Đồ án Tách dòng và xác định trình tự gene kháng thể tái tổ hợp kháng tế bào lympho bệnh ung thư vú

Ung thư biểu mô tuyến nang Ung thư biểu mô chế tiết ở thanh niên 2.10. Ung thư biểu mô chế tiết rụng đầu 2.11. Ung thư với thành phần dị sản Loại vảy (dạng biểu bì) Loại tế bào thoi Loại dạng sụn và dạng xương Loại hỗn hợp 2.12. Các loại khác Bệnh Paget vú. 1.2.4. Điều trị bênh ung thư vú Có rất nhiều tiến bộ trong việc xác định sớm và trị liệu ung thư vú thành công. Khi tìm thấy khối u trong vú, người phụ nữ có cơ hội lựa chọn về cách trị bệnh cho thích hợp với tình trạng của mình. Đối với mỗi người bệnh có những phương pháp trị liệu thích hợp. Các phương pháp điều trị chính cho bệnh ung thư vú là: Giải phẫu: tuỳ từng giai đoạn của bệnh mà bác sĩ có thể giải phẫu cắt bỏ một phần (lumpectomy , Partical Mastectomy, Segmental Mastectomy) hay phải giải phẫu cắt bỏ toàn thể vú ( Total or Simple Mastectomy, Modified Radical Mastetomy). Cũng có trường hợp phải giải phẫu hạch bạch huyết (lymph Node Dissection) để cắt bỏ các hạch bạch huyết ở dưới nách. Quang tuyến trị liệu ( radiation therapy): sử dụng năng lực quang tuyến X cao độ để giết chết tế bào ung thư. Cách trị liệu này được dùng để ngăn chặn ung thư tăng trưởng trước khi giải phẫu, hay tiêu diệt tế bào ung thư còn sót lại sau cuộc giải phẫu. Quang tuyến trị liệu thường được sử dụng sau lumpectomy hay partical mastectomy, nhưng đôi khi cũng được dùng sau khi làm total masectomy hay modified radical mastectomy nếu ung thư quá lớn hay có nhiều hạch ở nách bị ung thư. Quang tuyến trị liệu được chia làm nhiều ngày, bệnh nhân ung thư vú thường được chiếu quang tuyến khoảng từ sáu đến bảy tuần. Hoá chất trị liệu (chemotherapy): sử dụng các dược liệu đặc biệt để tiêu diệt những tế bào ung thư. Hoá chất trị liệu thường được dùng thêm với với việc giải phẫu, quang tuyến trị liệu hay dùng để chống ung thư khi nó tái phát hay lây lan. Nhiều loại hoá chất được dùng trị ung thư vú, thông thường nhất là chất adriamycin, epirubucin, cytoxan, 5-FU, taxol. Taxotere, xeloda, navelbine... có thể dùng riêng rẽ hay tổng hợp. Trị liệu qua kích thích tố (hormonal therapy): trị ung thư bằng cách ngăn chặn hay thêm kích thích tố vào cơ thể. Rất nhiều ung thư vú tăng trưởng dưới sự kích thích của các kích thích tố nữ. Nếu chế ngự được các kích thích này, các tế bào ung thư có thể ngưng phát triển hay bị tiêu huỷ. Một phương pháp điều trị mới đối với bệnh nhân ung thư nói chung và bệnh ung thư vú nói riêng là sử dụng các kháng thể, đặc biệt là kháng thể đơn dòng và kháng thể tái tổ hợp. Kháng thể không chỉ được sử dụng để chẩn đoán sớm bệnh ung thư thông qua việc phát hiện kháng nguyên cuả tế bào ung thư mà còn được sử dụng để tạo ra các phân tử tái tổ hợp có tác dụng làm tan các khối u giúp điều trị hiệu quả bệnh ung thư. 1.3.KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ 1.3.1. Kháng nguyên Thuật ngữ kháng nguyên (antigen – Ag) dùng để chỉ một chất có khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch khi được đưa vào cơ thể của một động vật thích hợp hoặc một chất có khả năng phản ứng với một kháng thể hoặc một tế bào của hệ thống miễn dịch. Như vậy, tất ca