Khóa luận Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin

ng này (hình 2.11) góp phần giải thích hoạt tính kháng oxy hóa mạnh của Cur và các dẫn xuất của chúng [19]. OHHO OCH3H3CO OO -H+ R* OHO OCH3H3CO OO OHHO OCH3H3CO OO OHO OCH3H3CO OO OHHO OCH3H3CO OO OO OCH3H3CO OO OHHO OCH3H3CO OO Hình 2.11: Phản ứng của Cur với gốc tự do [19] 2.2. Hoạt tính sinh học của Cur và dẫn xuất của Cur. Từ xa xưa, Cur đã được dùng làm màu thực phẩm và dùng trong các bài thuốc dân gian. Cur đã được sử dụng như một vị thuốc dân gian để chữa một số bệnh như bệnh gan, nhiễm khuẩn, bệnh ngoài da, viêm loét dạ dày, phòng và chữa một số loại ung thư…Cur không gây độc đối với người ở liều lượng lên đến 10g/ngày. Chính vì tính an toàn nên Cur có nhiều tiềm năng sử dụng trong dược phẩm [20]. 15 Cur còn là chất chống viêm và chống oxy hóa điển hình, có thể sử dụng trong điều trị bệnh mà không sợ gây loãng xương, không gây loét dạ dày. Ngoài ra, Cur cũng đã được chứng minh là có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao, có triển vọng lớn trong điều trị viêm gan siêu vi B, C và cả HIV với giá rẻ [4,5]. Như vậy ta thấy hoạt tính của Cur rất phong phú và đa dạng, nội dung luận văn này xin trình bày hoạt tính kháng ung thư, kháng oxy hóa của Cur. 2.2.1. Hoạt tính kháng ung thư Hiện nay, ung thư đang được xem là bệnh nan y và được điều trị dựa trên sự kết hợp của ba phương pháp: xạ trị, phẫu trị và hóa trị. Riêng thuốc trị ung thư trong hoá trị là loại thuốc khó sử dụng hơn cả vì độc tính cao. Thuốc trị ung thư có tác dụng ức chế sự phát triển và biệt hóa các tế bào ung thư nhằm chặn đứng sự phát triển và di căn của ung thư. Tuy nhiên đại đa số các thuốc trị ung thư hiện nay đều dễ bị nhờn thuốc và hệ số an toàn giảm dần theo thời gian sử dụng, ngoài ra chúng có thể gây độc cho các tế bào lành và gây ra các tác dụng phụ như: rụng tóc, buồn nôn... Vì vậy việc tìm ra một hoạt chất có tác dụng chống ung thư có nguồn gốc từ tự nhiên và tăng hoạt tính của các hoạt chất đó đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Cur là được xem một hoạt chất điều trị ung thư vào loại mạnh theo cơ chế tự hủy diệt từng phần các tế bào ác tính [4]. Nó vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn chặn không cho hình thành các tế bào ung thư mới mà không ảnh hưởng đến các tế bào lành tính bên cạnh, nó loại bỏ các gốc tự do và các loại men gây ung thư có trong thức ăn, nước uống hằng ngày. Vì vậy, Cur được xem là hoạt chất hỗ trợ, phòng chống và chữa trị ung thư một cách có hiệu quả. Ngoài ra, Cur còn có khả năng ức chế sự hình thành khối u, tác động đến hầu hết các giai đoạn của quá trình hình thành và phát triển của khối u như: biến đổi, phát triển, lan rộng của tế bào ung thư . 16 Hình 2.12: Tác động của Cur đến quá trình hình thành và di căn khối u [7]. 