Giáo trình Sinh hoá miễn dịch (Phần 2)
Phản ứng ngưng kết
ðiều kiện xảy ra phản ứng là phải có kháng nguyên hữu hình ñó là
những kháng nguyên có kích thước lớn như hồng cầu, vi sinh vật.
Kháng nguyên hữu hình có epitop bề mặt có thể liên kết chéo với các
kháng thể, tạo thành cụm và nhìn ñược bằng mắt thường.
Phản ứng ngưng kết nhạy hơn phản ứng kết tủa nên ñược dùng ñể
ñịnh tính và bán ñịnh lượng kháng thể trong huyết thanh.
Cách tiến hành phản ứng ngưng kết.
- Pha loãng kháng thể có ñộ pha loãng : 1/20; 1/40; 1/80.
- Cho kháng nguyên hữu hình vào các ống nghiệm chứa kháng thể trên.
- Hiệu giá kháng thể là ñộ pha loãng cao nhất mà vẫn xảy ra ngưng kết Ví
dụ trong ống thứ 3 có ñộ pha loãng cao nhất nhưng vẫn phát hiện ñược
phản ứng ngưng kết ta nói hiệu giá của hyết thanh là 80.
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Giáo trình Sinh hoá miễn dịch (Phần 2), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ch có 200 lymphoT.
Hình 6.4:Quá trình g n virus vào CD 4
S tương tác c a HIV v i phân tư CD 4.
Khi HIV xâm nh p vào t bào, thành ph n gp120 c a ph c h p
glucoprotein c a virus có ái l c v i b m t c a t bào CD 4. Theo cách ñó,
glucoprotein này kéo virus vào t bào T CD 4, t bào tua, ñ i th c bào, và t t
c nh ng t bào bi u hi n th th CD 4 cũng có th liên k t v i HIV nhưng
th p hơn ñ i v i t bào lymphoT CD 4.
Trư c khi dung h p, gp120 c a virus ph i g n v i m t co receptor
trên màng c a t bào ch . Có m t vài ph n t khác ho t ñ ng như co
receptor cho HIV ñi vào, h u h t trong s chúng là các th th chemokine.
Trong ñó chemokine quan tr ng tương tác v i HIV là CCR5, bi u hi n t
bào tua, ñ i th c bào và t bào T CD 4 và CXR4 bi u hi n trên các t bào T
ñã ñư c ho t hoá.
6.5. Các phương pháp chu n ñoán HIV
Chu n ñoán huy t thanh h c
Th i kỳ ân tính v i HIV.
ðó là th i kỳ trong máu chưa xu t hi n kháng th ñ c hi u v i virus
HIV.
Th i kỳ huy t thanh âm tính dài hay ng n tùy thu c vào con ñư ng
lây nhi m và dao ñ ng t 1,5 tháng ñ n 14 tháng
Th i kỳ xét nghi m dương tính v i HIV.
Lúc này trong máu xu t hi n kháng th ñ c hi u v i HIV. Tuy nhiên
kháng th này không có kh năng b o v cơ th . Vì virus HIV ñã thay
ñ i kháng nguyên b m t khi n cho kháng th không th trung hòa
ñư c. V i kháng th t o thành ch có ý nghĩa v m t chu n ñoán mà
thôi.
Như v y ý nghĩa c a vi c xét nghi m huy t thanh dương tính ñã
kh ng ñ nh b nh nhân ñã b nhi m HIV và có kh năng lây lan sang
ngư i khác
Ngày nay khoa h c k thu t ñã cho phép chu n ñoán nhi m HIV v i
xác su t cao. Hai phương pháp ñư c s d ng ñó là chu n ñoán huy t thanh
h c và phân l p virus HIV.
Qui trình g m sàng l c ban ñ u b ng xét nghi m h p th mi n d ch
liên k t enzym (ELISA). N u k t qu (+), xét nghi m ELISA ñư c làm l i,
n u v n dương tính, k t qu ñư c xác nh n b ng m t phương pháp khác,
thư ng là Western blot ho c xét nghi m mi n d ch huỳnh quang.
