2.3 Sự biến nạp nhân tạo vào tế bào E.coly 2.3.1 Khái niệm sự biến nạp nhân tạo. Biến nạp nhân tạo là việc đƣa một đoạn DNA vào tế bào chủ nhằm nhân nhanh số lƣợng bản sao, phục vụ cho mục đích nghiên cứu khác. Trong phòng thí nghiệm, nhằm mục đích tăng cƣờng khả năng biến nạp, ngƣời ta thƣờng xử lý tế bào chủ bằng các phƣơng pháp hóa học hay vật lý. Tế bào chủ sau khi đƣợc xử lý bằng các phƣơng pháp trên gọi là tế bào khả nạp. Tế bào E.coly là một tế bào chủ đƣợc sử dụng rộng rãi vì cấu trúc di truyền của nó tƣơng đối đơn giản, thông tin di truyền đã đƣợc biết tƣờng tận nên dễ dàng phát hiện tế bào có mang gen lạ. E.coly là một vi khuẩn Gram âm, hình que, dài khoảng 2,5µm, có roi (flagella) và bộ gen gồm 4639221 cặp base mã hoá cho ít nhất 4000 gen. Giống nhƣ tất cả các loài vi khuẩn gram âm khác E.coly không có màng nhân và nhiễm sắc thể là một phân tử sợi đôi dạng vòng rất lớn với những vị trí gắn màng và một vị trí khởi đầu sao chép. Các tế bào E.coly có thể hỗ trợ sự sao chép các plasmid DNA và chọn lọc các DNA plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng kháng sinh hay các phức hợp màu với X-gal. 2.3.2 Sự điều hoà gen của operon Lac ở E.coly Trong trƣờng hợp có glucose, E.coly tăng trƣởng nhanh chóng. Nếu thay glucose bằng lactose (β-galactisido-glucose), E.coly ngừng tăng trƣởng và hồi phục sau đó nhờ tổng hợp đƣợc 3 enzym Permerase kých thích sự thấm lactose Acetylase (vai trò chƣa rõ) 6 Β-galactosidase xúc tác sự thuỷ giải lactose thành galactose và glucose Ba enzym này chỉ đƣợc tổng hợp khi cần để phóng thích glucose từ lactose; chúng đƣợc cảm ứng bởi lactose. Jacobs và Monod (1961) giải thích sự cảm ứng này qua mô hình hoạt động của operon Lac (lactose operon). Operon Lac là đoạn DNA chứa: Ba gen cấu trúc lacZ (mã hoá β- galactosidase), lacY (mã hoá permerase) và lacA (mã hoá acetylase). Một trình tự nucleotide gọi là promoter (vùng khởi động: P), đánh dấu điểm khởi đầu sao chép của cả 3 gen. Một trình tự nucleotide gọi là operator (vùng hoạt động: O) nằm giữa promoter và các gen mã hoá enzym. Operator quyết địmh RNA polymerase không lyên kết hay lyên kết với promoter và di chuyển dọc theo các gen (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002). Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac trong vi khuẩn E.coly. Trích dẫn từ Bài giảng sinh học phân tử, Bùi Trang Việt, 2002. Ngƣời ta gọi một nhóm gen với các chức năng lyên hệ cùng với promoter và operator là operon. Operon chỉ có ở procaryote; sự tập hợp các gen trong operon giúp các gen lyên hệ biểu hiện nhanh chóng (do sự thay đổi môi trƣờng), vì chúng đƣợc kiểm soát chỉ bởi một “nút đóng mở” duy nhất (đó chính là operator). Trƣớc operon lacZ là gen điều hoà I, gen này mã hoá repressor, tức protein có vai trò kìm hãm sự biểu hiện gen. Hoạt động của operon Lac đƣợc chứng minh nhƣ sau: Khi có glucose (và không có lactose), gen điều hoà I hoạt động (I có promoter riêng) để tạo ra repressor; repressor nhận biết và lyên kết với operator, cản sự lyên kết gen điều hoà Gen điều hoà Vùng cấu trúc gen của lac operon cấu trúc gen của cấu trúc gen của cấu trúc gen của 7 của RNA polynerase và promoter. Khi có lactose (và không có glucose), lactose lyên kết với repressor và làm biến đổi hình thể của repressor, do đó repressor không lyên kết với operator: operon Lac mở, RNA polymerase lyên kết với promoter và trƣợt dài theo các gen của operon; mRNA (mã hoá cho cả 3 enzym) đƣợc tạo thành và đƣợc dịch mả thành các polypeptide riêng biệt. Với hỗn hợp glucose và lactose, E.coly dùng glucose trƣớc, sự dùng lactose bị đàn áp: đó là sự “kìm hãm dị hoá”. Khi glucose giảm, ngƣời ta chứng minh cAMP gia tăng và cố định trên một protein gọi là CAP (catabolyte gen activator protein) hay CRP (cAMP recepter protein). phức hợp cAMP- CAP cố định trên promoter và làm tăng khả năng lyên kết của RNA polymerase với promoter. Nhằm duy trì sự tồn tại của các vector bacteriophage trong tế bào chủ, thông thƣờng E.coly dùng để biến nạp đƣợc cải tiến thành các chủng chủ theo các hƣớng cơ bản là loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế vì các hệ thống này sẽ can thiệp vào sự sao chép của DNA lạ trong tế bào vi khuẩn khi đó DNA lạ sẽ bị phân giải và thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm làm tăng lƣợng plasmid tích luỹ trong tế bào. Thông thƣờng ngƣời ta sẽ gây đột biến trên gen endA (endA-) là gen mã hóa cho endonuclease I. Việc mất endonuclease này sẽ làm tăng sản lƣợng plasmid và cải thiện chất lƣợng DNA chiết tách bằng các phƣơng pháp sinh hoá chuẩn (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002). 