2.2.2. Hoạt tính kháng oxy hóa Các dạng oxygen hoạt động (ROS-Reactive oxygen species) là thành phần tham gia vào các cơ chế gây bệnh khác nhau trong cơ thể [7]. Cur có khả năng ức chế hiệu quả các ROS trong cơ thể như: anion superoxide, H2O2, gốc nitrite ở mức độ in vitro và in vivo [14]. Cur có hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng, các hoạt tính đó đều xuất phát từ tính kháng oxy hóa mạnh của Cur, tính kháng oxy hóa của nó mạnh hơn vitamin E [15]. Do vậy thông qua hoạt tính kháng oxy hóa, Cur có khả năng khống chế sự phát triển nhiều loại bệnh tật và các tác nhân gây hại khác nhau. Cur thể hiện khả năng ức chế mạnh với những thương tổn do H2O2 gây ra ở tế bào sừng, tế bào fibroblast và các tế bào NG108 [16]. Cur ngăn chặn sự peroxy hóa lipid trong vi lạp thể gan, màng hồng cầu và dịch đồng thể não chuột nhờ vậy mà nó duy trì hoạt động của những enzyme kháng oxy hóa như SOD, catalase và glutathione peroxidase [17]. Trong cấu trúc của Cur có hydrogen của nhóm phenolic và hydrogen của nhóm methylene (giữa liên kết β-diketone) đều có thể tạo nên khả năng kháng oxy hoá. Tuy nhiên, hoạt tính của Cur thực chất là do hydrogen ở vị trí nào gây ra vẫn còn nhiều tranh cãi. W.F.Chen và cộng sự [18] nghiên cứu khả năng ức chế 2,2’- azobis (2-amidinopropane hydrochloride) (AAPH), Cu2+ trong oxy hóa lipoprotein nồng độ thấp của curcumin và các chất tương tự như curcumin nhưng không có nhóm phenolic:1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene 3,5-dione (1), 1,7-bis(4-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione (2) và 1,7- diphenyl-1,6- heptadiene-3,5-dione (3). Hoạt tính kháng oxy hoá của các chất (1), (2), (3) đều yếu Khối u di căn Lan rộng Biến đổi Phát triển Cur Tế bào bình thường Tế bào ung thư Khối u tăng trưởng 17 hơn các dẫn xuất Cur nhiều lần. Do đó, nhóm nghiên cứu cho rằng nhóm phenolic đóng vai trò quan trọng tạo nên hoạt tính của các dẫn xuất curcuminoid. L. Chen và cộng sự [19] cho rằng nhóm enolic có tính acid cao hơn nhóm phenolic nên hydrogen của enolic đóng vai trò quyết định hoạt tính kháng oxy hoá của Cur. Do đó trong quá trình trao đổi proton để loại bỏ gốc tự do hydrogen của enolic tách ra đầu tiên (hình 2.13). O O H3CO OCH3 O O H H H C H O O H3CO OCH3 O H H C O O2- HO2- Hình 2.13: Cơ chế quét gốc tự do superoxide của Cur [19] Tuy nhiên, J.S. Wright và cộng sự [42] lại cho rằng vai trò kháng oxy hoá của nhóm phenolic hay methylene trên Cur tuỳ thuộc vào loại gốc tự do tấn công và môi trường phản ứng. K. I. Priyadarsini và cộng sự [20] lại cho rằng hoạt tính kháng oxy hoá của Cur chủ yếu l à do quá trình tách hydrogen trên nhóm phenolic và một phần trên nhóm methylene. Ngoài ra, Cur có khả năng tạo phức mạnh với các ion kim loại như chì, cadmium, sắt… mà các ion kim loại này là nhân tố xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hoá, đầu độc tế bào thần kinh và là nguyên nhân gây ra các căn bệnh như Alzheimer, Parkinson, … Do vậy, Cur là một trong các hợp chất thiên nhiên tiềm năng có thể sử dụng để loại trừ các ion kim loại độc trong cơ thể người [21]. 