Test huy t thanh dương tình xu t hi n sau 3 tháng k t khi b lây
nhi m, có nhi u ngư i ph i sau 6 tháng. ð xác ñ nh nhi m HIV ngư i ta
ti n hành xét nghi m như sau:
Xét nghi m tr c ti p :
Phát hi n chính b n thân HIV, bao g m các xét nghi m kháng
nguyên (kháng nguyên p24), nuôi c y HIV, xét nghi m acid nucleic c a t
bào lympho máu ngo i vi, và ph n ng chu i polymerase.
Các xét nghi m máu :
H tr ch n ñoán và giúp ñánh giá m c ñ suy gi m mi n d ch, g m
ñ m t bào T CD4+ và CD8+, t c ñ máu l ng, ñ m t bào máu toàn ph n,
microglobulin beta huy t thanh , kháng nguyên p24...
Các xét nghi m phát hi n b nh lây qua ñư ng tình d c và nhi m trùng
cơ h i như: giang mai, viêm gan B, lao
Chu n ñoán b ng phân l p virus.
Ch n ñoán b ng phân l p virus cho k t qu ch c ch n nhưng khá ph c t p,
giá thành ñ t.
Vi c phân l p virus HIV thư ng ñư c ti n hành trong các trung tâm nghiên
c u v i m c ñích nghiên c u hơn là ch n ñoán b nh.
M c ñích c a ch n ñoán virus HIV
ði u tra thăm dò ph c ph cho d ch v y t . Ví d như truy n máu,
ghép mô, ghép cơ quan, s d ng tinh trùng và tr ng ph ph cho th tinh
nhân t o.
ði u tra d ch t h c: th c hi n trên m t vùng ho c m t c ng ñ ng
không liên quan ñ n con ngư i c th .
Ch n ñoán nhi m HIV, xét nghi m b nh nhân ñ thông báo cho cá th
bi t v tr ng thái huy t thanh c a h có nhi m HIV hay không.
Thông báo k t qu xét nghi m.
Vi c thông báo k t qu xét nghi m là v n ñ tâm lý xã h i ph c t p ñã
ñư c qui ñ nh trong pháp l nh do Thư ng v qu c h i ban hành ngày 31
tháng 5năm 1995
Khi thông báo ph i ph thu c vào hàng lo t y u t ch quan và khách
quan c a ngư i b nh như:
Tình hình s c kh e c a ngư i b nh.
S hi u bi t c a ngư i b nh v căn b nh.
Nh ng v n ñ có liên quan ñ n gia ñình, con cái, cơ quan, công vi c
xã h i ...
Cơ quan ñư c thông báo phái có bi n pháp thích h p ñ chăm sóc
ñ ng viên nh ng ngư i b nh và ñ m b o nh ng quy n l i mà nhà
nư c cho h ñư c hư ng
6.6. ADIS v i ph n
T c ñ nhi n HIV ñ i v i ph n ngày càng gia tăng. Lúc ñ u t l
m c b nh nam gi i g p 10 l n ph n nhưng hi n nay g n b ng nhau.
ð i v i ph n ngoài ñi u chung v ADIS, còn có nh ng v n ñ ñ c
thù liên quan ñ n gi i tinh, ñ a v xã hôi, phong t c ...
T l ph n m c b nh các nư c nghèo, các nư c ñang phát tri n
ngày càng gia tăng. Ch y u là các nư c chưa thoát kh i nh ng t n t i v
quy n cơ b n là ph n bình ñ ng v i nam gi i.
Ph n chưa ñư c bình ñ ng v i nam gi i. HIV liên quan ñ n gái mãi
dâm, chính h là nh ng vector truy n b nh t ngư i này sang ngư i khác và
là nguyên nhân chính gia tăng t l m c bênh c a ph n
6.7. HIV ñ i v i tr em
T l tr sinh ra t m nhi m HIV và b nhi m HIV trung bình trên
toàn th gi i chi m 25% .
Nư c công nghi p phát tri n 14%, Châu phi 45%, Châu Á t 26 42%
Nư c ta tr em m c HIV năm 1999 là 1100 em 4 l n năm 1994. Hi n
nay trên th gi i có t i 1,2 tri u tr em dư i 15 tu i nhi m HIV
Nh ng nghiên c u g n ñây cho th y tr em b nhi m HIV trong th i
kỳ bú m ch có th x y ra khi m m i b nhi m trong th i kỳ cho con bú.