những chất tự nhiên hoặc tổng hợp được hệ thống miễn dịch nhận biết đều được gọi là kháng nguyên. Sự liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể hay giữa kháng nguyên và tế bào lympho luôn mang tính đặc hiệu cao. Tuy nhiên, không phải toàn kháng nguyên tham gia vào kích thích hệ thống miễn dịch mà chỉ có một phần nhất định của kháng nguyên gọi là quyết định kháng nguyên hay epitop, mới liên kết với kháng thể hoặc tế bào lympho. Mỗi epitop khoảng 6-8 acid amin với trọng lượng phân tử khoảng 750 dalton. Phần tương ứng với quyết định kháng nguyên nằm trên mỗi kháng thể gọi là vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop, còn phần tương ứng trên tế bào lympho là thụ thể. Sự nhận biết giữa kháng nguyên và kháng thể hoặc giữa kháng nguyên và các thụ thể của tế bào có thẩm quyền miễn dịch mang tính đặc hiệu cao. Điều đó có nghĩa là một kháng nguyên A chỉ có thể được nhận biết bởi một kháng nguyên anti – A hoặc chỉ có thể nhận biết bởi một loại tế bào lympho có thụ thể liên kết đặc hiệu với kháng nguyên A. Kháng nguyên trong tự nhiên rất đa dạng, chủ yếu dựa vào cấu trúc hoá học ( kháng nguyên protein, lipid, acid nucleic), dựa theo nguồn gốc (kháng nguyên đồng loại, đa loài, tự kháng nguyên) và vi sinh vật (vi khuẩn, virus). Trong số các loại kháng nguyên đó thì kháng nguyên protein và polysaccharid là hai nhóm kháng nguyên lớn và quan trọng nhất. 1.3.2. Kháng thể Định nghĩa: Kháng thể (antibody) là một loại protein có đặc tính chống lại các thể vi khuẩn gây bệnh. Ngày nay, nó được gọi là kháng thể miễn dịch (immunoglobulin, kí hiệu là Ig) hay kháng thể đặc hiệu. Bản chất và tính chất của kháng thể: Như chúng ta đã biết thì bản chất của kháng thể là protein, nên các tác nhân hoá, lý như nhiệt độ, acid, kiềm làm biến tính protein thì cũng có thể phá huỷ kháng thể. Hoạt tính kháng thể phụ thuộc vào pH môi trường và nhiều yếu tố khác ( Amon sulfat, natri sulfat...) vì thế người ta đã sử dụng tính chất này để tinh khiết kháng thể. Hai đặc tính quan trọng của kháng thể là khả năng phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên và khả năng biểu hiện như một kháng nguyên, tức là kích thích kháng thể chống lại chính nó- kháng kháng thể. Có thể tạo kháng thể kháng từng loại Ig (IgA, IgG, IgM...) hoặc khán từng cấu trúc của phân tử Ig (mảnh Fab hoặc Fc). Cấu trúc của kháng thể: Tất cả các kháng thể đều có cấu trúc giống nhau gồm một hay nhiều đơn vị (monomer) hợp thành. Mỗi đơn vị là một phân tử protein chứa 4 chuỗi polypeptid. Hai chuỗi nhẹ, ngắn, kí hiệu là L và hai chuỗi nặng, dài, ký hiệu là H được gắn với nhau bởi cầu disulfua (S-S). Trình tự acid amin ở kháng thể giống hệt nhau theo từng đôi chuỗi nặng và từng đôi chuỗi nhẹ. Cả phân tử có cấu tạo đối xứng. Cấu trúc phân tử Ig điển hình được trình bầy tại hình 1. Cấu tạo của kháng thể Chuỗi nhẹ: Có trọng lượng phân tử 25.000, chứa khoảng 211-221 acid amin. Ở tất cả các lớp globulin miễn dịch đều có hai loại chuỗi nhẹ, chuỗi nhẹ kappa và chuỗi nhẹ lambda. Mỗi phân tử Ig chỉ chứa hoặc hai chuỗi nhẹ lambda hoặc hai chuỗi nhẹ kappa mà không bao giờ chứa cả hai loại. Mỗi chuỗi nhẹ Ig chứa hai vùng acid amin. Một vùng có trình tự acid