2.3. Các nghiên cứu về imine và dẫn xuất imine Cur Một trong các hướng nghiên cứu về Cur hiện nay là nâng cao khả năng ứng dụng và nâng cao hoạt tính của Cur dựa trên các nguyên tắc sau: z Tạo phức với các kim loại chuyển tiếp. z Tổng hợp các hợp chất imine. z Encapsule hoá Cur. z Tạo các dẫn xuất Cur với glucose, glycine, alanine, acid acetic… 18 Trong các hướng nghiên cứu trên thì các nghiên cứu về các dẫn xuất imine ngày càng thể hiện nhiều tiềm năng cho ngành dược phẩm. J.S.Shim và cộng sự [22] đã tổng hợp được một số dẫn xuất hydrazinocurcumin (HC) và hydrazinobenzoylcurcumin (HBC). OCH3 OH H3CO OH O O OCH3 OH H3CO OH N NH NH2NH2.HCl Triethylamine AcOH, MeOH Hình 2.14: Phản ứng tổng hợp HC [22]. OCH3 OH H3CO OH O O OCH3 OH H3CO OH N N Triethylamine AcOH, MeOH NH.NH2 HO O HO O Hình 2.15: Phản ứng tổng hợp HBC [22]. Kết quả nghiên cứu cho thấy HC có hoạt tính ức chế tế bào BAEC (bovine aortic endothelial cell), ngăn chặn tiến trình angiogenesis (một trong các tiến trình phát triển của ung thư) cao hơn 30 lần so với Cur. Ngoài ra HC còn có khả năng ức chế một số dòng tế bào: HT29, NH3T3, Chang. Hình 2.16: Ảnh hưởng của nồng độ HC với các chủng tế bào ung thư khác nhau (theo phương pháp MTT) [22] 19 Riêng HBC thể hiện hoạt tính ức chế dòng tế bào BAEC mạnh hơn Cur nhưng kém hơn HC. HBC có hoạt tính ức chế mạnh lên tế bào HCT15, ở nồng độ 40µM HBC thì hầu như toàn bộ lượng tế bào HCT15 bị ức chế sau hơn 48 giờ. Tuy nhiên, cũng như HC, HBC không thể hiện hoạt tính ức chế đối với APN (amino peptidase N). Kết quả thử nghiệm cũng cho thấy HBC có khả năng cản trở quá trình phát triển của tế bào ung thư ruột kết (ruột già – HCT15 colon cancer cells) bằng cách kết hợp với nhóm chức năng trung gian khác là Ca2+/CaM [46]. Ca2+/CaM là một protein đa chức năng, bản thân nó không có hoạt tính nào đặc biệt nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy nó có liên quan và thường có những biểu hiện bất thường đối với một vài loại tế bào ung thư. Vì vậy, nó được xem như một chất mang lý tưởng cho các chất khác trong đó Ca2+ đóng vai trò là cầu nối gắn kết những chất có hoạt tính sinh học với CaM. Kết quả nghiên cứu cho thấy HBC có thể gắn trực tiếp lên protein Ca2+/CaM với độ tương thích cao. Hình 2.17: Ảnh hưởng của HBC đến sự phát triển của tế bào HCT15 và APN [22] 20 Bảng 2.4 : Giá trị IC50 của các dẫn xuất curcuminoid đối với tế bào BAEC [22] R1 R2 IC50 Curcuminoid, 1 1a 1b 1c OCH3 OCH3 H OCH3 H H 1.5 ± 0.3 x 10-5 2.2 ± 0.5 x 10-5 5.3 ± 0.6 x 10-5 Hydrazino curcuminoid, 2 2a 2b 2c OCH3 OCH3 H OCH3 H H 5.2 ± 0.4 x 10-7 1.8 ± 0.3 x 10-6 5.8 ± 0.2 x 10-6 Hydrazinobenzoyl curcuminoid, 3 3a 3b 3c OCH3 OCH3 H OCH3 H H 9.3 ± 0.4 x 10-7 2.4 ± 0.1 x 10-6 8.7 ± 0.2 x 10-6 C. Selvam và cộng sự [23] đã tổng hợp một số dẫn xuất imine–curcumin và qua khảo sát các hoạt tính sinh học của các dẫn xuất này cho thấy dẫn xuất HC và isoxazolcurcumin (dẫn xuất 4 và dẫn xuất 7 của hình 2.18) có hoạt tính kháng oxy hóa ở mức độ in vitro (quét gốc DPPH), ở mức độ tiền invivo (trên động vật), ức chế cyclooxygenase (COX1/COX2), kháng viêm cao hơn Cur tương ứng. O O OH R1 OH R2 OHHO R2R1 NHN OHHO R2R1 NO 1. R1=R2=OCH3 2. R1=OCH3; R2=H 3. R1=R2=H 4. R1=R2 =OCH3 5. R1=OCH3; R2= H 6. R1=R2=H 