Còn các bà m b nhi m trư c ho c trong khi mang thai thì ít có kh năng
truy n HIV sang con.
Theo th ng kê c a t ch c th gi i cho th y 20% tr sinh ra v i HIV
s phát thành ADIS trong vòng 15 tháng sau khi sinh. Lâm sàng ADIS c a
tr là ch m phát tri n, b nh n m mi ng, viêm h ch lympho, viêm ph i,
tiêu ch y, gan và lách sưng to...T khi có tri u ch ng ñ n lúc ch t 5 tháng
Kho ng 30% tr em có m b nhi m HIV s b nhi m HIV, còn 70%
không b nhi m nhưng không bao lâu h l i tr thành tr mô côi.
Theo th ng kê năm 1994 có 10.000 tr em tr thành mô côi dư i 15
tu i t i năm 2000 có 415.000 tr sinh ra t cha m b HIV s có 95.000 tr
mô côi m , 190.000 m côi cha, 37.000mô côi lúc dư i 5 tu i.
Như v y trong công cu c phòng ch ng ADIS ngoài v n ñ y t
chuyên môn còn n i cu n lên v n ñ xã h i c n ph i ñ i ñ u như: Tr bán
dâm, tr th t h c, tr b bóc l t s c lao ñ ng, tr b kỳ th , ...khó có th nói
h t ñư c s nguy hi m c a căn b nh này.
M t s vi c c n ph i làm vì tr em :
Tìm cách ngăn ng a cho m c a h không lao vào con ñư ng nhi m HIV.
Giáo d c và dánh th c h b ng trách nhi m làm cha làm m v i con cái
Nêu cao tinh th n giáo gi c tr em t i các trư ng h c v tác h i c a
HIV/ADIS
Hư ng ñ n th c hi n các bi n pháp, chính sách và lu t l c a nhà nư c,
ñ m b o th ng l i chương trình qu c gia phòng ch ng ADIS
6.7. Thu c ñi u tr (AZT)
Hư ng nghiên c u ñi u tr
ði u tr theo nguyên nhân nhi m trùng cơ h i, theo hư ng này ch có
tác d ng làm gi m cơn ñau cho b nh nhân.
Ngăn c n s phát sinh c a virus HIV trong t bào lympho
Tăng cư ng s phát tri n c a t bào T CD4 là ñ i tư ng t n công c a
virus HIV, s d ng nh ng ch ph m ki u IFN ho c α,γ interleukin 2...
Thu c ñi u tr
Sau 12 năm sau khi HIV/AIDS xu t hi n, Úc và m t s nư c châu âu
như Pháp, ð c Ý, Hà lan...ñã dùng th lo i thu c th ký hi u là AZT v i
3500 ngư i ñi u tr theo 3 phác ñ khác nhau ñ ñánh giá k t qu
Phác ñ I: dùng m t mình AZT.
Phác ñ 2 dùng AZT + Dianozyn.
Phác ñ III dùng AZT v i Zancytabyn
T i 4/10/1995 công ty dư c ph m Anh ñã thông báo k t qu : Theo phác
ñ I, có 83% s ngư i nhi m HIV thoát ch t. Theo phác ñ II, có 90% và
theo phác ñ III là 88%... Như v y theo phác ñ II là kh quan hơn. Nhưng
giá thành r t ñ t !5000 U SD/1 ngư i trong 1 năm.
Cơ ch tác ñ ng c a AZT là ngăn c n s nhân lên c a virus HIV trong t
bào lympho T
Thu c Zidovudin v i cơ ch tác d ng c ch enzym sao chép ngư c
ARN ADN và ngăn ng a vi c truy n HIV t m mang thai sang con
Vacxin phòng ch ng HIV/AIDS
Vacxin ADN: Gép gen HIV vào ADN plasmid ñ t o ra vacxin
Vacxin dùng vector s ng: ngư i ta gép gen HIV vào gen c a virus
ho c vi khu n dùng làm vacxin. Sau ñó tiêm vào ngư i b nh theo cơ ch t o
ra kháng th ch ng HIV ñ g th i t o ra kháng th t n công virus và vi khu n
nói trên.
