Giáo trình Ứng dụng công nghệ sinh học động vật trong sản xuất vaccine

các "mầm bệnh" gây nên sự truyền nhiễm. Lần đầu tiên trong lịch sử, con người đã thanh toán được một căn bệnh hiểm nghèo. Ảnh chụp năm 1977, Ali Maow Maalin, người Somalia, được xem là bệnh nhân cuối cùng mắc bệnh đậu mùa Tám mươi năm sau, Louis Pasteur nghiên cứu bệnh tả khi dịch tả đang tàn sát đàn gà. Ông cấy các vi khuẩn tả trong phòng thí nghiệm rồi đem tiêm cho gà: những con bị tiêm chết sạch. Mùa hè năm 1878, ông chuẩn bị một bình dung dịch nuôi cấy vi khuẩn dạng huyền phù, rồi để đó, đi nghỉ mát. Khi trở về, ông lại trích lấy huyền phù đó đem tiêm cho gà. Lần này thì bầy gà chỉ bị bệnh nhẹ rồi cả đàn cùng khỏe lại. Pasteur hiểu ra rằng khi ông đi vắng, đám vi khuẩn trong huyền phù đó đã bị biến tính, suy yếu đi. Ông bèn lấy vi khuẩn tả (bình thường) đem tiêm cho những con gà vừa trải qua thí nghiệm trên và những con chưa hề bị chích vi khuẩn. Kết quả là những con nào từng được chích vi khuẩn (biến tính) thì có khả năng đề kháng lại mầm bệnh, bọn còn lại chết hết. Qua đó, Pasteur đã xác nhận các giả thuyết của Jenner và mở đường cho khoa miễn dịch học hiện đại. Từ đó, chủng ngừa đã đẩy lùi nhiều bệnh: triệt tiêu bệnh đậu mùa trên toàn cầu, thanh toán gần như hoàn toàn bệnh bại liệt, giảm đáng kể các bệnh sởi, bạch hầu, ho gà, bệnh ban đào, thủy đậu, quai bị, thương hàn và uốn ván v.v. Nguyên tắc vẫn không có gì thay đổi: gây miễn dịch bằng một vi khuẩn hoặc virus giảm độc lực, hoặc với một proteinđặc hiệu có tính kháng nguyên để gây ra một đáp ứng miễn dịch, rồi tạo một trí nhớ miễn dịch đặc hiệu, tạo ra hiệu quả đề kháng cho cơ thể về sau khi tác nhân gây bệnh xâm nhập với đầy đủ độc tính. 2. ĐỊNH NGHĨA Vaccine là một chế phẩm sinh học chứa vật chất của mầm bệnh được gọi là "kháng nguyên".Khi đưa vào cơ thể người hoặc động vật sẽ kích thích cơ thể tạo ra một trạng thái miễn dịch, giúp cơ thể chống lại mầm gây bệnh (Outteridge,1985) Nhờ những tiến bộ khoa học kĩ thuật ngày nay vaccine đã được chế tạo bằng công nghệ cao có hiệu lực mạnh hơn và sử dụng tiện lợi hơn, đồng thời có gía thành hạ hơn hợp với người tiêu dùng Dù chế tạo bằng công nghệ nào đi nữa thì vaccine phải bảo đảm bốn tiêu chuẩn cơ bản sau: - Không gây phản ứng toàn thân.Có thể có phản ứng cục bộ, nhưng những biểu hiện lâm sàng phải biến mất 24 giờ sau khi tiêm phòng Hiệu lực phòng bệnh cao và kéo dài Tiêm nhẹ tay, liều tiêm thấp và bảo quản dễ dàng Giá thành hạ 3. THÀNH PHẦN CHỦ YẾU CỦA VACCINE Có hai thành phần chủ yếu trong vaccine đó là:Kháng nguyên và chất bổ trợ vaccine. Kháng nguyên:kháng nguyên được hiểu là một chất khi đưa vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể vật chủ sản sinh kháng thể và tạora mộ lớp tế bào mẫn cảm đặc hiệu chống lại sự xâm nhập và gây bệnh của mầm bệnh - Tính kháng nguyên: Đó là khả năng kích thích sinh miễn dịch thể và miễn dịch tế bào của kháng nguyên Tính kháng nguyên của một kháng nguyên trong vaccine mạnh hay yếu phụ thuộc vào tổng số nhóm quyết định kháng nguyên, trọng lượng phân tử,thành phần hóa học, cấu trúc lập thể và khả năng tích điện của các phân tử kháng nguyên - Tính đặc hiệu của kháng nguyên: Một kháng