Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của cao ethyl acetate từ lá cây muồng hoàng yến cassia fistula l. họ vang (caesalpiniaceae)

nna, golden shower, purging fisyula, pudding pipe tree, purging cassia (Anh); canéficier, séné fistuleux, casse d'Inde, casse fistuleux (Pháp). Hình 1.1: Hoa Muồng hoàng yến Hình 1.2: Cây Muồng hoàng yến KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 14 Phân loại Giới (regnum) Plantae Không phân hạng Angiospermae Không phân hạng Eudicots Không phân hạng Rosids Bộ (ordo) Fabales Họ (familia) Fabaceae Phân họ (subfamilia) Caesalpinioideae Tông (tribus) Cassieae Chi (genus) Cassia Loài (species) fistula Tên hai phần Cassia fistula L. Tên đồng nghĩa khác Bactyrilobium fistula Willd Cassia bonplandiana DC Cassia fistuloides Collad. Cassia rhombifolia Roxb. Cathartocarpus excelsus G.Don Cathartocarpus fistula Pers. Cathartocarpus fistuloides (Collad.) G.Don KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 15 1.1.1 Đặc điểm thực vật Hình 1. 3: Cây Muồng hoàng yến Hình 1. 4: Cây Muồng hoàng yến Hình 1.5: Quả Muồng hoàng yến Hình 1. 6: Lá và hoa Muồng hoàng yến Cây gỗ nhỡ, cao 6-12m. Cành sum suê, tỏa rộng, nhẵn. Lá kép long chim nhẵn, mọc so le, có trục dài 15-25cm, 5-6 đôi lá chét hình lục lăng, dài 7-12cm, rộng 4- 8cm, mặt trên nhẵn, mặt dưới có long trắng nhạt, sau nhẵn, thường nhọn ở đầu hình góc rộng ở gốc, lá kèm sớm rụng, cuống lá dài 15-30cm. Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành chum, dài 15-30cm; lá bắc nhỏ, sớm rụng; hoa màu vàng; đài hình bầu dục, 5 răng có lông ở mặt ngoài; tràng 5 cánh, có móng ngắn hẹp; nhị 10 cái, có 3 cái rất dài, 4 cái trung bình và 3 cái rất nhỏ, bầu và vòi nhụy có lông. Quả hình trụ, dài 40-50cm; hạt dẹp, hình bầu dục, màu nâu bóng, có rất nhiều hạt, có cơm bao bọc chứa trong những vách hóa gỗ, mỏng. Mùa hoa quả: tháng 5-10. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 16 1.1.2 Phân bố sinh thái Muồng hoàng yến phân bố rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, Malaysia, Indonesia, Philippin, New Guinea, Thái Lan, Campuchia, Lào Cây còn được trồng ở Ai Cập và Trung Quốc. Ở Việt Nam, Muồng hoàng yến phân bố chủ yếu ở các tỉnh Tây Ninh, Bình Phước, Đồng Nai, Bình Dương, các tỉnh Nam Trung Bộ và Tây Nguyên. Cây còn được trồng ở một số thành phố lớn như Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh Muồng hoàng yến thuộc loại cây gỗ nhỡ, mọc rải rác trong các kiểu rừng thưa nửa rụng lá hoặc rừng thứ sinh. Cây ưa sáng, lúc còn nhỏ có thể hơi chịu bóng, thích nghi cao với khí hậu nhiệt đới điển hình, nhiệt độ trung bình năm vào khoảng 25oC, nhiệt độ tối thấp trung bình 20oC, tối cao trung bình 28-29oC. Lượng mưa trung bình hằng năm là 1500-2500 mm. Cây có thể chịu được khô hạn. Những cây trồng ở đường phố và công viên ở Hà Nội đã tỏ ra thích nghi được với nền nhiệt độ thấp hơn, có mùa đông lạng kéo dài. Cây trồng từ hạt sau 4-6 năm bắt đầu có hoa; hoa ra hàng năm; tái sinh từ hạt tốt. Muồng hoàng yến là loại cây gỗ trồng xen khi mới trồng rừng. Cây trồng ở thành phố vừa để làm cảnh vừa lấy bóng mát. Gỗ dùng làm đồ gia dụng. Vỏ là nguồn nguyên liệu chiết tannin. 1.1.3. Bộ phận dùng Quả, hạt, rễ và vỏ. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 17 1.2. CÔNG DỤNG 1.2.1. Theo y học cổ truyền [2], [3], [23] Quả Muồng hoàng yến dùng sống chữa táo bón với liều 4-6 g (nhuận tràng), hoặc 10-20 g (tẩy); ngâm rượu uống làm thuốc tiêu, bổ, giúp ăn ngon cơm, đỡ đau lưng, đau người. Cơm quả và hạt (1 kg) sắc với một lít nước, lọc và cô cách thuỷ thành cao, là thuốc chữa đau lưng, đau mình, lỵ, tiêu chảy với liều 5-15 g. Lá tươi giã nát vắt lấy nước bôi chữa hắc lào, và sắc uống có thể chữa đau lưng và để nhuận tràng, với liều 15-20 lá. Ở một số nước Đông Nam Á, vỏ quả chín và hạt Muồng hoàng yến được dùng để nhuận tràng. Vỏ rễ, lá và hoa có tác dụng nhuận tràng yếu hơn. Nước sắc rễ để sát trùng vết thương, vết loét. Vỏ thân được dùng ở Java trị bệnh ngoài da, và dùng đắp lên chỗ bị rắn và bò cạp cắn ở Campuchia. Ở Philippin, lá đắp trị bệnh nấm da. Ở Thái Lan, người ta dùng thịt quả làm thuốc nhuận tràng và long đờm; hoa dùng hạ nhiệt và nhuận tràng; gỗ dùng trừ giun, nhất là giun đũa. Trong y học hiện đại, cơm quả Muồng hoàng yến đôi khi đựơc dùng làm thuốc nhuận tràng cho trẻ em. Tuy vậy cần thận trọng vì nếu dùng hằng ngày và kéo dài có thể dẫn đến quen thuốc. Ở Trung Quốc, vỏ thân, quả được dùng làm thuốc, vỏ thân dùng trị đau răng, quả dùng trị nhiệt bệnh, trẻ con cam tích và bí đại tiện ở người già. Ở Ấn Độ, cây còn được gọi là “aragvadha” nghĩa là “tiêu diệt bệnh”. Nhân dân dùng cao từ cơm quả để nhuận tràng nhưng ít khi dùng riêng. Cao vỏ rễ được thử nghiệm và thấy có tác dụng tốt trong điều trị sốt tiểu đen. Vỏ thân trị bệnh ngoài da. Quả trị đái tháo đường, với liều uống mỗi lần 5g, cứ 8 giờ một lần, dưới dạng thuốc bột hoặc thuốc sắc. Quả Muống hoàng yến có trong thành phần một số bài thuốc cổ truyền Ấn Độ trị bệnh gan và sỏi niệu. Ngoài ra, hoa của cây cũng được dung như một loại rau cải ăn sống, nấu canh rất phổ biến tại nhiều vùng của Ấn Độ. Ở Nepal, nhân dân dùng cơm quả Muồng hoàng yến với liều uống mỗi lần 5g, để làm phân mềm dễ đi ngoài và trị tiểu tiện có lẫn máu, uống mỗi lần 4 thìa cà phê, ngày 3 lần. Nước sắc vỏ than được dùng súc miệng trị viêm họng. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 18 Ở Haiti, nhân dân uống nước sắc lá hoặc quả Muồng hoàng yến để trị bệnh ký sinh trùng đường ruột. Nước ngâm lá dùng để tắm hoặc bôi xoa để chữa bệnh ngoài da. Nước sắc lá uống chữa khó tiêu. Ở Guatemala, vỏ cây được dùng để chữa bệnh đường tiết niệu. Ở Panama, nhân dân dùng Muồng hoàng yến trị đái tháo đường. 1.2.2. Theo y học hiện đại Cơm quả Muồng hoàng yến có tác dụng nhuận tràng một phần do chứa nhiều pectin và chất nhày; tác dụng nhuận tràng của cơm quả và lá chủ yếu do các dẫn chất anthraquinone. Phần đường trong glycosid làm tăng độ hoà tan và thuốc được vận chuyển dễ dàng đến điểm tác dụng là kết tràng. Ở đây, vi khuẩn thủy phân glycosid thành anthraquinone, rồi thành anthron, chất này tác động trực tiếp lên đại tràng gây kích thích nhu động [1]. Hạt Muồng hoàng yến có tác dụng diệt amip và kén Entamoeba histolytica in vitro và in vivo, có thể trị bệnh amip ruột và gan ở động vật thí nghiệm và bệnh amip ruột ở người. Muồng hoàng yến cũng có tác dụng diệt côn trùng và diệt giun [2]. Trên chuột cống trắng gây tăng cholesterol máu thực nghiệm, Muồng hoàng yến làm giảm lipid toàn phần trong máu và gan, và làm giảm lipid với mức độ thấp hơn trong lách, thận và tim. Cholesterol toàn phần trong máu, lách, thận và tim giảm đáng kể. Nồng độ triglyceride được cải thiện rõ rệt. Tuy nhiên, có sự tăng trung bình phospholipids ở tất cả các cơ quan. Muồng hoàng yến cũng làm giảm hoạt độ tăng cao của GOT, GPT, phosphatase kiềm acid, các