2.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp Có hai phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E.coly khả nạp 2.3.3.1 Phƣơng pháp vật lý Phƣơng pháp này sử dụng xung điện tác động lên tế bào chủ từ đó gây nên sự thay đổi trong cấu trúc tế bào và tính thấm ở màng. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là tiến hành nhanh chóng, tế bào sau xử lý có hiệu suất biến nạp cao. 2.3.3.2 Phƣơng pháp hoá học Là phƣơng pháp sử dụng hoá chất xử lý tế bào (có thể kết hợp với nhiệt độ). Phƣơng pháp này thực hiện lâu, hệ số biến nạp của tế bào sau xử lý thấp nhƣng đơn giản và dễ thực hiện. Hiện nay để tạo tế bào E.coly khả nạp theo các phƣơng pháp hóa học, ngƣời ta có thể tiến hành theo 3 cách khác nhau Thứ nhất, phƣơng pháp Hanahan cho phép tạo những tế bào E.coly khả nạp có hiệu quả biến nạp cao (5x108 khuẩn lạc/µg plasmid DNA). 8 Thứ hai, phƣơng pháp Inoue dễ lặp lại hơn phƣơng pháp Hanahan và tạo ra các tế bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 1x108 đến 3x108 khuẩn lạc/µg plasmid DNA. Thứ ba, phƣơng pháp Calcium chloride, phƣơng pháp này đƣợc phát triển từ hơn 30 năm qua và tạo ra các tế bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 5x106 đến 2x107 khuẩn lạc/µg plasmid DNA. Thông thƣờng, ngƣời ta xử lý tế bào vi khuẩn trong dung dịch muối lạnh của kim loại hoá trị II nhƣ CaCl2, MgCl2, RbCl2. Việc biến nạp DNA plasmid vào E.coly đạt hiệu quả cao hơn khi có sự hiện diện của ion Ca2+ ở nhiệt độ thấp (0-4oC). Ion Ca2+ có thể gây ra những xáo trộn trên màng tế bào làm cho DNA xâm nhập tế bào E.coly dễ dàng hơn. Giai đọan sốc nhiệt kế tiếp để kých thích sự chuyển của phân tử DNA vào trong tế bào, môi trƣờng dƣỡng chất đƣợc thêm vào sau đó cho phép tế bào phục hồi và DNA tiến hành sao mã, dịch mã để tạo ra các protein tƣơng ứng. 2.3.4 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế bào chủ. Điều này giúp tế bào chủ có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có kháng sinh. Do đó, khi trải E.coly biến nạp lên môi trƣờng chứa kháng sinh, chỉ tế bào nào đã thu nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới có thể sinh trƣởng. Các tế bào không tiếp nhận plasmid sẽ không sinh trƣởng đƣợc. Tuy vậy, kết quả của phản ứng nối giữa đoạn DNA và vector đã đƣợc mở vòng là một tổ hợp bao gồm nhiều kết quả nối, đó là vector-vector, vector-DNA chèn. Do vậy, có những thể biến nạp có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa kháng sinh nhƣng không mang gen mục tiêu. Việc sàng lọc các thể biến nạp mang gen mục tiêu đƣợc tiến hành theo nhiều phƣơng pháp. Phổ biến là các phƣơng pháp sau: Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp dựa trên việc quan sát màu xanh hay trắng của khuẩn lạc bằng α-complementation. Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai (lai khuẩn lạc). Xác định gen đích trên plasmid trong thể biến nạp bằng PCR (PCR khuẩn lạc). Thông thƣờng, để phân tích một dòng ngƣời ta dung hai phƣơng pháp là khảo sát plasmid tái tổ hợp bằng cách tạo bản đồ cắt giới hạn và giải trình tự toàn bộ đoạn gen đích. Nhiều plasmid vector (ví dụ họ pUC, pBluescript, pGem và các plasmid có nguồn gốc từ các họ plasmid này) mang một đoạn ngắn của DNA E.coly chứa những trình tự điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase (đầu amin). Việc chèn vào đoạn 9 này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức năng của lacZ. Các vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của β- galactosidase. Hiện tƣợng α-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của β- galactosidase E.coly (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức năng. Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng đƣợc phát hiện vì việc xuất hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng có chứa cơ chất tạo màu X-gal (5-Bromo- 4- chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside). Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt bởi β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl. Dẫn xuất này, đến lƣợt nó, bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh. Để có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kých hoạt là IPTG (đồng phân của galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò nhƣ là chất kých hoạt của gen lacZ. Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin. Do đó, hiện tƣợng α-complementation không thể xảy ra. Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng. 2.3.5 Chiết tách DNA plasmid Với mong muốn thu nhận một số lƣợng lớn các bản sao plasmid, ngƣời ta sử dụng bộ máy di truyền của các tế bào chủ. Thông qua đó, plasmid đƣợc sao chép với số lƣợng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trƣởng của tế bào chủ. Trƣớc hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trƣờng chọn lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào. Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh. Các quy trình tách chiết đều có các bƣớc chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối cùng là tủa DNA. Tuỳ theo từng phƣơng pháp cụ thể ngƣời ta sẽ sử dụng các tác nhân khác nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết. Có nhiều phƣơng pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ, chẳng hạn nhƣ: Phƣơng pháp nhiệt độ cao Phƣơng pháp Lythium Phƣơng pháp SDS-kiềm 10 2.3.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.3.6.1 Giới thiệu về phản ứng PCR Là phản ứng nhân nhanh số lƣợng mẫu DNA nhờ thực hiện cơ chế tự nhân đôi DNA invitro. Quá trình này đƣợc tiến hành nhờ enzym DNA polymerase. Phản ứng PCR gồm các bƣớc chủ yếu sau: Bƣớc 1: Biến tính mẫu DNA thành chuỗi đơn ở nhiệt độ 94-95oC Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp giữa Primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào trình tự của Primer, thông thƣờng khoảng 40 – 50oC. Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA đƣợc tiến hành ở 72oC Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lập lại nhiều lần. Hình 2.2 Các chu kỳ của phản ứng PCR. 2.3.6.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR Taq polymerase Taq polymerase là enzym chính tham gia vào quá trình tổng hợp các mạch DNA. Enzym này còn có khả năng phân hủy primer bắt cặp vào mạch DNA tạo điều kiện cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới. Taq polymerase đƣợc phân lập từ vi khuẩn suối nƣớc nóng thermus aquaticus. Enzym này có tính chịu nhiệt rất cao, nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94o C. Nhiệt độ tối ƣu cho sự hoạt động của Taq polymerase khoảng 70 – 72o C. Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzym này quá thấp không đủ lƣợng enzym xúc tác cho phản ứng sẽ tạo ra sản phẩm PCR không mong muốn. 2 4 6 8 1 0 Biến tính Ủ bắt cặp Kéo dài Lặp lại n lần 94–95o C 72 o C 45-56o C 11 Các nucleotid tự do dNTP – deoxyribonucleotide-5-triphosphate. Đây là hổn hợp 4 loại nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên lyệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA mới. Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng sẽ làm phát sinh các lỗi sao chép của Taq polymerase. Primer (mồi) Primer (mồi) là những đoạn olygoribonucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung với trình tự của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Chiều dài của mồi thƣờng từ 10 – 35 nucleotide. Mồi khởi đầu cho quá trình tổng hợp mạch mới. Khi mồi bắt cặp vào mạch khuôn thì Taq polymerase bắt đầu kéo dài chuỗi DNA. Dung dịch đệm Thành phần quan trọng nhất trong dung dịch đệm là ion Mg2+. Nó rất cần thiết cho quá trình lyên kết các dNTP, xúc tác cho