nguyên taọ được một miễn dịch mạnh, ngoài tính kháng nguyên cao cần phải có tính đặc hiệu rõ nét.Tính đặc hiệu này phụ thuộc vào tính chất và cấu trúc kháng nguyê Chất bổ trợ vaccine: Là những chất được bổ sung vào vaccine, có khả năng kích thích sinh miễn dịch không đặc hiệu nhằm nâng cao hiệu lực và độ dài miễn dịch của vaccine - Bổ trợ kết hợp với kháng nguyên làm tăng tính lạ của kháng nguyên khi vào cơ thể,nên đáp ứng miễn dịch mạnh hơn,quá trình tổng hợp protein cao hơn.Vaccine có bổ sung chất bổ trợ sẽ tạo được miển dịch mạnh hơn ,thời gian miễn dịch kéo dài hơn 4. PHÂN LOẠI VACCINE Dựa vào thành phần kháng nguyên có trong vaccine, hoặc căn cứ vào hoạt tính của mầm bệnh hoặc công nghệ chế tạo vaccine để phân loại vaccine 4.1 Dựa vào thành phần kháng nguyên Vaccine thế hệ I – vaccine toàn khuẩn Vaccine toàn khuẩn có thể bao gồm kháng nguyên thân, vỏ bọc và độc tố của nấm bệnh sản sinh ra trong quá trình phát triển. Hiện nay loại vaccine này được phát triển chủ yếu ở nước ta như vaccine phòng bệnh tụ huyết trùng gia súc, gia cầm, vaccine phòng bệnh phó thương hàn lợn con, vaccine E.coli, vaccine dịch tả lợn. Vaccine thế hệ II- vaccine tiểu phần Trong vacxin chỉ chứa một số thành phần gây bệnh của mầm bệnh như vaccine E coli chứa kháng nguyên F4 ,F5, F6, F18, hoặc F14 của vi khuẩn E.coli dùng phòng bệnh tiêu chảy lợn con, nghé, bê, phòng bệnh phù đầu lợn con, vaccine chứa kháng nguyên VP2 của Gumboro phòng bệnh Gumboro của gà. . Vaccine thế hệ III-Vaccine tái tổ hợp Vaccine tái tổ hợp được sản xuất bằng nghệ gen (genetic engeneering) như vaccine tái tổ hợp phòng bệnh cúm gia cầm H5N1, vaccine tái tổ hợp LMLM v.v... Thành phần hóa học của các kháng nguyên vi sinh vật trong vaccine thế hệ I, thế hệ II và thế hệ III đểu là protein ( kháng nguyên toàn khuẩn, kháng nguyên lông, kháng nguyên ADN...), polisaccharit ( kháng nguyên vỏ bọc), lipopolisaccharit ( kháng nguyên thân, kháng nguyên fimbria) Trong các loại kháng nguyên kể trên, các kháng nguyên có bản chất là protein và lipopolisaccharit có tính kháng nguyên mạnh và có tính đặc hiệu cao. Còn kháng nguyên có bản chất là polysacchande thường có phản ứng chéo với nhau, vì cò những nhóm đường cấu tạo nên các quyết định kháng nguyên giống nhau 4.2. Dựa vào hoạt tính của mầm bệnh Trong nhóm này có hai loại vaccine: vaccine vô hoạt và vaccine nhược độc Vaccine.vô hoạt Vaccine vô hoạt là vaccine chứa mầm bệnh- kháng nguyên đã được vô hoạt bằng các yếu tố vật lý như: Nhiệt độ, tia tử ngoại, sóng siêu âm; bằng các hóa chất như: Các loại thuốc nhuộm,các axit, formol v.v... Vaccine vô hoạt không có bổ trợ Loại vaccine này còn được gọi là bacterin. Vaccine bacterin chỉ chứa một thành phần chủ yếu là kháng nguyên. Công nghệ chế tạo bacterin khá đơn giản phù hợp với các nước có trình độ chế tạo vaccine đơn giản, có giá thành hạ. Song hiệu lực vaccine này thấp, độ dài miễn dịch ngắn. Hiện nay loại vaccine này được sản xuất rất ít, thường sản xuất dạng vaccine chuồng cho một số cơ sở có yêu cầu. *Vaccine vô hoạt có bổ trợ vaccine Trong vaccine này ngoài kháng nguyên đã được vô hoạt còn có bổ trợ vaccine. Các bổ trợ vaccine hiện nay thường dùng là keo phèn, phèn chua và bổ trợ dầu khoáng. Vaccine nhược độc Vaccine nhược độc là vacine chứa mầm bệnh được làm nhược độc hoặc vô độc, nhưng vẫn bảo toàn tính khàng nguyên. 