amin có thể thay đổi gọi là vùng biến đổi, ký hiệu là VL. Vùng còn lại có trình tự acid amin không thay đổi gọi là vùng cố định, hiệu là CL, vùng này nằm ở phía đầu cacboxyl (-COOH) của phân tử. Trình tự acid amin vùng cố định của chuỗi nhẹ luôn giống nhau ở tất cả các lớp kháng thể. Ngược lại, trình tự acid amin của vùng biến đổi luôn khác nhau kể cả ở các Ig do cùng một tế bào sinh ra. Chuỗi nặng: có trọng lượng phân tử khoảng 50.000, chứa khoảng 450 acid amin. Có 5 loại chuỗi nặng là: mu, gamma, alpha, delta, epsilon ứng với 5 lớp kháng thể là IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Mỗi chuỗi nặng chứa 4 vùng acid amin, một vùng biến đổi và 3 vùng cố định. Cũng như chuỗi nhẹ, vùng biến đổi của chuỗi nặng nằm ở phần đầu amin, ký hiệu là VH. Vùng cố định nằm ở đầu cacboxyl và có trình tự acid amin giống nhau ở tất cả globulin miễn dịch thuộc cùng một lớp, ký hiệu là CH1, CH2, CH3. Vùng nằm giữa CH1, CH2 của chuỗi nặng gọi là khớp nối làm cho phân tử có cấu tạo hình chữ Y, đây là nơi dễ bị tác động của enzyme phân giải protein (papain). Nhìn chung, phân tử kháng thể được chia làm hai phần: Fab là phần dễ kết tinh phản ứng với các tế bào của hệ thống miễn dịch qua các thụ thể của các tế bào. Do đó, nếu kháng thể được cố định trên vi khuẩn bằng phần Fab thì nó sẽ liên kết với các tế bào thực bào bằng phần Fc. 1.3.2.1. Kháng thể đơn dòng. Phương pháp tạo kháng thể đơn dòng do Kohler hoặc Milstein đề xuất năm 1975 đã cho phép ta tạo ra các tế bào lai có khả năng sản xuất các kháng thể đơn dòng có tính đặc hiệu loài cao, có khả năng chọn lọc các kháng nguyên đích đặc hiệu. Tuy nhiên, kỹ thuật lai tế bào này rất tốn kém về thời gian, tiền bạc và thiết bị chuyên dụng đắt tiền, phải sử dụng đến động vật thí nghiệm, đồng thời phải tạo ra một lượng lớn các tế bào dung hợp mới có thể chọn được những tế bào tốt nhất có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng. Lượng cơ chất có thể sử dụng để gây miễn dịch trên động vật là có hạn và sự đa dạng tối đa có thể có đối với phản ứng miễn dịch động vật là có hạn và sự đa dạng tối đa có thể có đối với phản ứng miễn dịch của động vật là 6.106 các kháng thể khác nhau. Quan trọng hơn, không thể thay đổi tính chất của kháng thể do các tế bào lai tạo ra. Mặt khác các kháng thể được tạo ra bằng kĩ thuật này có thời gian tồn tại ngắn trong điều kiện in vitro, và thường gây ra phản ứng dị ứng khi sử dụng cho người vì các kháng thể này đều có bản chất từ động vật. Sự quan tâm tới việc tách và biểu hiện các gene kháng thể đã được chú trọng sau khi Kohler và Milstein tạo kháng thể đơn dòng bằng kĩ thuật dung hợp tế bào năm 1975. Kỹ thuật tạo kháng thể tái tổ hợp dựa trên những hiểu biết về cấu trúc và chức năng của kháng thể, đặc tính sinh học của quá trình nhân bản thực thể khuẩn, những kĩ thuật mới về DNA và tạo ra đột biến. Sau khi xác định được trình tự vùng hay biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của nhiều kháng thể khác nhau, các mồi là các đoạn oligonucleotid bảo thủ được tổng hợp để nhân các gene của các kháng thể mới. Kỹ thuật PCR đã được sủ dụng để nhân bản các gene từ mARN. Kháng thể đơn dòng được ứng dụng trong: Chuẩn đoán và điều trị bệnh ung thư Tạo chất ức chế miễn dịch trong điều trị các bệnh tự miễn dịch và đào thải các mảnh ghép. Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và ức chế sự tích tụ neurotphil để giảm sự huỷ hoại mô trong bệnh viêm màng não do vi khuẩn. Trong điều trị bệnh nhồi máu cơ tim cũng như việc ngộ độc thuốc... Do những giá trị của việc sử dụng rộng rãi kháng thể đơn dòng mà sản xuất kháng thể đơn dòng đang trở thành một lĩnh vực mới đầy hứa hẹn. 1.3.2.2. Kháng thể tái tổ hợp và ứng dụng Công nghệ kháng thể tái tổ hợp bao gồm việc thu nhận các gene kháng thể từ các tế bào nguồn, nhân bản và tách dòng các gene trong các vector thích hợp, biến nạp các vector vào tế bào chủ để biểu hiện một lượng kháng thể đủ lớn có hoạt tính kháng thể mong muốn. Các kỹ thuật bổ trợ như việc sàng lọc các dòng tế bào mang các kháng thể mong muốn từ một “thư viện” lớn các dòng đã tách được. Các kháng thể tái tổ hợp có thể tách dòng từ bất kì loài động vật tạo kháng thể nào nếu có được đoạn mồi hoặc các proble lai thích hợp. Khả năng thao tác với các gene kháng thể cho phép tạo ra kháng thể mới trong điều kiện in vitro. Điều này có thể thực hiện ở mức toàn bộ vị trí kết gắn bằng việc kết hợp chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, hoặc cũng có thể thao tác trên các vùng CDR riêng biệt. Các vùng thay đổi cũng có thể nối kết với các trình tự có các đặc tính khác, đó là các phân tử kháng thể - độc tố sử dụng trong việc điều trị các tế bào khối u. Vì các đoạn Fab và Fc nhỏ hơn nhiều so với toàn bộ phân tử kháng thể nên chúng rất thích hợp trong y học và các ứng dụng khác. Một ưu thế khác là các kháng thể tái tổ hợp có thể biểu hiện trong cơ thể chủ mới. Một trong cơ thể chủ để tổng hợp kháng thể tái tổ hợp là E.coli. Do những ưu điểm nổi bật của nó: tế bào phát triển nhanh và rẻ. Nhiều vector có thể sử dụng để tách dòng và biểu hiện các gene đã tách dòng. DNA có thể đưa trực tiếp vào E.coli (biến nạp) và bằng việc nhiễm vào thực thể khuẩn (quá trình chuyển nhiễm). Cấu trúc gene của một đoạn kháng thể (Fab và ScFv) có thể được đánh giá nhanh và có nhiều phương pháp chọn lọc khác nhau. Đương nhiên, việc mở rộng qui mô để sản xuất một lượng lớn các kháng thể tái tổ hợp trong E.coli dễ dàng hơn nhiều so với việc tạo sinh khối các tế bào lai trong qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng bằng việc dung hợp tế bào. 1.3.2.3. Các phương pháp tạo kháng thể Kháng thể được tạo ra bằng các phương pháp khác nhau, ngoài các phương pháp thông thường, hiện nay nhà nghiên cứu còn tạo kháng thể bằng công nghệ gene. Có thể tóm tắt các phương pháp tạo kháng thể như sau: Tách từ huyết thanh (serum) Sản xuất kháng thể từ các tế bào lympho B trong điều kiện in vitro Kỹ thuật dung hợp tế bào ( kháng thể đơn dòng, hybridoma method) Kỹ thuật bộc lộc trên thực thể khuẩn (phage display) Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng động, thực vật chuyển gene. 1.4. VECTOR TÁCH DÒNG 1.4.1. Khái niệm vector tách dòng Vector là một phân tử DNA có kích thước nhỏ, cho phép gắn các gene cần thiết, và có khả năng tự nhân lên không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào. Các vector thường