Đồ án Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotics

Mục lục Chương 1 Mở đầu . 1 Chương 2: Tổng quan tài liệu 3 2.1. Probiotics. ..3 2.1.1. Lịch sử nghiên cứu Probiotics. 3 2.1.2. Định nghĩa Probiotics .. 4 2.1.3. Cơ chế tác động của probiotics. 4 2.1.3.1. Sản sinh ra các chất kháng khuẩn 5 2.1.3.2. Cạnh tranh vị trí gắn kết 6 2.1.3.3. Cạnh tranh nguồn dinh dưỡng 7 2.1.3.4. Kích thích miễn dịch 8 2.1.4. Vi sinh vật probiotic: 8 2.1.4.1.Vi khuẩn lactic: 8 2.1.4.2.Nấm men:. 11 2.1.5. Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn 13 2.1.6. Ứng dụng của probiotics 13 2.1.6.1. Trong thực phẩm và dược phẩm 13 2.1.6.2. Nông nghiệp 18 2.1.6.2.1. Nuôi trồng thủy hải sản. 18 2.1.6.2.2. Chăn nuôi 22 2.2. Công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics: 26 2.3. Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 29 Phân loại 29 Đặc điểm hình thái và sinh lý 30 Đặc tính sinh hóa 30 2.3.4. Hoạt tính probiotic của Lactobacillus acidophilus 31 2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: 32 2.4.1. Nguồn cacbon 33 2.4.2..Nguồn nitơ 38 2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật 42 Ảnh hưởng của pH 42 Ảnh hưởng nhiệt độ..43 Ảnh hưởng oxy 44 Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 46 Vật liệu nghiên cứu 46 Đối tượng nghiên cứu 46 Môi trường nuôi cấy 46 Hóa chất 46 Thiết bị và dụng cụ 48 Phương pháp nghiên cứu 48 Quan sát đặc hình thái của Lactobacillus acidophilus 48 Quan sát đại thể L. acidophillus 48 Quan sát vi thể 48 Tối ưu hóa môi trường lên men L. acidophilus.49 Khảo sát sự phát triển vi khuẩn L. acidophilus trong hai môi trường rỉ đường và dịch chiết dứa 49 3.2.2. 2. Tối ưu hóa môi trường 51 3.2.2.2.1. Thực nghiệm theo kế hoạch thực nghiệm đầy đủ các yếu tố .52 3.2.2.2.2. Kiểm tra sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fishe 55 Tối ưu hóa thực nghiệm bằng phương pháp lên dốc 56 Xác định đường cong tăng trưởng L.acidophilus trong môi trường MRS và môi trường dịch chiết dứa tối ưu bằng phương pháp đo độ đục ..56 Xác địng sự thay đổi pH theo thời gian của môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu trong quá trình lên men.56 Xác định hàm lượng đường giảm theo thời gian của hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu 57 So sánh khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị của dịch nuôi cấy L. acidophilus trong môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu 58 Chương 4 : Kết quả và biện luận 61 Quan sát hình thái vi khuẩn L. acidophilus 61 Kết quả tối ưu hóa môi trường lên men .62 Kết quả khảo sát hai môi trường rỉ đường và dịch chiết dứa 62 4.2.2. Tối ưu hóa môi trường 64 4.2.2.1. Kết quả thực nghiệm theo kế hoạch đầy đủ các yếu tố  64 4.2.2.2. Kết quả kiểm tra sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher  . .66 4.2.2.3. Kết quả tối ưu hóa thực nghiệm bằng phương pháp lên dốc.66 Kết quả xác định đường công sinh trưởng vi khuẩn L. acidophilus trong hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu 69 Kết quả xác định sự thay đổi pH theo thời gian của hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu. 71 Kết quả xác định hàm lượng đường giảm theo thời gian của hai môi trừơng lên men MRS và dịch chiết dứa tối ưu 72 Kết quả So sánh khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị của dịch nuôi cấy L. acidophilus trong môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu. .73 Tính toán kinh tế cho môi trường dịch chiết dứa tối ưu..77 Chương 5: Kết luận và kiến nghị 79 5.1. Kết luận 79 5.2. kiến nghị 80 Tài liệu tham khảo Phụ lục Danh mục các kí hiệu viết tắc : Cfu : colony-forming unit ATP: Adenosin triphospha MT: môi