5.HẠN CHẾ CỦA VACCINE Những hạn chế của vắc-xin tập trung thành hai nhóm chính: hiệu quả kém và các tai biến đi kèm. * Hạn chế về hiệu quả - Một số vaccine rất có hiệu quả, không kể vaccine đậu mùa nổi tiếng, thí dụ vaccine ngừa bệnh uốn ván, sởi v.v. Một số vaccine khác có hiệu quả vừa phải (hiệu quả của BCG chỉ vào khoảng 50%). Ngược lại, có những bệnh đến đầu thế kỷ 21 vẫn chưa có vắc-xin thích hợp (AIDS, sốt rét v.v.). Do vậy, vaccine chưa phải là vũ khí vạn năng để đối phó với bệnh tật. - Hiệu quả của vaccine cũng khó đánh giá chính xác. Kết quả nghiên cứu trên động vật không thể áp dụng 100% cho loài người, vì những đặc điểm riêng của từng loài. + Trên lý thuyết, phương pháp duy nhất để chứng minh hiệu quả là lấy 2 nhóm người, một nhóm được tiêm chủng, một nhóm không rồi truyền mầm bệnh cho cả hai nhóm để xem kết quả. Dĩ nhiên phương pháp này không thể sử dụng được vì trái đạo đức. Do đó, người ta biến hóa đi một chút, cũng chia ra 2 nhóm được chủng và không được chủng như trên nhưng không truyền bệnh mà chỉ quan sát sự nhiễm bệnh qua các ngã thông thường. + Hạn chế của phương pháp này là nếu một vaccine tỏ ra có hiệu quả, người ta không thể triển khai nghiên cứu trên quy mô rộng để tính chính xác hiệu quả vì như thế một số lớn quần chúng sẽ bị thiệt thòi do không được bảo vệ. - Bởi vậy, khi một vaccine được xem là có hiệu quả, người ta đem tiêm chủng cho mọi người và quan sát sự giảm số người mắc bệnh. Tuy nhiên, ngay cả khi một bệnh có chiều hướng giảm xuống, người ta cũng không biết vai trò thật sự của vắc-xin, thí dụ tần suất bệnh lao đã giảm rất nhiều, nhưng vai trò của các biện pháp vệ sinh, cách ly nguồn lây cũng rất đáng kể. (Để hiểu rõ hơn cách đánh giá hiệu quả, xem thêm bài khoa học thống kê.) - Tính kém hiệu quả của vaccine có thể biểu hiện về mặt chất (đáp ứng miễn dịch không thích hợp) hoặc về mặt lượng (không có đáp ứng miễn dịch). + Nguyên nhân gây kém hiệu quả về lượng: Các "lỗ hổng" trong kho tàng miễn dịch: trên lý thuyết, các tế bào lympho B có thể tạo ra hơn 1012 loại kháng thể đặc hiệu [1], còn lympho T có thể nhận diện trên 1015 kháng nguyên khác nhau , những con số này tuy rất lớn nhưng không phải là vô hạn, hệ miễn dịch không thể chống lại mọi thứ. Hiệu quả của vaccine còn tùy thuộc vào thời gian bảo vệ: trí nhớ miễn dịch có thể tồn tại suốt đời nhưng sự sản xuất kháng thể thì không nếu không được tái kích thích. Đột biến của tác nhân gây bệnh: đây là cơ chế sinh tồn của các tác nhân gây bệnh. Đột biến đẩy hệ miễn dịch vào một cuộc rượt đuổi trường kỳ. Tiêu biểu cho cơ chế này là HIV, virus sốt xuất huyết, virus cúm với nguy cơ đại dịch cúm gia cầm hiện nay. + Nguyên nhân gây kém hiệu quả về chất: Vai trò của phụ gia: để giảm tác dụng không mong muốn của vaccine, người ta thường tinh lọc các chế phẩm, nhưng có những vaccine quá tinh khiết lại trở nên kém hiệu quả. Đó là do hệ miễn dịch muốn được kích hoạt, phải nhận được một tín hiệu báo nguy, tín hiệu này thường không phải là kháng nguyên dùng làm vắc-xin. Để khắc phục, người ta