enzym Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của các DNA mạch kép. Nồng độ MgCl2 tối ƣu là 1.5mM. Môi trƣờng đệm KCl đã và đang đƣợc áp dụng rộng rãi, cũng có thể là chất đệm hữu dụng cho phản ứng PCR. Tuy nhiên trong nhiều trƣờng hợp môi trƣờng này không hiệu quả nên ngƣời ta vẫn lựa chọn sử dụng Mg2+. Với những đoạn DNA giàu G, C ngƣời ta thƣờng dùng dung dịch đệm amonium sulphate nhằm làm giảm những sản phẩm đƣợc tạo một cách không hoàn toàn trong PCR với Taq . Phƣơng pháp này dùng phát hiện những đoạn gen có kých thƣớc nhỏ chạy trên gel acrylamide. DNA khuôn Phản ứng PCR tối ƣu trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu cho thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu, mẫu khảo cổ, vi khuẩn bị hấp khử trùng…Lƣợng DNA khuôn mẫu sử dụng có khuynh hƣớng giảm từ 1µg xuống khoảng 100ng nhằm giảm việc tạo các sản phẩm phụ không mong muốn. Số chu kỳ phản ứng Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vƣợt qúa 40 chu kỳ. Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lƣợng DNA mẫu ban đầu. Nếu ít chu kỳ thì 12 sản phẩm PCR thu đƣợc ít. Nếu kéo dài tiến trình PCR thì hiệu quả khuyếch đại giảm hẳn do: sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự mỏi mệt của các enzym dùng trong phản ứng. Nhiệt độ và pH Những enzym đƣợc sử dụng trong phản ứng rất mẫn cảm với nhiệt độ. Theo Trần Thị Dân (2000), sự thay đổi nhiệt độ có ảnh hƣởng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt của sản phẩm PCR. Để biến tính thì khoảng nhiệt độ từ 94 – 95o C là thích hợp nhất, nếu nhiệt độ cao hơn sẽ làm mất hoạt lực của Taq polymerase. Để kéo dài chuỗi ngƣời ta sử dụng nhiệt độ 72o C, đây là nhiệt độ tối ƣu cho Taq polymerase hoạt động. Khoảng nhiệt độ dùng để bắt cặp là khó xác định nhất, khoảng nhiệt độ này đƣợc xác định tùy từng loại primer. Primer có trình tự càng nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng cao. Thông thƣờng nhiệt độ bắt cặp từ 50 – 56o C. Hầu hết các enzym, mẫu DNA đƣợc đệm trong môi trƣờng tối ƣu có pH = 8. Ở pH này DNA rất ổn định. Trong môi trƣờng axit các bazơ purin rất dể bị tách khỏi sợi DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ. Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8. Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục Bảng 2.1 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục 1. Có nhiều sản phẩm chuỗi ngắn không đặc trƣng Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp Gia tăng thời gian ủ bắt cặp Gia tăng thời gian kéo dài chuỗi Gia tăng nhiệt độ kéo dài chuỗi lên đến 74 – 78o C Giảm nồng độ KCl buffer đến 0,7 – 0,8 nM, giữ nguyên nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 nM. Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 mM, nhƣng giữ nguyên nồng độ dNTP Giảm lƣợng mồi Giảm lƣợng DNA khuôn Giảm lƣợng tap polymerase 13 2. Có nhiều sản phẩm chuỗi dài không đặc trƣng Giảm thời gian ủ bắt cặp Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp Giảm thời gian kéo dài Giảm nhiệt độ kéo dài xuống còn 62 – 68o C Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – 2 X, vẫn giữ nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 mM Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 nM, nhƣng vẫn giữ nguyên nồng độ dNTP Giảm lƣợng mồi Giảm lƣợng DNA khuôn Giảm lƣợng Taq polymerase 3. Không có sản phẩm nào cả Đảm bảo rằng các thành phần PCR đã cho vào phản ứng Đổi dung dịch dNTP do dNTP rất nhạy cảm với việc cấp rã đông. Gia tăng hàm lƣợng mồi Gia tăng hàm lƣợng DNA khuôn mẫu Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10o C 4. Sản phẩm PCR ít Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp đến mức có thể Gia tăng lƣợng mồi Gia tăng lƣợng DNA khuôn Gia tăng lƣợng Taq polymerase Ứng dụng của PCR PCR có nhiều ứng dụng trong ngành sinh học. PCR với cặp primer đƣợc thiết kế riêng sẽ phân lập đƣợc đoạn DNA mong muốn. Từ đây nó đƣợc ứng dụng trong các lĩnh vực: Y khoa: dùng chuẩn đoán bệnh do các tác nhân là vi khuẩn hoặc virus. Nông nghiệp: dùng trong chọn giống và xác định các yếu tố gây bệnh trên cây trồng. Dùng chuẩn đ