7. R1=R2=OCH3 8. R1 = R2= H NH2-NH2. H2O CH3COOH NH2-OH. H2O CH3COOH Hình 2.18: Phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất imine từ curcuminoid [23] 21 S. Mishra cùng các cộng sự [24] đã tổng hợp và tiến hành khảo sát khả năng ức chế sự phát triển của Plasmodium falciparum (ký sinh trùng gây bệnh sốt rét) của một số dẫn xuất của Cur. Qua đó đã tìm ra được 2 dẫn xuất: Hydrazinocurcumin và 3-nitrophenylpyprazole curcumin có khả năng ức chế sự phát triển của Plasmodium falciparum cao hơn so với Cur. N N HO OH H3CO OCH3 NO2 HO H3CO N NH OH OCH3 Hình 2.19: 3-nitrophenylpyrazolecurcumin Hình 2.20: Hydrazinocurcumin Curcuminsemicarbazone (CSC) được tổng hợp từ phản ứng thế một nguyên tử oxy của nhóm diketo trong Cur bằng nhóm semicarbazone [25]. Kết quả nghiên cứu cho thấy hợp chất này thể hiện hoạt tính chống peroxy hóa lipid của microsome gây ra bởi bức xạ γ trong thử nghiệm TBARS tương tự như Cur. Cả hai chất đều thể hiện hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa này ở mọi liều sử dụng, điều này chứng tỏ rằng cấu trúc diketon khi liên kết với các nhóm chức khác vẫn không mất đi hoạt tính sinh học của Cur. H3CO OCH3 O NNHCONH2 HO OH Hình 2.21: Công thức cấu tạo của CSC [24] Cur thể hiện hoạt tính bắt gốc DPPH nhanh hơn nhiều so với CSC. Điều này được lý giải là do có nhóm thế hút điện tử semicarbazone nên làm giá trị thế oxy hóa của nhóm phenolic trong CSC hơn trong Cur. Nhóm tác giả Đào Hùng Cường, Lê Hải Lợi (Đại học Đà Nẵng) [1] đã tổng hợp thành công dẫn xuất pyrazole giữa phenylhydrazin và Cur, dẫn xuất isoxazole giữa hydroxylamine và Cur. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế 22 gốc tự do DPPH của chúng kết quả cho thấy hai dẫn xuất này đều có khả năng kháng oxy hóa, có khả năng kháng 4 chủng vi khuẩn E.Coli, P.aeruginosa, B.subtillis, S.aureus. Tuy nhiên các hoạt tính sinh học của hai dẫn xuất này đều kém hơn so với Cur. Tác giả Lê Xuân Tiến (Đại Học Bách Khoa TPHCM) [4] đã tổng hợp thành công isoxazolcurcumin (IOZ) và hydrazinocurcumin (HC) từ Cur. Qua khảo sát các hoạt tính sinh học của 2 dẫn xuất này cho thấy IOZ và HC có tính kháng oxy hóa tương tự như Cur. Trong đó IOZ và HC có khả năng gây độc cho dòng tế bào ung thư Hep-G2 cao hơn Cur riêng HC cho hoạt tính cao gấp 2 lần so với Cur. 23 Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Sơ đồ thực nghiệm Quy trình thực hiện để đạt được những mục tiêu của đề tài đã đề ra sẽ được tiến hành theo sơ đồ thực nghiệm 3.1 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ thực nghiệm tiến hành nghiên cứu. Bột curcuminoid >=95% >=95% <9 5% Tổng hợp dẫn xuất Kiểm tra độ tinh khiết, cấu trúc Tinh chế sản phẩm Xác định các hoạt tính sinh học Kiểm tra độ tinh khiết, cấu trúc Phân lập curcumin 95 <9 5% 24 Từ nguyên liệu ban đầu là bột curcuminoid (Viện Dược Liệu Hà Nội) gồm ba thành phần là Cur, DMC và BMDC. Tiến hành tinh chế lần lượt qua hai bước: kết tinh lại và sắc k í cột để phân lập Cur có độ tinh khiết cao (≥ 95%). Sản phẩm thu được sẽ được kiểm tra độ tinh khiết bằng TLC và đo