T t c các lo i vacxin nói trên ñang th nghi m typ 3
CHƯƠNG 7
M T S PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
D A TRÊN MI N D CH
Trong nh ng năm g n ñây, có nhi u xét nghi m ñ c hi u và r t nh y d a
trên k thu t hoá mi n d ch ñã ñư c ñưa vào trong xét nghi m y khoa v i m c
ñích ch n ñoán ñ có hư ng ñi u tr thích h p, tri n khai vacxin ñ phòng b nh
k p th i, tri n khai các bi n pháp v sinh d ch t h c ñ ngăn ng a lây lan c a
m n b nh. Nguyên lý c a chúng ñư c d a trên các ph n ng kháng nguyên
kháng th . Áp d ng nguyên lý này ñ xác ñ nh ñ c t trong th c ph m ñã ñư c
th c hi n trong kho ng 20 năm tr l i ñây. Hai nguyên nhân thúc ñ y áp d ng
rông rãi phương pháp này là vi c s n xu t ñư c kháng th ñơn dòng và vi c phát
tri n c a phương pháp ELISA. Vi c phát tri n ñư c phương pháp ELISA ñã góp
ph n quan tr ng ñưa phương pháp phân tích d a trên mi n d ch h c vào ng
d ng r ng rãi.
7.1. Ph n ng kháng nguyên và kháng th
Kháng nguyên và kháng th ñ c hi u c a nó có ch a c u trúc tương ng b
sung, chính vì th nó làm cho ph n quy t ñ nh kháng nguyên kh p r t khít v i v
trí g n trên kháng th . T i ñó ch ng ñư c n i v i nhau b ng nh ng liên k t y u
gi a các phân t .
7.1.1. Ph n ng thu n ngh ch và h ng s cân b ng
M t v trí c a kháng th ch k t h p v i môt epitop kháng nguyên, ph n
ng kháng nguyên kháng th là ph n ng thu t ngh ch và có th bi u di n như
sau:.
k1
KN + KT KN KT
k
2
Trong ñó: k 1 là h ng s cân b ng ph n ng thu n.
k 2 là h ng s cân b ng ph n ng ngh ch.
H ng s cân b ng ñư c bi u di n như sau
[KN − KT ] k
K = = 1
[KN ][KT ] k2
Ph n ng gi a kháng nguyên và kháng th x y ra dư i tác d ng c a nhi u
liên k t (Hình 7.1.)
Liên k t hydro.
liên k t tĩnh ñi n.
Liên k t Van der wals (liên k t gi a các ñám mây ñi n t ).
Liên k t k nư c.
Hình 7.1: L c hút gi a kháng nguyên kháng th
Nh n bi t ph n ng KN KT thông qua các ph n ng sau ñây
Ph n ng k t t a.
Ph n ng ngưng k t.
C ñ nh b th .
Ph n ng phát huỳnh quang.
Ph n ng g n enzyme.
7.1.2. Ph n ng k t t a
Khi kháng th ñ c hi u ph m ng v i kháng nguyên hoà tan m t n ng ñ
nh t ñ nh s xu t hi n k t t a nhìn th y b ng m t thư ng. Ph n ng này dùng ñ
phát hi n kháng nguyên hòa tan khi có kháng th ñ c hi u, ho c ñ phát hi n kháng
th khi có kháng nguyên hòa tan ñ c hi u
Ph n ng t i ưu khi ñ và tương ñ ng v n ng ñ kháng nguyên , kháng
th (hinh 7.2)
6.2.3. 6.66.3. Ph n ng ngưng k t.
PP + P6'
'
Hình 7.2:. ð th bi u di n m c k t t a ph thu c vào t l KT KN
KhikKk
Khi t l tương ñ ng s t o màng lư i t t nh t, n u th a kháng th
epitop kháng nguyên bão hoà nhưng không liên k t chéo ñư c ñư c v i
nhau thông qua g n v trí k t h p kháng nguyên. N u th a kháng nguyên
paratop kháng th bão hoà, nhưng không k t h p ñư c v i nhau thông qua
epitop.
7.1.3. Ph n ng ngưng k t
ði u ki n x y ra ph n ng là ph i có kháng nguyên h u hình ñó là
nh ng kháng nguyên có kích thư c l n như h ng c u, vi sinh v t.