dùng một số loại phụ gia trong chế phẩm vắc-xin. Thí dụ phụ gia Freund, nhôm hyđrôxít, nhôm phosphate hoặc trộn lẫn các vaccine với nhau. Loại phản ứng miễn dịch và hiện tượng chuyển hướng miễn dịch: đối với các tác nhân gây bệnh ngoại bào, đáp ứng miễn dịch dịch thể là thích hợp (loại đáp ứng này được sự hỗ trợ của các tế bào lympho Th1). Ngược lại, đáp ứng miễn dịch tế bào (cần sự hỗ trợ của lympho Th2) lại hữu hiệu cho các tác nhân gây bệnh nội bào. Do đó, nếu vaccine gây được đáp ứng miễn dịch nhưng không đúng loại đáp ứng nên có, hiệu quả cũng không được bảo đảm. Th1 và Th2 có xu hướng khắc chế lẫn nhau. Vaccine kinh điển có xu hướng tạo đáp ứng Th1. Do đó đối với những bệnh do tác nhân nội bào như nhiễm leishmania, miễn dịch đặc hiệu sau lành bệnh lại tốt hơn vắc-xin, vì vaccine lại gây hiệu quả ngược, kiềm hãm phản ứng bảo vệ. *Tai biến khi dùng vaccine Có hai loại tai biến: nhiễm bệnh và các bệnh miễn dịch. - Nhiễm bệnh Vaccine sống, giảm độc lực có thể gây bệnh cho người bị suy giảm miễn dịch. Nguy cơ hồi phục của tác nhân vi sinh: một tác nhân bị làm giảm độc lực tìm lại được độc tính của mình. Nguy cơ này ở vắc-xin ngừa bại liệt là 10-7, nghĩa là cứ 10 triệu trẻ em uống vaccine Sabin thì có 1 em bị tai nạn loại này. Điều không may này không ngăn cản được việc sử dụng vắc-xin này bởi lẽ tỷ lệ đó được xem là chấp nhận được. Nguy cơ nhiễm các tác nhân gây bệnh khác vào trong chế phẩm vaccine. Điều này có thể hạn chế bằng các quy trình sản xuất, bảo quản và sử dụng chặt chẽ. - Bệnh miễn dịch Thử nghiệm vaccine phòng bệnh dại trên cừu cho thấy có xác suất gây EAE, một bệnh tự miễn trên hệ thần kinh khoảng 1/3000-1/1000.Lý do có thể là vắc-xin chiết xuất từ não chó đã mang theo cả những mẩu protein của tế bào thần kinh, khi tạo miễn dịch, cơ thể (được tiêm)đã tạo ra cả kháng thể chống lại cấu trúc thần kinh của mình. Vaccine ngừa ho gà có thể gây sốc kèm di chứng thần kinh với xác suất 10-4-10-6. Việc tinh lọc vaccine này làm tăng mức an toàn nhưng một lần nữa, giảm hiệu quả II. CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA VACCINE Hệ miễn dịch nhận diện vắc-xin là vật lạ nên hủy diệt và "ghi nhớ" chúng. Về sau, khi tác nhân gây bệnh thực thụ xâm nhập cơ thể, hệ miễn dịch đã ở tư thế sẵn sàng để tấn công tác nhân gây bệnh nhanh chóng hơn và hữu hiệu hơn (bằng cách huy động nhiều thành phần của hệ miễn dịch, đặc biệt là đánh thức các tế bào lympho nhớ). Đây chính là các ưu điểm của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. III.PHƯƠNG PHÁP CHUNG SẢN XUẤT VACCINE Tạm hiểu đơn giản việc sản xuất theo cách: Cách sản xuất cổ điển: Lấy chính vi khuẩn gây bệnh, làm giảm độc lực (tạm gọi là kháng nguyên) tiêm vào người thì chúng không đủ sức gây bệnh mà kích thích cơ thể tạo ra chất miễn dịch (gọi là kháng thể). Lần sau gặp lại vi khuẩn, kháng thể chống lại nên cơ thể không mắc bệnh. Cách sản xuất hiện đại: Chỉ lấy một ít kháng nguyên ở vi khuẩn gây bệnh, “cấy” vào một vi khuẩn lành tính, làm cho nó sinh sôi nảy nở, rồi “chiết” kháng nguyên từ vi khuẩn lành tính đó ra làm vacxin. Cách điều chế bằng “công nghệ sinh học” này chỉ dùng một lượng kháng nguyên nhỏ, đỡ tốn kém, chỉ cần dùng một liều