trường EMP : Embden - Meyerhof - Paras pathway LDL-C : Low density lipoprotein cholesterol HDL-C : High density lipoprotein cholesterol Danh mục bảng Thành phần hóa học huyết thanh 34 Thành phần hóa học dịch chiết dứa 37 Thành phần hóa học trong từng thành phần của hạt thóc. 39 Thành phần hóa học gạo lức xay ..40 Thành phần hóa học của Malt 41 Số liệu dựng đường chuẩn OD và mật độ tế bào L.acidophillus.50 Kế hoạch thực nghiệm và đầy đủ các yếu tố 52 Các mức của ba yếu tố tối ưu 53 Thành phần các môi trường theo kế hoạch thực nghiệm 54 Số liệu dựng đường chuẩn glucose 57 Kết quả thực nghiệm và đầy đủ các yếu tố 65 Kết quả tính bước chuyển động của các yếu tố 66 Kết quả thí nghiệm theo hướng leo dốc ..67 Danh mục hình và sơ đồ Lactobacillus acidophillus dưới kính hiển vi..30 Vi khuẩn Lactobacillus acidophillus trên môi trường MRS agar.61 Vi khuẩn Lactobacillus acidophillus quan sát dưới kính hiển vật kính 100X. 62 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa OD và mật độ tế bào của vi khuẩn L.acidophillus ..........................................................................................63 Đồ thị biểu diễn đường công sinh trưởng của L.acidophillus trong hai môi trường rỉ đường và dịch chiết dưa.64 Đồ thị biểu diễn đường công sinh trưởng của vi khuẩn L.acidophilus trong hai môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu......71 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH theo thời gian của hai mơi trường lên men MRS và dịch chiết dứa tối ưu.....72 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng đường và OD.....73 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường thay đổi theo thời gian lên men của môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ư......73 Môi trường dịch chiết dứa tối ưu không sinh H2O2.75 11. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị (E.coli) của dịch nuơi cấy L. acidophilus trên mơi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu.76 12. Sơ đồ cơng nghệ sản xuất chế phẩm probiotics 28 13 . Sơ đồ chuyển hĩa đường của vi khuẩn L. acidophilus31 Phụ lục 1 - Số liệu Số liệu dựng đường chuẩn OD và mật độ tế bào L. acidophilus OD 0.176 0.346 0.49 0.621 0.738 0.844 1.066 1.23 1.336 1.47 Tế bào x107 (cfu/ml) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 8.8 10 11.3 12.5 Số liệu đường cơng sinh trưởng L. acidophilus trên mơi trường rỉ đường và dịch chiết dứa: Thời gian (giờ) 5 8 16 20 21 Mật độ tế bào x 107 (cfu/ml) Rỉ đường 3.8 7.1 10.6 13.5 11.8 Dứa 4.1 10.9 17.9 17.6 16 Số liệu đường cơng sinh trưởng L. acidophilus nuơi cấy trên hai mơi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu Thời gian ( giờ) 0 5 8 16 18 20 24 Mật độ tế bào X108 (cfu/ml) MRS 0.2 0.6 0.9 6.8 6.6 6.5 6.3 Dứa 0.2 0.4 0.9 5.8 6.3 6.2 6.2 Số liệu thay đổi pH của mơi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu nuơi cấy bởi L. acidophilus: Thời gian 0 2 5 8 16 18 20 24 pH MRS 6.5 6.3 6 5.1 3.8 3.8 3.8 3.8 Dứa 6.5 6.25 5.9 5.3 4 3.94 3.91 3.91 Số liệu dựng đường chuẩn đường glucose: Nồng đđđộ đường (mg/ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 OD 0.242 0.473 0.679 0.894 1.01 Số liệu đường tổng thay đổi theo thời gian của mơi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu nuơi cấy bởi L. acidophilus Thời gian 0 5 8 16 18 20 24 Hàm lượng đường (mg/ml) Dứa 50 42.7 37.7 23.86 23.9 23 23 MRS 23.7 12.57 10.23 0.93 0.85 0.82 Số liệu xác định khả năng kháng của dịch nuơi cấy L. acidophilus trong mơi trường dịch chiết dứa tối ưu. Môi trường Mẫu đối chứng (OD) Mẫu Chỉnh pH (OD) Mẫu Không chỉnh pH (OD) MRS 1.034 0.750 0.005 Dịch chiết dứa tối ưu 0.923 0.80 0.008 Phụ lục 2 - Một số hình ảnh Hình : Dứa Hình : Các mơi trường thành phần tối ưu . Hình : xác định khả năng kháng của L. acidophilus đối với E. coli Định lượng đường tổng NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN .. ...