Kháng nguyên h u hình có epitop b m t có th liên k t chéo v i các
kháng th , t o thành c m và nhìn ñư c b ng m t thư ng.
Ph n ng ngưng k t nh y hơn ph n ng k t t a nên ñư c dùng ñ
ñ nh tính và bán ñ nh lư ng kháng th trong huy t thanh.
Cách ti n hành ph n ng ngưng k t.
Pha loãng kháng th có ñ pha loãng : 1/20; 1/40; 1/80.
Cho kháng nguyên h u hình vào các ng nghi m ch a kháng th trên.
Hi u giá kháng th là ñ pha loãng cao nh t mà v n x y ra ngưng k t Ví
d trong ng th 3 có ñ pha loãng cao nh t nhưng v n phát hi n ñư c
ph n ng ngưng k t ta nói hi u giá c a hy t thanh là 80.
7.1.4. Ph n ng k t h p b th
V nguyên t c kháng nguyên hoà tan có ph n ng v i kháng th do ñó
s c ñ nh b th . Còn ngư c l i s có b th t do. Khi h th ng ch th c a
các h ng càu nh y c m như h ng c u c u (SRBC) ñư c thêm vào, m c ñ
phân hu h ng c u nh y c m (tan h ng c u nh y c m) s t l v i b th t do.
Dư vào k t qu xét nghi m ta k t lu n là m u âm tính hoăc dương tính.
Bư c 1: Chu n b hai h th ng (hinh 7.3):
H th ng xét nghi m bao g m: Kháng nguyên, kháng th .
H th ng ch th g m: Hông c u c u và kháng th kháng h ng c u c u.
B th
H th ng ch th Hê th ng xét nghi m
Hång cÇu
cõu(SRBC) Bæ thÓ
Kh¸ng thÓ
Kh¸ng thÓ kháng -
SRBC
Kh¸ng
nguyªn
Hình 7.4: H th ng xét nghi m và h th ng ch thi
Bư c 2: B sung b th vào h th ng xét nghi m (hình 7.5)
a) Kháng nguyên không ñ c hi u v i kháng th có b th t do
b)Kháng nguyên ñ c hi u v i kháng th không có b th t do (b th c
ñ nh)
Kh¸ng
Kh¸ng thÓ
thÓ
Kh ¸ng Kh¸ng
nguyªn nguyªn
a b
Hình 7.5: Ph n ng kháng nguyên kháng th có b sung b th
Bư c 3: B sung h th ng ch thi.
a) B th t do có ph n ng v i ch th (t o ph c kháng th h ng c u
c u kháng nguyên kháng h ng c u c u b th ) (hình 7.6a)
b) B th c ñ nh không có ph n ng v i ch th (do t o ph c h KN
KT BT) ( 7.6 b)
KT
HCC
KT, K HCC
KN
a b
Hình 7.6: B sung h th ng ch th
Bư c 4 : K t qu xét nghi m.
a) Ân tính: do không có kháng th c n xét nghi m, nên không có ph c KN
KT BT. Do ñó b th t do k t h p v i h ng c u nh y c m và x y ra hi n
tư ng tan máu (hình 7.7a).
b) Dương tính: Có kháng th c n xét nghi m, nên t n t i ph c KN KT BT.
Do ñó b th c ñ nh s không có s k t h p v i h ng c u nh y c m, k t qu
là không có hi n tư ng tan máu (hình 7.7b).
a b
Hình 7.7: K t qu xét nghi m
ng d ng c a phương pháp:
Phương pháp này ñư c ng d ng r ng rãi trong sàng l c lâm sàng.
ð c bi t là trong phép th ñ i v i xoán khu n trong bênh giang mai.
7.1.5. Các y u t nh hư n ñ n ph n ng kháng nguyên kháng th
nh hư ng c a kích thư c, n ng ñ c a kháng th .
nh hư ng c a l c ñ y gi a các kháng nguyên.
Tác d ng c a enzyme.
Tác d ng c a các ch t keo.
nh hư ng ñ c tính kháng nguyên.
nh hư ng c a pH, nhi t ñ , th i gian ph n ng.