có dạng vòng, chứa nhiều gene có nhiều đặc tính khác nhau, có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, mượn bộ máy của tế bào vi khuẩn để tạo ra nhiều bản sao giống hệt vector ban đầu. Vector còn được gọi là phương tiện vận chuyển gene. Như vậy, phân tử DNA mạch kép có khả năng tự sao chép trong tế bào vật chủ, có thể gắn vào phân tử này một hoặc vài đoạn DNA khác nguồn gốc tạo nên phân tử DNA tái tổ hợp dùng để tạo dòng được gọi là vector tách dòng. Sự tách dòng (cloning) là để thu nhận gene hay một trình tự DNA tinh sạch với hàm lượng lớn. Có nhiều loại vector khác nhau như: plasmid, phage, cosmid, BAC,YAC...Tuỳ thuộc vào kích thước đoạn DNA cần tạo dòng để lựa chọn loại vector thích hợp. Các vector tách dòng có thể mang các đoạn DNA có kích thước từ vài trăm bp đến 1Mb. Vector có 3 đặc tính cơ bản: Có khả năng xâm nhập vào tế bào. Có điểm mở đầu để tái bản tức là có khả năng tự tái bản tích cực, không phụ thuộc sự sao chép của bộ gene tế bào chủ Các thể biến nạp phải dễ dàng được chọn lọc và sinh trưởng tốt trên môi trường đặc. Khả năng chọn lọc được mã hoá bởi các gene chọn lọc, thường là đặc tính kháng với chất kháng sinh. Ngoài ra vector sẽ được xem là càng mạnh khi càng có thêm các ưu điểm sau đây: Có kích thước nhỏ để có thể thu nhận được tối đa lượng DNA, dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và sao chép nhanh. Tồn tại qua nhiều thế hệ trong tế bào vi khuẩn và ít xáo trộn đối với trao đổi chất của tế bào chủ. Mang các vị trí nhận biết duy nhất của nhiều loại enzyme giới hạn và vị trí đó nằm trong các gene chọn lọc, khi đoạn DNA ngoại lai được chèn vào thì gene chọn lọc bị bất hoạt Trong số các loại vector hiện có thì plasmid được sử dụng phổ biến do dễ dàng nhân lên trong tế bào vi khuẩn có kích thước nhỏ (1kb-200kb). Các thế hệ plasmid ngày càng được cải tiến và mang các đặc tính mới thuận lợi cho việc tách dòng. 1.4.2. Plasmid pCR 2.1 Để tách dòng gene mã hóa cho kháng thể kháng tế bào lympho bệnh ung thư vú, chúng tôi sử dụng plasmid pCR2.1. Đây là một vector thế hệ mới đang được sử dụng phổ biến, có ưu điểm nổi bật là có thể gắn trực tiếp sản phẩm pCR vào vector đã được cắt mở vòng do có sẵn hai đầu dính, mỗi đầu có bazơ Timin. Vector pCR 2.1 có kích thước 3,9kb, mang điểm khởi đầu tái bản của plasmid pUC nên có khả năng nhân lên với số lượng rất lớn trong tế bào E.coli. Để có thể chọn lọc dễ dàng các tế bào có mang nó, vector được thiết kế mang hai gene kháng lại chất kháng sinh: kanamycin và ampicillin, nhờ vậy vi khuẩn chủ có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa một trong hai hay cả hai loại kháng sinh trên, pCR 2.1 được gắn thêm operon- lac có tácdụng chuyển hoá đường lactoza, sau vị trí promoter là đoạn lacZa mã hoá cho146 acid amin đầu tiên của enzyme b- galactosidase, vùng cắt gắn đa vị được thiết kế trên đoạn này là 15 vị trí cắt duy nhất của enzyme giới hạn: Hind III, Kpn I, Sac I, BamH I, Spe I, Bst X I, Eco RV, Not I, Ava I, Pae R7I, Xho I, Nsi I, Xba I, Apa I và hai vị trí cắt giới hạn của EcoRI. Khi đoạn DNA lạ được chèn vào một trong các vị trí trên sản phẩm của gene b- galactosidase tạo ra sẽ không có hoạt tính enzyme làm cho