trị số trở về mức ban đầu. Protein huyết thanh toàn phần, albumin, globulin, tỷ lệ A/G, các acid amin tự do, acid uric, creatinin cũng được cải thiện và trở về gần mức bình thường. Phân đoạn tan trong nước của Muồng hoàng yến gây giảm đường máu ở chuột nhắt trắng, và gây tăng sự dung nạp của glucose [9], [22]. Cao nước và các flavonoid từ lá, thân, vỏ rễ và cơm quả Muồng hoàng yến có hoạt tính giảm đau, kháng viêm và hạ sốt. Cao vỏ rễ có hoạt tính mạnh nhất. hoạt tính được quy cho các flavonoid có tác dụng làm giảm độ thấm mao mạch do tác dụng gây co mạch trực tiếp. Vỏ thân và vỏ quả Muồng hoàng yến có tác dụng chống đái tháo KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 19 đường thực nghiệm trên động vật. Cao chiết với chloroform, alcohol ethylic, nước của Muồng hoàng yến có hoạt tính kháng nấm in vitro chống những nấm gây bệnh toàn thân và nhiều loại vi khuẩn [10], [11], [27]. 1.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY MUỒNG HOÀNG YẾN 1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Năm 1966, Murty và cộng sự đã cô lập hợp chất rhein (1), fistucasidin (2) và barbaloin (3) từ gỗ cây Muồng hoàng yến [11]. Cũng trong năm 1966, Kumar và cộng sự đã cô lập được kaempferol (4) và rhein (1) từ cao ethanol của hoa Muồng hoàng yến [16]. Năm 1964, Kaji và cộng sự đã cô lập được sennoside A (5) và sennoside B (6) từ lá Muồng hoàng yến [8]. Năm 1969, từ cánh hoa và bao phấn của hoa Muồng hoàng yến, Sircar và cộng sự cô lập được gibberellic acid (7), một hormon kích thích sự sinh trưởng của thực vật [19]. Năm 1972, Agrawal và cộng sự đã cô lập được một anthraquinone acid là fistulic acid (8) từ hạt Muồng hoàng yến [10]. Năm 1984, Mahesh và cộng sự đã cô lập được kaempferol (4) cùng với ba anthraquinone gồm chrysophanol (9), rhein (1) và physicion (10) từ lá cây Muồng hoàng yến và lá 5 loài khác cùng chi (Cassia grandis L., Cassia nodosa Hamilt, Cassia renigera Wall, Cassia javanica L., và Cassia marginata Roxb) [9]. Năm 1988, Morimoto và cộng sự cô lập được (+) catechin (11), (-) epiafzelechin (12), (-) epiafzelechin 3-O-β-D-glucopyranoside (13), (-) epicatechin (14) và procyanidin B2 (15) từ lá Muồng hoàng yến [20]. Năm 1996, Vaishnav và cộng sự đã cô lập được rhamnetin 3-O-gentiobioside (16) từ rễ cây Muồng hoàng yến [20]. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 20 Năm 1998, Meena Rani và cộng sự đã cô lập được hợp chất 3-formyl-1-hydroxy- 8-methoxyanthraquinone (17) từ hạt Muồng hoàng yến [10]. Năm 2001, Ching-Kuo Lee và cộng sự đã cô lập từ vỏ hạt Muồng hoàng yến 27 hợp chất gồm 1-hexacosanol (18), 1-octacosanol (19), palmitic acid (20), stearic acid (21), oleic acid (22), linoleic acid (23), heptacosyl eicosanate (24), glyceryl-1- tetraeicosanoate (25); ba sterol, β-sitosterol (26), stigmasterol (27), β-sitosteryl-3-O- D-glucopyranoside (28); một triterpene, lupeol (29); tám anthraquinone, chrysophanol (9), emodin (30), physicion (10), citreorosein (31), rhein (1), rhein methyl ester (32), ziganein (33), 1,4,5-trihydroxyanthraquinone (34); hai coumarin, isoscopoletin (35), scopoletin (36); hai chromone, 2,5-dimethyl-7-hydroxychromone (37), 2,5-dimethyl- 7-methoxychromone (38); ba hợp chất vòng thơm, isovanillic acid (39), vanillic acid (40), và 2,4-dihydroxybenzaldehyde (41) [7]. Năm 2002, Yueh-Hsiung Kuo và cộng sự đã cô lập được từ hạt Muồng hoàng yến bốn hợp chất mới, 5-(2-hydroxyphenoxymethyl)furfural (42), (2′S)-7-hydroxy-5- hydroxymethyl-2-(2′-hydroxypropyl)chromone(43), benzyl-2-hydroxy-3,6-dimethoxy- benzoate (44), và benzyl 2-O-β-D-glucopyranosyl-3,6-dimethoxybenzoate (45), cùng với bốn hợp chất đã biết, 5-hydroxymethylfurfural (46), (2′S)-7-hydroxy-2-(2′- hydroxypropyl)-5-methylchromone (47), và hai oxyanthraquinone, 1,8-dihydroxy-3- methylanthraquinone (chrysophanol) (9) và 8-O-β-D-glucopyranosyl-1-hydroxyl-3- methyl-anthraquinone (chrysophanein) (48) [21]. 