7.2. K thu t huỳnh quang mi n d ch
7.2.1. Cơ s c a phương pháp
Trong k thu t này kháng th ho c kháng nguyên ñư c ñánh d u b ng
thu c nhu m huỳnh quang.
V nguyên t c: k thu t ñư c d a trên tính ch t c a thu c nhu m khi
ñư c kích thích b i b c x có bư c sóng thích h p s phát sáng:
Fluorescein phát quang màu vàng l c.
Rodamin phát quang cho màu ñ da cam.
Kháng th có g n thu c nhu m huỳnh quang g i là g i là kháng th
huỳnh quang hay kháng th ñánh d u
7.2.2. Hai phương pháp k thu t huỳnh quang mi n d ch
Phương pháp huỳnh quang MD tr c ti p (hình 7.8)
M c ñích c a phương pháp: Xác ñ nh vi sinh v t gây b nh trên bênh ph m,
Ví d như xác ñ nh Streptococcus pyrogenes t h ng b nh nhân
Các bư c ti n hành
C ñ nh tiêu b n trên phi n kính
Ph kháng th huỳnh quang kháng th lên
Cho kháng th huỳnh quang g n v i t bào
R a lo i kháng th không g n v i t bào
Quan sát dư i kính hi n vi huỳnh quang, ch có vi khu n g n ñ c hi u
v i kháng th huỳnh quang m i phát sáng và quan sát ñư c
Phương pháp huỳnh quang MD gián ti p
M c ñích
Phương pháp này thư ng dùng xác ñ nh kháng th trong th d ch c a
b nh nhân. Ví d xác ñ nh IgG kháng spirochet có trong huy t thanh ho c nư c
b t b nh nhân viêm l i. Phương pháp này nh y hơn phương pháp tr c ti p.
Các bư c ti n hành .
C ñ nh tiêu b n (kháng nguyên) trên phi n kính.
Cho kháng th huy t thanh b nh nhân ph n ng v i kháng nguyên (vi
khu n gây b nh).
Cho kháng th có ñánh d u huỳnh quang ñ kháng th ph n ng ñ c
hi u v i ph c h p kháng nguyên kháng th .
R a nh ng ph n không ph n ng ñ c hi u gi a kháng th huỳnh quang
v i ph c h p kháng nguyên kháng th .
Soi ñ c k t qu b ng ñèn huỳnh quang (ñèn UV).
Hình 6.8. K thu t huỳnh quang mi n d ch tr c ti p
Mô ph ng phương pháp huỳnh quang gián ti p
Bư c 1: C ñ nh tiêu b n trên phi n kính.
Bư c 2: Tráng kính vơí kháng th ñ c hi u ñ t o ph c h p KN KT.
Bư c 3: Tráng kháng th ñ c hi u v i kháng th có g n v i thu c nhu m
huỳnh quang.
Bư c 4: Soi ñ c k t qu b ng ñèn hyùnh quang (ñèn UV).
7.3. Thí nghi m mi n d ch phóng x
Nguyên t c :
V nguyên t c tương t như huỳnh quang mi n d ch, nhưng khác là
kháng nguyên ho c kháng th ñ ơc ñánh d u b ng ch t phóng x ( 126 I ). Thí
nghi m này do Rosalyn Yalow ñ ngh năm 1960 ñ xác ñ nh n ng ñ insulin
trong huy t tương. Nh phát minh này mà bà ñã nh n gi i thư ng Noben năm
1977. Ngày nay phương pháp này ñư c s dung ñ xác ñ nh hoocmon,
globulin mi n d ch, kháng nguyên c a virus
Các bư c ti n hành.
L y m t lư ng chính xác kháng nguyên có ñánh d u b ng ch t phóng x
(ví d 126 I )
Cho lư ng kháng nguyên ñánh d u nói trên tác d ng ñ c hi u v i lư ng
kháng th v a ñ .
R a s ch kháng ngyuyên ñánh d u không b t c p v i kháng th .
ðo ñ phóng x c a ph c ch t kháng nguyên ñánh d u kháng th (A)
Cũng thí nghi m như trên nhưng ñây ta thêm m t lư ng kháng nguyên
huy t thanh có nh ng ñ c tính tương t như kháng nguyên ñánh d u. Do
c nh tranh mà kháng nguyên này k t h p ñ c hi u v i kháng th , sau ñó
lư ng kháng th dư m i k t h p v i kháng nguyên ñánh d u.