điểm nóng chảy. Sau đó, tổng hợp 2 dẫn xuất DFPHC và HBTC từ Cur tinh đã tách ở trên với 2,4-Difluorophenylhydrazine hydrochlorode, 2-Hydrazinobenzothiazole. Tinh chế sản phẩm và tiến hành kiểm tra cấu trúc và độ tinh khiết bằng TLC, IR, MS, NMR, … Xác định hoạt tính sinh học của hai dẫn xuất vừa tổng hợp được rồi so sánh các hoạt tính trên với Cur tinh. 3.2. Phương pháp thực hiện 3.2.1. Phân lập curcumin Nguyên liệu : Nguyên liệu ban đầu là bột curcuminoid thương phẩm của Viện Dược Liệu Hà Nội được chiết xuất từ nghệ vàng (Curcuma Longa L.). Quy trình phân lập Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập curcumin Hệ dung môi methanol - nước Thời gian 24 giờ, 50C Bột curcuminoid Kết tinh lại Tinh thể Curcumin Sắc ký cột Silicagel 60G 63-200µm Dung môi : 100% CH2Cl2 Cur tinh <9 5% >=95% 25 3.2.1.1. Kết tinh lại ™ Mục đích - Loại bỏ bớt một số tạp chất, chất nhựa trong nguyên liệu. - Thu phần tinh thể có hàm lượng Cur cao giúp cho quá trình sắc ký cột phân lập Cur được dễ dàng và cho hiệu suất cao. ™ Nguyên tắc. Dựa trên tính tan khác nhau của các chất trong dung môi theo nhiệt độ và độ tinh khiết của hỗn hợp đem kết tinh. ™ Phương pháp thực hiện Hóa chất, nguyên liệu Bảng 3.1: Nguyên liệu kết tinh lại STT Nguyên liệu Khối lượng 1 Bột curcuminoid 2g 2 Methanol 500ml 3 Nước cất 100ml Tiến hành Kết tinh lần 1 ƒ Hoà tan hoàn toàn 500mg bột curcuminoid trong methanol ở 50oC. ƒ Thêm từ từ nước cất (ở 50oC) vào cho đến khi dung dịch vừa đục. ƒ Bổ sung thêm methanol vào cho đến khi dung dịch trong trở lại. ƒ Để cho dung dịch trên từ từ hạ về nhiệt độ phòng rồi cho vào tủ đá kết tinh trong 24 giờ ở 5oC. ƒ Lọc hút chân không thu tinh thể chuẩn bị cho giai đoạn tiếp theo. Kết tinh lần 2, 3 ƒ Lấy phần tinh thể đã làm khô sau lần kết tinh trước đó, tiến hành lại các thao tác kết tinh như đã trình bày. ƒ Tinh thể thu được sau khi lọc cũng được làm khô chân không. Cân, ghi kết quả, chuẩn bị cho sắc ký cột. 26 3.2.1.2. Sắc ký bản mỏng (TLC) ™ Mục đích ƒ Xác định hệ dung môi chạy sắc ký cột. ƒ Kiểm tra thành phần, độ tinh khiết các phân đoạn trong sắc ký cột. ™ Nguyên tắc Dựa trên sự tương tác khác nhau giữa các thành phần trong hỗn hợp với dung môi và pha tĩnh, do mỗi thành phần có độ phân cực khác nhau. ™ Phương pháp thực hiện Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất Bảng 3.2 : Nguyên liệu khảo sát dung môi STT Nguyên liệu Khối lượng 1 2 3 4 5 6 Bột curcuminoid sau 3 lần kết tinh. Methanol Dicloromethane Cloroform Acetone Bản mỏng silica gel 60G, Merck 3-5mg 1chai (500 ml) 1chai (500ml) 1chai (500ml) 1chai (500ml) 20x20cm2 ™ Tiến hành Chuẩn bị - Hoạt hóa bản mỏng silica gel bằng cách sấy 1giờ ở 110oC sau đó để cân bằng trong bình hút ẩm 30 phút. - Vuốt ống vi quản bằng ngọn lửa đèn cồn, rửa mao quản 2 lần bằng acetone. Chấm mẫu lên bản mỏng - Hòa tan một ít mẫu curcuminoid vào chai bi bằng methanol. - Dùng ống vi quản hút một ít mẫu đã hòa tan trong chai bi chấm lên bản mỏng. Khoảng cách vết chấm cách bờ dưới 1cm, hai bờ hai bên 1.5cm, và khoảng cách giữa các vết chấm