Điểm bằng số: Điểm bằng chữ:. TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2009 Tài liệu tham khảo [1]. Nguyễn cảnh (2004), Quy hoạch thực nghiệm, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM. [2]. Bùi Aùi (2005), Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM. [3]. Nguyễn Đức Lượng và cộng sự ( 1996), Vi sinh vật công nghiệp - tập 2, Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM [4]. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn (2006), Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM [5]. Lê Thanh Mai và cộng sự ( 2007), Các phương pháp phân tích ngnàh công nghệ lên men, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội. [6]. Nguyễn Bá Mùi (2002), Nghiên cứu phụ phẩm dứa ủ chua làm thức ăn gia súc - luận án Tiến sĩ Nông Nghiệp, Trường Đại Học Nông Nghiệp 1. [7]. Lê Hà Vân Thư (2008), Nghiên cứu quy trình tạo đồ uống lên men từ gạo lức , Luận văn thạc sĩ, Trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM [8]. Bùi Quang Tề (2006), Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. [9]. Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành ( 2007), Công nghệ sinh học - tập 5, NXB Giáo Dục. [10]. ALTIOK D ( 2004), Kinetic Modelling of Lactic Acid Production from Whey, Izmir Institute of Technology, Turkey [11]. Amed T và cộng sự ( 2006), Influence of Temperature on Growth Pattern of Lactococcus lactis, Streptococcus cremoris and Lactobacillus acidophilus Isolated from Camel Milk, Biotechnology 5 (4): 481-488. [12]. Arbakariya, B.A và cộng sự ( 2007), Optimization of Growth medium for Efficient Cultivation of Lactobacillus salivarius i 24 using Response Surface Method, Malaysian Journal of Microbiology, Vol 3(2) 2007, pp. 41-47 . [13]. Brunt. J và Austin. B ( 2005), Use of a probiotics to control lactococcosis and streptococcosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), Journal of Fish Diseases 2005, 28, 693–701. [14]. Dworkin M và cộng sự ( 2006)ï, The Prokaryotes, Springer. [15]. Farzanfar A ( 2006), The use of probiotics in shrimp aquaculture, Willem van Leeuwen, Iran [16]. FULLE R (1989), Probiotics in man and animals, Journal of Applied Bacteriology 1989, 66, 365-378. [17]. Glenn R. Gibson và cộng sự ( 2007), Probiotics and prebiotics in infant nutrition, Proceedings of the Nutrition Society (2007), 66, 405–411. [18]. Gokhale D và cộng sự ( 2008), Utilization of Molasses Sugar for Lactic Acid Production by Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii Mutant Uc-3 in Batch Fermentation, Applied and environmental microbiology, Jan. 2008, p. 333–335. [19]. Goktepe I và cộng sự ( 2006), Probiotics in Food Safety and Human Health, Taylor & Francis. [20]. Inamoto T và Watanabe T ( 1998), Effect of a comercial preperation of lactobacilli and steptococclli on the performane weand piglets, Bull.Akita Pref. Coll. Agr. 24:69 - 72. [21]. Kumura. H và cộng sự ( 2004), Screening of Dairy Yeast Strains for Probiotics Applications, J. Dairy Sci. 87:4050–4056. [22]. Laitila. L và cộng sự ( 2004 ), Malt sprout extract medium for cultivation of Lactobacillus plantarum protective cultures, Letters in Applied Microbiology 2004, 39, 336–340. [23]. Liew Siew Ling và cộng sự ( 2006), Improved Production of Live Cells of Lactobacillus rhamnosus by Continuous Cultivation using Glucose-yeast Extract Medium, The Journal of Microbiology, August 2006, p.439-446. [24]. Marco J. van Belkum và cộng sự (2007), Structure–function relationship of inducer peptide pheromones involved in bacteriocin production in Carnobacterium maltaromaticum and Enterococcus faecium, Microbiology (2007), 153, 3660–3666. [25]. Michail S và Philip M. Sherman, Probiotics in Pediatric Medicine, Humana press, Totowa [26]. Michail S (2005), The Mechanism of Action of Probiotics, Wright State University School of Medicine, The Children’s Medical Center, Dayton, Ohio [27]. Nicole M de Roos và Martijn B Katan (2000), Effects of probiotics bacteria on diarrhea, lipid metabolism, and carcinogenesis: a review of papers published between 1988 and 19981–3, Am J Clin Nutr 2000;71:405–11. [28]. OMAR S và SORAYA SABRY (1991), Microbial biomass and protein production from whey, Journal of Islamic Academy of Sciences 4:2, 170-172. [29]. Parrondo J và cộng sự ( 2003), A Note – Production of Vinegar from Whey, Journal of the institute of brewing, 09(4), 356–358. [30]. Peter J. Huth, Charles I. Onwulata, (2008), Whey Processing, Functionality and Health Benefits, Wiley - Black well. [31]. Purivirojkul W và cộng sự ( 2006), Competition on Using Nutrient for Growth between Bacillus spp. and Vibrio harveyi, Kasetsart J. (Nat. Sci.) 40 : 499 - 506. [32]. Rashid R ( 2008 ), Optimization and modeling of lactic acid production from pineapple waste, Universiti Teknologi Malaysia. [33]. Racêvičiūtė-Stupelienė A và cộng sự (2007), Influence of probiotics preparation yeasture-w on the productivity and meat quality of broiler chickens, Biotechnology in Animal Husbandry 23 (5-6), p 543 - 550. [34]. Sanders ME và Klaenhammer† TR (2001 ), Invited Review: The Scientific Basis of Lactobacillus acidophilus NCFM Functionality as a Probiotic, J. Dairy Sci. 84:319–331 [35]. Salminen S và cộng sự, Lactic Acid Bacteria, Marcel Dekker, New York. [36]. Senok A. C và cộng sự, Probiotics: facts and myths, Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, College of Medicine and Medical Science, Arabian Gulf University. [37]. Sejong OH và cộng sự ( 1995 ), Optimizing Conditions for the Growth of Lactobacillus casei YIT 9018 in Tryptone-Yeast Extract-Glucose Medium by Using Response Surface Methodology, Applied and environmental microbiology, Nov. 1995, p. 3809–3814. [38]. Soo Kee Lee và cộng sự ( 2006), Aspergillus oryzae as Probiotic in Poultry - A Review, International Journal of Poultry Science 5 (1): 01-03. [39]. Tamime A (2005), Probiotic Dairy Products, Blackwell Publishing Ltd, USA [40]. VERSCHUERE L và cộng sự ( 2000), Probiotic Bacteria as Biological Control Agents, Microbiology and molecular biology reviews, Dec. 2000, p. 655–671. [41]. Vicente J và cộng sự (2007), Effect of Probiotic Culture Candidates on Salmonella Prevalence in Commercial Turkey House, epartment of Poultry Science, Center of Excellence for Poultry Science, University of Arkansas. [42]. Università Urbaniana ( 2005 ), Probiotic and prebiotic new food, Rome [43]. YUAN KUN LEE và SALMINEN S ( 2009), Handbook of probiotics and prebiotics, Wiley [44]. Wang Y và cộng sự ( 2005), Fermentation pH and Temperature Influence the Cryotolerance of Lactobacillus acidophilus RD758, J. Dairy Sci. 88:21–29. [45]. World Health Organization (WHO) (2001), Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria, [46]. World Gastroenterology Organisation (2008), Probiotics and prebiotics. [47]. Zaazou. M.H. và cộng sự ( 2007), A Study of the Effect of Probiotic Bacteria on Level of Streptococcus Mutans in Rats, Journal of Applied Sciences Research, 3(12): 1835-1841.. [48]. Ye cherng industrial products, co., LTD, Probiotics in aquaculture. [49]. [50]. [51]. [52]. [53]. [54]. [55].