R a nh ng kháng nguyên ñánh d u không b t c p v i kháng th
ðo ñ phóng x c a ph c kháng nguyên ñánh d u v i kháng th còn l i
(B)
T giá tr A&B ta tính ñư c n ng ñ c a kháng nguyên huy t thanh c n
nghiên c u.
7.4. K thu t ch t h p ph mi n d ch g n enzym (ELISA Enzyme
Linker Immunosorbent Assay)
Nh ng xét nghi m h p ph mi n d ch g n enzyme là k thu t khá nh y và
ñơn gi n, cho phép xác ñ nh kháng nguyên ho c kháng th m có n ng ñ r t
th p (kho ng 0,1 mg/ml). So v i phương pháp mi n d ch phóng x thì phương
pháp này ñơn gi n r ti n an toàn mà v n ñ m b o ñ chính xác. Các xét
nghi m ñư c ti n hành trên b n nh a polystyren có 96 gi ng ñáy b ng, th tích
m i gi ng kho ng 200 l.
Nguyên t c chung c a k thu t ELISA:
Nguyên t c chung c a k thu t ELISA là t o liên k t ñ c hi u gi a kháng
nguyên và kháng th .
S liên k t ñó cho phép xác ñ nh s có m t c a kháng th ho c kháng
nguyên. Ngư i ta s d ng kháng th g n c ng h p enzym sau ñó b sung cơ
ch t, enzym th y phân cơ ch t t o thành ch t làm thay ñ i màu dung d ch. Tùy
thu c vào cư ng ñ màu dung d ch ta suy ra n ng ñ kháng nguyên ho c
kháng th c n nghiêm c u.
Các enzyme thư ng dùng là: (galactosidase; glucoxydase; akanline
phosphotasen,...)
Ngoài ra ñ tăng ñ nh y c a phương pháp ngư i ta s d ng h th ng công
h p biotin avidin, biotin sprept.
H th ng c ng h p mi n d ch biotin avadin .
Biotin ( vitaminH) ñư c t ng h p t sinh v t ho c th c v t có tr ng lư ng
phân t kho ng 244Da . Biotin có ái l c v i avidin (là ch t có nhi u trong lòng
tr ng tr ng). Avidin có 4 v trí trên phân t liên k t v i biotin, và như th
biotin d dàng k t h p v i protein: kháng th , enzyme và các lo i kháng
nguyên khác. Phương pháp này nó s nâng cao ñ nh y c a xét nghi m ñ c
bi t là các xét nghi m mi n d ch mà kháng nguyên trong pha r n.
H th ng c ng h p mi n d ch biotin strept.
Ngư i ta cũng tìm th y ch t ho t tính tương t như avidin t x khu n và
như v y ta có h th ng c ng h p mi n d ch biotin strept trong xét nghi m
mi n d ch. H th ng c ng h p mi n d ch biotin strept (avidin) dùng trong xét
nghi m mi n d ch ñ c bi t. vai trò c a avidin và strept avidin có th thay ñ i
cho nhau. Ngày nay b kít này ñã ñư c ch t o t các hãng n i ti ng trên th
gi i..
Các kháng nguyên ho c kháng th c n xác ñ nh ñư c h p ph tr c ti p ho c
gián ti p lên b m t c a gi ng nh a. Sau ñó m t ph ng c a gi ng ñư c bao ph
b ng m t lo i ñ m ch a protein, thư ng là gelatin ho c BSA ñ ngăn ng a s
liên k t không ñ c hi u ñ i v i b n nh a.
Có nhi u k thu t ELISA , dưói ñây s trình bày k thu t ELI AE tóm b t
kháng ngyuên và ELISE c nh tranh (hình 7.9).
Hình 7.9: K thu t ELI SA
7.5.1. Phương pháp ELI SA tóm b t khánh nguyên (bánh k p)
Phương pháp này dùng ñ xác ñ nh nh ng ch t có phân t lư ng l n. v
nguyên tác kháng th g n lên ch t mang (thành gi ng). Ngư i ta b sung
KN, kháng th th 2 ñ KT 2 k t h p v i KN (c n phân tích) d ng bánh
k p. Sau ñó r a trôi ph n không b t c p và b sung kháng th c ng h p
enzyme, cơ ch t. Enzyme chuy n cơ ch t thành h p ch t màu ñư c xác ñ nh
b ng ph k . T n ng ñ ch t màu ta tính ñư c n ng ñ ch t c n phân tích.