cách nhau 1cm. Kích thước của vết chấm càng nhỏ thì khả năng tách càng tốt. - Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi. 27 Triển khai bản mỏng Chuẩn bị bình triển khai: rửa sạch, sấy khô. Pha hệ dung môi triển khai vào bình lần lượt theo các tỷ lệ xác định. Bão hòa khí quyển trong bình triển khai từ 15-20 phút. Dùng kẹp cho bản mỏng đã chấm mẫu vào bình, đậy nắp bình lại. Theo dõi vạch dung môi di chuyển đến cách mép trên của tấm bản mỏng khoảng 1cm thì lấy bản mỏng ra khỏi bình triển khai. Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi. Phát hiện vết và tính trị số Rf Phát hiện vết qua màu sắc tự nhiên. Phát hiện vết dưới đèn UV (254nm/365nm). Phun thuốc thử H2SO4 10% trong C2H5OH rồi hơ nhẹ trên nhiệt. Tính Rf y xR f = x: là khoảng cách từ điểm chẫm mẫu đến trung tâm của vết sau khi triển khai. y: khoảng cách từ điểm vết chấm đến mức dung môi sau cùng. Hình 3.1: Phương pháp tính Rf Nhận xét và đánh giá các vết trên các bản mỏng để chọn dung môi chạy bản mỏng phù hợp. Chọn dung môi để rửa giải cột sắc ký. 3.2.1.3. Sắc ký cột ™ Mục đích: phân lập các thành phần trong hỗn hợp ban đầu. ™ Nguyên tắc: Dựa vào ái lực khác nhau của các chất trong hỗn hợp ban đầu đối với pha tĩnh trong cột và pha động đi ngang qua cột mà mỗi chất sẽ di chuyển theo pha động ngang qua pha tĩnh với một vận tốc khác nhau, nhờ vậy mà có thể tách riêng từng đơn chất trong hỗn hợp ban đầu. Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ, hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột (pha động) mà nó được rửa ra khỏi cột trước hay sau. 28 ™ Phương pháp thực hiện: Hóa chất, dụng cụ: - Cột thủy tinh. - Silica gel 60G, 0.063-0.200mm, Merck. - Methanol, dicloromethane (Chemsol Vina). - Cát biển 0.1-0.315 (Merck). - Bông y tế sạch. • Pha động: Khảo sát trước bằng TLC và chọn dung môi 100%CH2Cl2. • Pha tĩnh: Silica gel 60G, 0.063-0.200mm, Merck. Khối lượng silica gel cần để nạp cột là 70g. • Cột: Cột thủy tinh Φ=35mm. Chiều cao của cột sau khi nạp silica gel khoảng 16cm • Mẫu: Mẫu là bột curcuminoid khô sau khi đã kết tinh 3 lần. mmẫu = 4.0213g. Mẫu được nạp vào cột theo phương pháp nạp mẫu ướt. Tiến hành Bước 1: Chuẩn bị - Sấy silicagel ở 1100C trong 4 giờ, cân bằng ẩm trong bình hút ẩm trong 30 phút. Ngâm qua đêm với dung môi chạy cột (CH2Cl2). - Cột được rửa sạch, sấy khô, kẹp thẳng góc trên giá, cho bông gòn vào đáy. Bước 2: Nhồi cột - Cho dung môi chạy cột vào đến nửa cột, mở van, từ từ cho silica gel vào cột cho đến khi hết lượng silica gel cần nhồi. - Cho dung môi chạy tuần hoàn khoảng 2-4 giờ để nén lớp silica gel cho đến khi ổn định. Bước 3: Hòa tan hoàn toàn lượng mẫu cần nạp bằng CH2Cl2 rồi nạp hết lượng dung dịch trên vào cột. Bước 4 : Triển khai cột. Bước 5: Thu và kiểm tra các phân đoạn để thu được Cur tinh khiết. 29 3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất imne – curcumin. 