cơ chất X- gal có trong môi trường không được chuyển hoá, kết quả là xuất hiện các khuẩn lạc có màu trắng trên môi trường thạch. Dựa vào dấu chuẩn này có thể phát hiện các tế bào vi khuẩn mang vector tái tổ hợp với hiệu quả rất cao. Một ưu điểm nữa của pCR2.1 là có mang promoter của thực khuẩn thể T7 và vị trí gắn mồi xuôi và ngược của thực khuẩn thể M13, nhờ đó có thể phiên mã được đoạn ARN antisense và đọc trình tự đoạn DNA ngoại lai. \Vị trí và thành phần của vector pCR2.1 được thể hiện qua bảng sau. Thành phần Vị trí Gen LacZ 1- 57 Sp6 promotor 239-255 Vị trí tạo dòng 269- 381 T7 promotor 388-407 F1 ori 572 – 986 Gene kháng Kanamycin 987-2114 Gene kháng Ampicillin 2133- 2992 ColEl ori 3182- 3765 Vị trí các thành phần chính của vector pCR2.1 II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Tách lớp tế bào: Từ mẫu bệnh phẩm đã có (biết chính xác mắc bệnh ung thư vú), tiến hành tách lớp tế bào chỉ lấy những tế bào bạch cầu và tinh sạch. Sử dụng kĩ thuật Phage Display để chọn lọc các dòng mang kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu tế bào lympho từ bệnh ung thư vú Tách dòng và xác định trình tự gene đoạn kháng thể đã chọn lọc. 2.2.VẬT LIỆU 2.2.1. Sinh phẩm Mẫu dùng cho thí nghiệm: Là thư viện kháng thể phage có khoảng 1010 dòng tế bào mang các gene mã hoá các kháng thể tái tổ hợp. Thư viện này có thể kháng lại bất kì kháng nguyên nào. Để thu nhận mẫu kháng thể kháng lại tế bào tách từ máu bệnh nhân ung thư vú, Phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào động vật đã sử dụng thư viện này để sàng lọc với các lympho bào tách từ máu bệnh nhân mắc bệnh ung thư vú. Vì vậy, ở đây chúng tôi chỉ trình bày phần tách dòng và xác định trình tự nucleotid của gene mã hoá kháng thể tái tổ hợp kháng lại lympho bào tách từ bệnh nhân ung thư vú. Để tách dòng và xác định trình tự gene mã hóa kháng thể tái tổ hợp này, chúng tôi tiến hành nhân bản PCR với cặp mồi LABF/LABR. Vector tách dòng TA- TOPO cloning Kit, Enzyme giới hạn EcoR I do hãng Invitrogen cung cấp. 2.2.2. Hoá chất Các hoá chất được sử dụng nghiên cứu về sinh học phân tử chủ yếu do hãng Sigma cung cấp: Cao nấm men (Yeast extract), Trypton, Agaroza, Agar- bacto, X-gal các chất kháng sinh Ampicillin, Kanamicin, EDTA, Isopropanol, Ethanol 700, Isoamylalcohol và các hoá chất khác. 2.2.3. Trang thiết bị Lò vi sóng (Sam sung). Máy lắc ổn nhiệt 370C. Máy khuấy từ (RotoLab, OSI). Máy li tâm microcentifuge (Eppendorf CHLB Đức). Tủ lạnh sâu – 1200C, -750C (Sanyo, Nhật Bản) Máy khuấy trộn Vortex (Rotolab, OSI). Máy đo độ pH (Metter Toledo). Bể ổn nhiệt (Techne, OSI). Máy hút chân không (Speed Vac Sc 110A- Savant). Máy soi chụp ảnh gel (Phamarcia). Cân phân tích 10-4g (Metter Toledo). Bộ nguồn điện di (Bio – Rad). Tủ cấy vô trùng (Sanyo). Pipetman các loại (Gilson). Nồi khử trùng (Nhật Bản). Cân điện tử 10-1g (Ohaus) Máy li tâm lạnh (Avanti TM 30 centifuge Beckman). Bộ điện di DNA (Advance Tech, Nhật Bản). Máy quang phổ (Hewlett Packard, Mỹ). 