Bư c 1 : Nh KT 1 vào gi ng ñ cho KT 1 bám vào thành gi ng (antitoxin).
KT 1
Bư c 2 : Che b n b ng protein
Protein
Bư c 3 : Nh kháng nguyên ñ c hi u (toxin) ñ KN b t c p v i KT 1
Kháng nguyên
Bư c 4: B sung KT 2 ñ t o ph c h p KT 1 KN KT 2
KT 2
Bư c 5: sung kháng th c ng h p enzym ñ enzym ( KT.E) ñ l o phúc
h p KT 1 KN KT 2 KT .E.
KH E
Bư c 6 : B sung cơ chât ñ enzym th y phân cơ ch t t o thành ch t màu
Cơ ch t
Bư c 7 : Enzym chuy n cơ ch t thành h p ch t màu xanh
Cơ ch t
Màu c a dung d ch có th phát hi n b ng m t ho c ph k , t m t ñ quang
ta tính ñư c n ng ñ c a kháng nguyên ( n ng ñ ñ c t ).
7.4.2. Phương pháp ELISA c nh tranh
Nguyên t c:
C ng h p kháng nguyên và protein (hepten) ñư c c ñ nh trên b m t
ch t r n. Cho m t lư ng kháng nguyên t do và kháng th c ng h p enzyme
vào. Kháng nguyên c ñ nh và kháng nguyên t do c nh tranh nhau bám vào
kháng th . Lư ng kháng nguyên t do càng nhi u thì kháng th b kháng
nguyên c ñ nh gi l i càng ít. Sau khi r a trôi các ch t còn dư, b sung cơ
ch t ñ enzyme phân hu thành các h p ch t màu. Màu c a dung d ch có th
phát hi n b ng ph k , t m t ñ quang A1, A2 c a m u ch ng và m u
nghiên c u ta tính ñư c n ng ñ c a kháng nguyên (n ng ñ ñ c t ) theo
công th c
A − A
C = 1 2 .100;%
A1
Trong ñó: A 1 là m t ñ quang c a m u ch ng.
A 2 M t ñ quang c a m u nghiên c u.
N u C ≥ 50% thì ñư c coi là dương tính.
Nh ng test thư ng s d ng :
Các enzyme ñư c dùng ñ c bi t nhi u trong nh ng test nhanh như
spot test , dip test. Ưu ñi m c a test là ñ s d ng, r ti n nhanh và ñ nh y
cao. Tuy nhiên s d ng test thì ngư i nghiên c u c n ph i hi u rõ nghiên
c u c mình ñ s d ng test cho thích h p.
ng d ng:
K thu t này dùng ñ ñ nh tính ho c ñ nh lư ng các ch t có phân t lư ng nh ,
ñ c t c a n m m c, dư lư ng thu c tr sâu, dư lư ng ch t kháng sinh.
Các bư c th c hi n:
Bư c 1: G n c ng h p SBA afatoxi B1(AFB1) (A FB c ñ nh trên protein
hapten SBA)
AFB
1 AFB1
BS
A
BSA
AFB1 AFB1
C ng h p protein
(BSA) và kháng
BSA BSA
nguyên (AFB )
Bư c 2 : Tráng gi ng b ng protein
Protein
tráng gi ng
AFB AFB
1 1
BS BS
A A
Bư c 3: Cho ti p c ng h p kháng th g n enzyme vào m u xét nghi m và
m u ch ng ñ t o ph c h p KN .KT.E,KN c ñ nh KT
AFB AFB Kháng th c ng
1 1 h p enzyme
BS BS
A A
M u ch ng không có A FB
Trong m u xét nghi m, n u kháng nguyên t do càng nhi u thì kháng
th g n v i kháng nguyên c ñ nh càng ít.
AFB B1
1 Kháng th c ng
Các file đính kèm theo tài liệu này:
giao_trinh_sinh_hoa_mien_dich_phan_2.pdf