3.2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2 hydrazinobenzothiazolcurcumin a/ Quy trình tổng hợp Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC) Sắc ký cột - Khuấy trộn, hoàn lưu - Nhiệt độ: 60oC Dung môi: CH3COOC2H5: H2O Imine hóa Loại dung môi Phân lập Rửa, chiết Cô giảm áp Kiểm tra - TLC, đo điểm chảy - IR, MS, NMR 2 hydrazinobenzothiazole Curcumin Dung môi: CH3OH Chỉnh về pH~5 (CH3COOH) Khảo sát hoạt tính sinh học <9 5% >=95% 30 b/ Phương pháp thực hiện ™ Hóa chất, dụng cụ, nguyên liệu: - Curcumin tinh (sản phẩm từ sắc ký cột giai đoạn trước). - 2- Hydrazinobenzothiazole 97%. (CTPT: C7H7N3S, M =165.22 ) - Acetic acid. - Sodium acetate. - Methanol, diclomethane, Ethyl acetate (Chemsol Vina). ™ Tiến hành - Cân 448.96mg 2-Hydrazinebenzothiazole vào bình cầu rồi hòa tan bằng methanol. - Điều chỉnh pH của dung dịch trên về pH = 5 bằng CH3COOH, cho tiếp 500 mg Cur tinh vào bình cầu và khuấy trên bếp khuấy từ. - Thực hiện phản ứng imine hóa trong ở 600C, có khuấy trộn, hoàn lưu liên tục. - Kiểm tra điểm dừng phản ứng bằng TLC với bản mỏng silica gel trong hệ dung môi CH2Cl2: CH3OH (98:2)( v/v) so với hỗn hợp ban đầu của phản ứng. Nhận thấy khi bản mỏng xuất hiện vết lạ phản quang màu tím dưới đèn UV và vết Cur nhạt thì ngưng phản ứng và tiến hành xử lý mẫu. c/ Xử lí mẫu sau phản ứng Mục đích: Loại bỏ bớt tạp chất sau phản ứng ra khỏi hỗn hợp. Hóa chất, nguyên liệu - Ethyl acetate (Chemsol Vina) - Nước cất. - Hỗn hợp sau phản ứng. Tiến hành: - Cô quay chân không để loại dung môi của hỗn hợp sau phản ứng. - Hòa tan hoàn toàn cắn thu được bằng ethylacetate. - Cho hỗn hợp trên vào phễu chiết từ từ thêm nước cất vào lắc đều. - Để yên cho dung dịch trên tách ra thành 2 lớp, mở van từ từ loại bỏ lớp dung dịch nước ở phía dưới, giữ lại lớp dung dịch ethylacetate ở phía trên. - Lặp lại quá trình chiết như trên khoảng 3 lần thì ngừng. 31 - Làm khan dung dịch ethylacetate thu được bằng Na2SO4 khan. - Cô quay giảm áp loại dung môi thu cao sản phẩm thô. d/ Tinh chế mẫu Sau khi xử lý mẫu tiến hành sắc ký cột để phân lập HBTC. ™ Sắc ký cột thô Hóa chất, nguyên liệu: Dicloromethane (Chemsol Vina), Ete dầu (30-60) (Trung Quốc) Cao sản phẩm thô sau phản ứng tổng hợp HBTC. Điều kiện sắc ký cột: - Silica gel 60G (0.063-0.200mm, Merck) được hoạt hoá ở 110oC, 4 giờ trước khi nhồi cột. - Cột sắc ký: đường kính 3cm, chiều cao silica gel trong cột: 30cm. - Hệ dung môi triển khai sắc ký cột: dicloromethane:eter dầu (70:30) (v/v) Điều kiện sắc ký bản mỏng để kiểm tra quá trình sắc ký cột: - TLC silica gel 60G F254 (Merck) được hoạt hoá ở 110oC, 1 giờ. - Bản mỏng 5cm x10cm, chiều cao triển khai bản mỏng: 8cm. - Hệ dung môi triển khai TLC: CH2Cl2:CH3OH: (98:2) (v/v). - Hiện màu TLC dưới đèn UV (254nm/365nm). ™ Sắc ký cột tinh Hóa chất, nguyên liệu: Dicloromethane (Chemsol Vina). Sản phẩm từ sắc ký cột thô. Điều kiện sắc ký cột: - Silica gel 60G, 0.04-0.06mm, Merck được hoạt hoá ở 110oC, 4 giờ trước khi nhồi cột. - Cột sắc ký: đường kính 2.5cm, chiều cao silica gel trong cột: 30cm. - Hệ dung môi triển khai sắc ký cột: 100%CH2Cl2 Điều kiện sắc ký bản mỏng để kiểm tra quá trình sắc ký cột: - TLC silica gel 60G F254 (Merck) được hoạt hoá ở 110oC, 1 giờ. - Bản mỏng 5cm x10cm, chiều cao triển khai bản mỏng: 8cm. - Hệ dung môi triển khai TLC: CH2Cl2:CH3OH = 98:2 (v/v). - Hiện màu TLC: dưới đèn UV (254nm/365nm). 