rất nhỏ. Với hai nguyên lý sản xuất trên, không bao giờ dùng vacxin mà mắc chính các bệnh do vi khuẩn đó gây ra. Nhưng không phải vacxin nào cũng điều chế theo “công nghệ sinh học” được. Virus cúm týp A hay biến đổi, nếu chỉ lấy kháng nguyên của một chủng nhất định để điều chế theo “công nghệ sinh học”, tạo ra một loại vacxin có tính ổn định. Khi tiếp xúc với các chủng cúm týp A mới, đã biến dị thì vacxin ổn định này lại không có hiệu lực. Hàng năm WHO dự báo chủng cúm týp A có thể gây dịch, khuyến cáo dùng loại vacxin chống cúm nào là thích hợp. IV.ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT TRONG SẢN XUẤT VACCINE 4.1. DNA TÁI TỔ HỢP . ADN tái tổ hợp là phân tử ADN được tạo thành từ hai hay nhiều trình tự ADN của các loài sinh vật khác nhau. Trong kỹ thuật di truyền, ADN tái tổ hợp thường làđược tạo thành từ việc gắn những đoạn ADN có nguồn gốc khác nhau vào trong vectơ tách dòng. Những vectơ tách dòng mang ADN tái tổ hợp này có thể biểu hiện thành các protein tái tổ hợp trong các sinh vật. Thí dụ một số dược phẩm là hormone peptide được tạo ra từ công nghệ ADN tái tổ hợp là insulin, hormone tăng trưởng, và oxytocin. Những vắc-xin cũng có thể được sản phẩm bằng phương thức này. Sinh vật chủ được sử dụng phổ biến nhất trong công nghệ ADN này là Escherichia coli. DNA vaccine :Còn gọi là vaccine DNA tái tổ hợp, đây là loại nucleic acid vaccine, dựa trên nguyên lý một gen mã hóa cho protein kháng nguyên đặc hiệu được tiêm vào vật chủ (tế bào động vật hoặc vi sinh vật) để sản xuất các kháng nguyên này và khởi động một phản ứng miễn dịch. Nhiều vaccine phòng virus hiện nay (sởi, bại liệt, dại) đều được sản xuất từ nuôi cấy tế bào động vật mà không phải là tế bào vi sinh vật. Vắc xin ADN dùng chất liệu di truyền của vi sinh vật; đặc biệt các gen mã hoá kháng nguyên quan trọng. Hình 6.6. Mô hình sản xuất và điều trị bằng liệu pháp DNA vaccine. Phân lập một hoặc nhiều gen từ tác nhân gây bệnh (pathogen), đưa các gen này vào trong vòng DNA của plasmid và đóng lại (a). Các vòng DNA sau đó được đưa vào trong các nhóm tế bào nhỏ, thường bằng cách tiêm vào tế bào cơ (b) hoặc đẩy vào da nhờ súng bắn gen (c). Các gen được chọn lựa mã hóa cho các kháng nguyên, các chất có thể gây ra một đáp ứng miễn dịch, thường được sản xuất bởi tác nhân gây bệnh. Ngăn chặn bệnh cúm tạo chủng vaccine cúm bằng phương pháp reassortment Genome virus cúm gồm 8 đoạn. Một đoạn trong số đó mã hoá cho kháng nguyên hemagglutinin bề mặt (HA) và một đoạn khác mã hoá cho kháng nguyên neuraminidase bề mặt (NA). Mỗi năm, các nhà nghiên cứu dự đoán chủng cúm nào sẽ phổ biến nhất và trên cơ sở đó họ lựa chọn 2 đến 3 chủng cúm A và 1 chủng cúm B để sản xuất vaccine dùng cho năm đó. Mục đích của quá trình tái sắp xếp và tổ hợp các gene virus cúm (reaassortment) là nhằm kết hợp gene HA và NA mong muốn từ chủng đích (chủng cúm 1) với các gene từ chủng vô hại. Chủng vô hại này phải là chủng có thể phát triển tốt trong trứng (chủng cúm 2). Sơ đồ dưới đây mô tả chi tiết các bước tạo ra vaccine: 1. Các chủng cúm 1 và 2 được tiêm đồng thời vào trứng gà đã thụ tinh. 2. Các gene từ chủng cúm 1 nhân lên và trộn lẫn với các gene từ chủng cúm 2tạo ra tối đa là 256 tổ hợp gene. 3. Các nhà nghiên cứu sẽ tìm trong số các tổ hợp gene đó để chọn ra chủng mang gene HA và NA từ chủng cúm 1 và các gene còn lại từ chủng cúm 2. Chủng được lựa chọn phải đảm bảo là có thể mọc một cách hiệu quả trong trứng. 