2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 là phương pháp nhân nhanh 1 đoạn DNA trong ống nghiệm. Theo lý thuyết có 3 đoạn acid nucleic, 1 đoạn đôi DNA được khuếch đại và 2 sợi primer oligonucleotid sẽ chạy xung quanh đoạn DNA, thêm vào là thành phần protein (DNA polymerase, dNTP và dung dịch muối). Cơ sở của phương pháp PCR: chính là đặc tính hoạt động của DNA polymerase. Chúng chỉ có khả năng tổng hợp 1 mạch mới từ khuôn kể từ 1 mồi (là một trình tự DNA ngắn) đã bắt cặp sẵn với khuôn. Trong thực nghiệm, mồi là những trình tự bổ sung chuyên biệt cho đoạn DNA cần tổng hợp. Sơ đồ phản ứng dây chuyền nhờ DNA polymerase (PCR) được tóm tắt như sau: Mỗi chu kỳ của phản ứng PCR bao gồm 3 bước sau: Biến tính phân tử DNA (denaturation): tách rời 2 sợi của phân tử DNA mạch kép ở nhiệt độ 940C- 950C trong 30giây đến 1 phút. Lai (hybridization) : cặp mồi đặc hiệu bắt cặp với sợi khuôn ở nhiệt độ 400C- 700C kéo dài từ 30 giây đến 1 phút (nhiệt độ thấp hơn Tm của các mồi). Kéo dài (elongation): DNA polymerase xúc tác cho phản ứng kéo dài chuỗi ở 720C. Thời gian tuỳ thuộc vào trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30giây đến 1 phút. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lại làm tăng đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Thành phần: Nước thanh trùng MgCl2 100mM Buffer 10X DNTP Primer sense & antisense DNA Taq polymerase Dụng cụ: Máy PCR Ống nghiệm Pipep Ống eppendorf Chú ý: Khi nhiệt độ bắt cặp của phản ứng PCR thích hợp thì khi điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% thì chỉ có một băng với kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết. Còn nếu nhiệt độ sai khác thậm chí chỉ 1-20C thì có xuất hiện các băng phụ. Tuy nhiên, hầu hết phản ứng PCR là không đặc hiệu, không chỉ có băng DNA với kích thước mong muốn mà chúng còn xuất hiện nhiều băng phụ. Kết quả này có thể giải thích bởi 1 số lý do như sau: hoặc do mồi thiết kế là không đặc hiệu với đoạn gene đó, hoặc do điều kiện phản ứng PCR chưa tối ưu nên mồi không chỉ bắt cặp với đoạn gene mong muốn mà còn có thể bắt cặp với các đoạn gene khác trong quá trình nhân bản PCR. Tuy nhiên với việc thay đổi các điều kiện của phản ứng PCR thường không nhận được kết quả khác biệt với kết quả này. Trình tự gene mã hoá cho kháng thể kháng lại tế bào lympho ở bệnh nhân ung thư vú chưa được xác định, nên việc mong đợi sản phẩm PCR đặc hiệu đối với các gene đã có trình tự là rất khó. Để khắc phục vấn đề này, chúng tôi đã tiến hành theo phương thức “Tách dòng phân tử” nghĩa là: sản phẩm PCR thu được với nhiều sản phẩm phụ khác nhau vẫn được gắn vào vector tách dòng pCRÔ 2.1, sau đó biến nạp vào E.coli chủng DH5a Sản phẩm phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% 2.3.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCRÔ 2.1 Mục đích: sau khi nhân bản đoạn gene này và kiểm tra điện di trên gel agarose 1% thì cần tách đoạn gene này. Quá trình tách dòng được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm phản ứng PCR vào vector tách dòng pCRÔ 2.1 (invitrogen) với mục đích tạo vector tái tổ hợp mang đoạn DNA cần tách dòng và sau đó biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5a. Nguyên tắc: Phản ứng dựa vào đặc tính xúc tác hình thành liên kết photphodiester của enzyme Topoisomerase nối sản phẩm PCR có thêm Adenin ở đầu 3’ (do đặc tính của enzyme Taq