32 3.2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất 2,4 diflorophenylhydrazinocurcumin a/ Quy trình tổng hợp Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp 2,4-Diflorophenylhydrazino curcumin (DFPHC) Sắc ký cột - Khuấy trộn, hoàn lưu - Nhiệt độ: 60oC Dung môi: CH3COOC2H5: H2O Imine hóa Loại dung môi Phân lập Rửa, chiết Cô giảm áp Kiểm tra - TLC, đo điểm chảy - IR, MS, NMR 2,4-Difluorophenylhydrazine hydrochloride Curcumin Dung môi: CH3OH Chỉnh về pH~5.0 (CH3COONa) Khảo sát hoạt tính sinh học >=95% <9 5% 33 b/ Phương pháp thực hiện Hóa chất, dụng cụ, nguyên liệu • Curcumin tinh khiết đã phân lập ở thí nghiệm trên. • 2,4-Difluorophenylhydrazine hydrochlorode 97% (CTPT: C6H6F2N2. HCl, M =180.59 ) • Sodium acetate (CH3COONa) • Methanol • Ethylacetate • Natrisulfat khan • Nước cất. Tiến hành Cân 500mg Cur tinh và 490.74mg 2,4-Difluorophenylhydrazine hydrochlorode. Cho 2,4-Difluorophenylhydrazine hydrochlorode vào bình cầu 2 cổ rồi hòa tan hoàn toàn bằng CH3OH. Điều chỉnh pH của dung dịch về pH=5 bằng CH3COONa. Cho tiếp Cur tinh vào bình cầu và đặt trên bếp khuấy từ. Thực hiện phản ứng imine hóa ở 60oC, khuấy trộn liên tục. Duy trì ổn định các điều kiện phản ứng và kiểm tra liên tục bằng TLC với bản mỏng silica gel trong hệ dung môi triển khai CH2Cl2: CH3OH (98:2)(v/v) cho đến khi vết Cur trong bình phản ứng nhạt đi và xuất hiện vết lạ ngay trên đầu Cur, vết này đậm dần lên cho phản quang màu tím khi cho hiện màu dưới đèn UV thì dừng phản ứng và tiến hành xử lý mẫu. c/ Xử lý mẫu sau phản ứng Mục đích: Loại bỏ bớt tạp chất ra khỏi hỗn hợp sau phản ứng Hóa chất, nguyên liệu - Ethyl acetate (Chemsol Vina) - Nước cất - Hỗn hợp chất sau phản ứng. Tiến hành: thực hiện tương tự như quá trình xử lý mẫu của HBTC 34 d/ Tinh chế sản phẩm Để làm tinh sản phẩm hay tách sản phẩm DFPHC ra khỏi hỗn hợp sau phản ứng phải tiến hành sắc ký cột thô với pha tĩnh là Al2O3 trung tính, pha động là CH2Cl2: CH3OH: 99:1(v/v) sau đó tăng dần lên đến tỷ lệ CH2Cl2: CH3OH: 70:30 (v/v). ™ Sắc ký cột thô Hóa chất, nguyên liệu: Dicloromethane, methanol (Chemsol Vina) Cao sản phẩm thô sau phản ứng tổng hợp DFPHC Điều kiện sắc ký cột: - Aluminium oxide 60, 0.063-0.200 mm, trung tính (Merck) được hoạt hoá ở 110oC, 4 giờ trước khi nhồi cột. - Cột sắc ký: đường kính 3.5cm, chiều cao aluminium oxide trong cột: 16cm. - Hệ dung môi triển khai sắc ký cột: CH2Cl2:CH3OH: 99:1 (v/v) sau đó tăng dần lên CH2Cl2:CH3OH: 70:30 Điều kiện sắc ký bản mỏng để kiểm tra quá trình sắc ký cột - TLC Aluminium 60G trung tính, F254 (Merck) được hoạt hoá ở 110oC, 1 giờ. - Bản mỏng 5cmx10cm, chiều cao triển khai bản mỏng: 8cm. - Hệ dung môi triển khai TLC: CH2Cl2:CH3OH (98:2) (v/v). - Hiện màu TLC: đèn UV (254nm/365nm) ™ Sắc ký cột tinh Hóa chất, nguyên liệu: Dicloromethane (Chemsol Vina), Sản phẩm DFPHC từ sắc ký cột thô. Điều kiện sắc ký cột: - Silica gel 60G, 0.04-0.06mm, Me