4. Chủng được tạo ra cùng với 2 chủng cúm khác sẽ được sử dụng làm vaccine cho năm kế tiếp. Gần đây, việc sản xuất vaccine cúm trên trứng đang gặp một số khó khăn bởi một số người bị dị ứng với vaccine sản xuất từ trứng do còn sót lại một ít albumin từ trứng; một mặt khác cúm gà xảy ra với diện rộng trên thế giới khiến cho nguồn trứng có thể bị ảnh hưởng. Chính vì vậy chính quyền Mỹ và một số nước đang có xu hướng chuyển từ nuôi virus cúm trên trứng gà sang nuôi trên tế bào. Một số tế bào đã được khảo sát có khả năng nhiễm virus cúm gồm tế bào thận chó, khỉ, gà, cútv.v. Tế bào thận khỉ xanh Vero đang được nhiều nhà khoa học chọn làm giá thể nuôi virus bởi nó có thể nuôi trong dịch huyền phù, cho sinh khối cao. Tế bào thận chó MDCK được WHO khuyến cáo sử dụng cho việc tách virus sơ cấp hoặc để sử dụng trong nghiên cứu virus cúm. Vaccin ngừa viêm gan B: Có 2 loại: Hepatitis B vaccine: Vaccin Viêm gan B là loại Vaccin tinh khiết, bất hoạt, hấp phụ được điều chế từ huyết tương người lành mang kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B (HBsAg) không có triệu chứng lâm sàng. Huyết tương được thu thập từ các trung tâm huyết học truyền máu. Các trung tâm này phải tuân thủ đầy đủ yêu cầu của Tổ chức Y tế Thế giới đối với các xét nghiệm cho huyết tương được sử dụng để sản xuất Vắcxin viêm gan B điều chế từ huyết tương người. r-HBvax: r-HBvax là một loại Vắcxin virút tiểu đơn vị tái tổ hợp bất hoạt không gây nhiễm điều chế từ HBsAg được sản xuất trong tế bào nấm men sử dụng công nghệ tái tổ hợp ADN. Đây là một sản phẩm dạng nước màu hơi trắng đục được sản xuất bằng cách nuôi cấy tế bào nấm men đã được xử lý bằng công nghệ di truyền có mang gen mã hóa sinh tổng hợp HBsAg sau đó được tinh chế và bất hoạt bằng kỹ thuật hóa lý như siêu ly tâm, sắc ký cột và xử lý với formalin. Vaccine quai bị Đây là loại vaccine sống giảm độc lực được điều chế từ môi trường nuôi cấy trên phôi gà Vaccine cúm gia cầm Bằng công nghệ di truyền ngược (reverse genetics), vaccine được tạo ra theo hệ thống 8 plasmid (rescue plasmid system) mà nhóm tác giả Hoffmann và cộng sự thực hiện năm 2002. Hai plasmid mang gene HA và NA bắt nguồn từ chủng virus A/Vietnam/1203/04 (H5N1) mà Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo dùng làm vaccine. Và các gene còn lại (M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) từ chủng virus cúm A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Gene HA được biến đổi di truyềnđể làm giảm tính độc lực của virus cúm bằng cách cắt bỏ ba acid amin Arginine (R), 1 acid amin Lysine (K) và thay thế 1 acid amin Lysine (K) bằng 1 acid amin Threonine (T), ở vị trí 327-328, vị trí phân cắt HA1 và HA2 của gene HA, vị trí góp phần tính độc lực cao của virus cúm. Biến nạp 2 plasmid mang gene HA và NA từ chủng A/Vietnam/1203/04 (H5N1) và  6 plasmid mang các gene còn lại (M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) từ chủng virus cúm