polimerase) vào vector tách dòng đã mở vòng xoắn có đầu đính là Timin. Hỗn hợp phản ứng gắn được được ủ 30 phút ở 220C (nhiệt độ tối ưu cho enzyme Topoisomerase hoạt động). Chú ý: Bên cạnh sản phẩm đặc hiệu có thể còn có những sản phẩm không mong muốn. Vì vậy, bước tiếp theo là biến nạp sản phẩm gắn vào tế bào E.coli nhằm khuếch đại các dòng plasmid tái tổ hợp và chọn lọc được dòng plasmid mang sản phẩm PCR mong muốn. Sau đó tiến hành tách plasmid chọn dòng và xác định trình tự nucleotid. 2.2.3. Biến nạp DNA Plasmid vào tế bào E.coli DH5a Vector pCR 2.1 sau khi được gắn đoạn gene kháng thể tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli chủng DH5a có trong bộ kít tách dòng “TA cloning kit” của hãng Invitrogen. Sau khi được biến nạp, nhờ sự trợ giúp của bộ máy tổng hợp của tế bào vi khuẩn, plasmid tái tổ hợp tạo ra được số lượng lớn các bản sao. Quá trình này bao gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp. * Tạo tế bào khả biến: Tế bào E.coli được nuôi qua đêm trong môi trường LB lỏng Lấy dịch nuôi cấy + môi trường LB nuôi lắc ở 370C, 200 vòng/phút. Kiểm tra mật độ tế bào sao cho OD600 đạt 0,5-0,7 Chuyển dịch tế bào sang ống Eppendorf vô trùng, để trên đá 10 phút Ly tâm thu sinh khối (5000v/p,40C trong 10 phút). Loại dịch nổi. Rửa tế bào bằng CaCl2 100mM ở 40C. Hoà tế bào vào CaCl2 100mM, giữ trên đá ít nhất 1giờ trước khi biến nạp. * Biến nạp: Trộn sản phẩm lai gắn với tế bào trong ống Eppendorf sau đó để trên đá (30 phút) Sốc nhiệt ở 420C, thời gian 1 phút, sau đó đặt ngay ống tế bào vào đá và để 2 phút. Bổ sung môi trường LB lỏng, sau đó nuôi lắc (200v/p) ở 370C trong 1 giờ. Cấy trải trên đĩa petri có môi trường thạch LB chứa Am, X-gal và IPTG. Nuôi ở tủ ấm ở 370C qua đêm. Sau khi biến nạp, dịch tế bào được đem cấy trên môi trường LB có thạch, được bổ sung kháng sinh Ampicillin, IPTG, X- gal. Trong môi trường chọn lọc này, các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp sẽ có màu trắng trong khi các khuẩn lạc mang vector pCR2.1 không mang đoạn DNA đã được nhân lên nhờ phản ứng PCR sẽ có màu xanh. Các khuẩn lạc phát triển được trên môi trường có kháng sinh Ampicillin là do chúng có mang vector plasmid có chứa gene kháng Ampicillin. Những khuẩn lạc có màu xanh xuất hiện do vector pCR2.1 có mang operon Lac hoạt động bình thường, do đó tạo nên protein LacZa, kết hợp với phần còn lại được mã hoá trong genome của tế bào E.coli chủng DH5a để tạo thành b- galactosidase, enzyme này thuỷ phân cơ chất X- gal có mặt trong môi trường để tạo nên sản phẩm có màu xanh. Trong khi đó, các khuẩn lạc có màu trắng hình thành từ các tế bào mang plasmid có operon Lac không hoạt động do đoạn DNA ngoại lai xen vào vị trí của gene cấu trúc LacZa dẫn đến không tổng hợp được enzyme b-galactosidase cần cho sự chuyển hoá X- gal. Trên đĩa petri, khuẩn lạc xanh trắng xuất hiện riêng rẽ. Như vậy, việc lựa chọn các khuẩn lạc trắng để tách plasmid có thể loại bỏ được phần lớn các trường hợp không mong muốn mặc dù không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều có thể mang vector plasmid tái tổ hợp chứa đoạn DNA cần thiết. Để khẳng định một cách chắc chắn hơn, chúng ta cần thực hiện các bước kiể