A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) vào tế bào nuôi cấy (phôi trứng gà, hoặc tế bào Vero, tế bào MDCK,). Virus tái tổ hợp này sẽ có đặc điểm kháng nguyên bề mặt giống với chủng hoang dại A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Sau đó chọn lọc dòng virus tái tổ hợp này làm vaccine phòng cúm H5N1 Hình 2. Nguyên tắc tạo vaccine virus H5N1 tái tổ hợp và cơ chế loại bỏ độc tính ở gene HA của chủng virus cúm H5N1 4.2. NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Tế bào động vật tách từ mô có thể được nuôi cấy trên các loại môi trường dinh dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trưởng bằng cách tăng số lượng và kích thước tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đã tạo cơ hội để nghiên cứu các tế bào ung thư, phân loại các khối u ác tính, mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất, xác định sự tương hợp của mô trong cấy ghép và nghiên cứu các tế bào đặc biệt cùng sự tương tác của chúng. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật có vú có thể được ứng dụng để sản xuất các hợp chất hóa sinh quan trọng dùng trong chẩn đoán như các hormone sinh trưởng của người, interferon, hoạt tố plasminogen mô, các viral vaccine và các kháng thể đơn dòng. Theo phương pháp truyền thống các hợp chất hóa sinh này được sản xuất bằng cách sử dụng các động vật sống hoặc được tách chiết từ xác người chết. Chẳng hạn, các kháng thể đơn dòng có thể được sản xuất bằng cách nuôi cấy các tế bào hybridoma trong các khoang màng bụng (peritoneal cavity) của chuột, hoặc hormone sinh trưởng dùng để chữa bệnh còi (dwarfism) có thể được tách chiết từ xác người chết. Tuy nhiên, số lượng thu được từ các phương pháp này rất hạn chế vì thế việc ứng dụng rộng rãi chúng trong điều trị còn gặp nhiều khó khăn. Một số loại vaccine mới đang nghiên cứu Các vaccine này còn được xem là vaccine của tương lai, có 6 hướng phát triển chính hiện nay: Sử dụng các phụ gia (adjuvant) mới, nhằm gây ra loại đáp ứng miễn dịch mong muốn. Thí dụ, chất nhôm phosphate và các oligonucleotide chứa CpG demethyl hóa đưa vào vắc-xin khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo hướng dịch thể (tạo kháng thể) thay vì tế bào. Vaccine khảm: sử dụng một sinh thể quen biết để hạn chế hiện tượng "phản tác dụng", thí dụ dùng virus vaccinia mang một số yếu tố của virus viêm gan B hay virus dại. Vaccine polypeptidique: tăng cường tính sinh miễn dịch nhờ liên kết tốt hơn với các phân tử MHC: peptide nhân tạo 1/2 giống virus, 1/2 kia gắn MHC; đoạn peptide mô phỏng 1 quyết định kháng nguyên (epitope). Anti-idiotype: idiotype là cấu trúc không gian của kháng thể tại vị trí gắn kháng nguyên, đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng. Anti-idiotype là các kháng thể đặc hiệu đối với idiotype, do đó anti-idiotype xét về mặt đặc hiệu lại tương tự với kháng nguyên. Vậy, thay vì dùng kháng nguyên X làm vaccine, người ta dùng idiotype anti-anti-X. Vaccine DNA: DNA của tác nhân gây bệnh sẽ được biểu hiện bởi tế bào người được chủng ngừa. Lợi thế của DNA là rẻ, bền, dễ sản xuất ra số lượng lớn nên thích hợp cho những chương trình tiêm chủng rộng rãi. Ngoài ra, vaccine DNA còn giúp định hướng đáp ứng miễn dịch: tác nhân gây bệnh ngoại bào được trình diện qua MHC loại II, dẫn đến đáp ứng CD4 (dịch thể và tế bào). Khi kháng nguyên của tác nhân đó được chính cơ thể người biểu hiện, nó sẽ được trình diện qua MHC loại I, lúc này đáp ứng miễn dịch tế bào qua CD8 được kích thích. Tuy nhiên phương pháp này là con dao hai lưỡi bởi lẽ tế bào mang DNA lạ có nguy cơ bị nhận diện là "không ta", sinh ra bệnh tự miễn. Sử dụng véc-tơ tái tổ hợp – dùng các vi khuẩn thuần tính hoặc các tế bào trình diện kháng nguyên như tế bào tua được chuyển gen để biểu hiện kháng nguyên mong muốn. Triển vọng sản xuất vaccine ngừa bệnh ung thư Các nhà khoa học Anh vừa xác định chính xác một loại protein trên tế bào miễn dịch, qua đó họ hy vọng sẽ có thể điều khiển hệ miễn dịch của cơ thể tấn công cụ thể vào một khối u ung. Họ cho biết , từ phát hiện này, một loại vaccine được "cấy trên" trên protein trên sẽ chuyển thông điệp đến hệ miễn dịch, phát động tấn công tế bào ung thư. Điều đặc biệt là protein nói trên chỉ liên quan đến một dạng tế bào miễn dịch có tên là dendritic- một loại tế bào hình khoáng vật. Nhiệm vụ của loại tế bào này báo động cho các tế bào khác của hệ miễn dịch về các mầm bệnh hoặc các phân tử từ bên ngoài cơ thể xâm nhập vào để chúng tấn công tiêu diệt. Về mặt lý thuyết, người ta sẽ dùng một loại vaccine mang phân tử từ tế bào ung thư đưa vào các tế bào dandritic, khiến các tế bào này phát động toàn bộ hệ thống miễn dịch của cơ thể tập trung tiêu diệt ung thư. Các nhà khoa học cho biết, phương pháp tương tự cũng sẽ được sử dụng để điều trị HIV hoặc bệnh sốt rét... Bào chế vaccine ngừa sốt rét bằng... muỗi Dưới sự hướng dẫn của nhà khoa học Mỹ Stephen Hoffman, đang phát triển một loại vaccine chống bệnh sốt rét, được bào chế từ ký sinh trùng Plasmodium falciparum được làm yếu đi. Trong phòng thí nghiệm, nhóm nghiên cứu đã dùng máu có nhiễm ký sinh trùng Plasmodium falciparum để nuôi muỗi có khả năng truyền bệnh sốt rét cho con người. Hai tuần sau, ký sinh trùng đã lan tràn trong ruột muỗi và di chuyển lên tuyến nước bọt của chúng. Sau đó, những con muỗi này được xử lý bằng phóng xạ để làm yếu ký sinh trùng trong cơ thể chúng. Và các chuyên gia đã xử lý những ký sinh trùng đã được làm yếu đó để bào chế vaccine. Vaccine thực phẩm (edible vaccine) Cho đến thời gian gần đây người ta vẫn sử dụng vaccine sống nhược độc làm kháng nguyên kích thích tạo kháng thể cần thiết trong cơ thể người và vật nuôi. Vaccine kiểu này có một số hạn chế như: có khả năng quay trở lại dạng độc hoặc hoạt lực của nó giảm khá nhanh trong cơ thể người và vật nuôi. Hiện nay, nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp người ta đã sản xuất được protein vỏ của một số loại virus như virus bệnh lỡ mồm long móng, bệnh dại và viêm gan B. Tuy nhiên, vaccine được sản xuất theo các phương pháp trên có giá thành cao, điều kiện bảo quản và vận chuyển nghiêm ngặt, cần có kỹ thuật viên để tiến hành tiêm chủng. Vaccine thực phẩm là một mô hình lý tưởng cho các nước đang phát triển, vì nó giúp khắc phục được các khó khăn nói trên của vaccine được sản xuất theo phương pháp truyền thống hoặc DNA tái tổ hợp. Nguyên lý cơ bản của quá trình này là chuyển một