1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Năm 2011, nhóm tác giả Lê Tiến Dũng, Nguyễn Hữu An đã cô lập hai flavone glycoside, astragalin (51), kaempferol-3-O-neohesperidoside (52) và một anthraquinone, 1,3,8-trihydroxyanthraquinone (53) [3]. Dưới đây là cấu trúc của một số hợp chất điển hình đã được cô lập từ cây Muồng hoàng yến. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 21 Các hợp chất flavonoid O OH OH HO OH OH O O OH OH HO OH (2) (4) O O OH OH HO OH OH O OH OH HO OH H (11) (12) O O OH OH HO OH OH O OOH HO OCH3 (14) (50) O OH OH HO OH O H OH OH HO OH OH OH (15) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 22 Các hợp chất anthraquinone R2 OH O O OH R1 R1 R2 (1) COOH H (9) CH3 H (10) CH3 OCH3 (30) OH CH3 (31) CH2OH CH3 (32) COOCH3 H (53) OH H O O OH R2 R1 OH (33) (34) R1 CH3 H R2 H OH O O OH H3CO H3CO OH COOH CH3 OH O O OH CHO OCH3 (8) (17) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 23 Các hợp chất glycoside O glc OH OH OH O Oβ-D-glc-O OH COOH HOOC OH O-β-D-glc HH (3) (5) O Oβ-D-glc-O OH COOH HOOC OH O-β-D-glc HH O H O-glc OH HO OH (6) (13) O O-gentiobose OH H3CO OH OH O glc-O (16) (28) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 24 H3CO O-glc OCH3 O O O O O-glc OH (45) (48) O OH HO O OH OR (51) R = Glu (52) R = Glu2-1Rha Các hợp chất sterol HO HO (26) (27) HO (46) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 25 Các hợp chất terpen HO (29) Các hợp chất khác (18) CH3(CH2)25OH (19) CH3(CH2)27OH (20) CH3(CH2)14COOH (21) CH3(CH2)16COOH (22) H3C(H2C)7 (CH2)7COOH (23) H3C(H2C)4 (CH2)7COOH (24) CH3(CH2)18COO(CH2)16CH3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 26 (25) O R1 R2 O R1 R2 (35) OH OCH3 (36) OCH3 OH O CH3 RO O OH CHO HO (41) (37) R = H (38) R = CH3 R1 R2 COOH OOHC O HO (42) R1 R2 (39) OH OCH3 O O OH OH HO (43) (40) OCH3 OH CH22OOC(CH22)2222CH3 CHOH CH22OH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 27 H3CO OH OCH3 O O OOHC OH (44) (46) O O OH HO HO CH3 CO O COOH CH2 OH (47) (7) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 28 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 29 2.1. ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM 2.1.1. Hóa chất Hạt silica gel cỡ hạt 0,04-0,06 mm dùng cho pha thường và RP-18 dùng cho pha đảo. Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien F254 (Merck) dùng cho pha thường và RP-18 F254s (Merck) dùng cho pha đảo. Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm + Hexane sử dụng có nhiệt độ sôi 69°C. + Chloroform sử dụng có nhiệt độ sôi 61°C. + Ethyl acetate sử dụng có nhiệt độ sôi 78°C. + Methanol sử dụng có nhiệt độ sôi 64,5°C. + Ethanol sử dụng có nhiệt độ sôi 78,4°C. + Nước cất. Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng: dùng 10% H2SO4/EtOH, 1% FeCl3/EtOH. 2.1.2. Thiết bị Đèn UV tử ngoại cầm tay, bước sóng 254 nm và 365 nm hiệu UVITEC. Máy cô quay chân không Buchi – 111. Bếp cách thủy Julabo 461 Water Bath. Thiết bị gia nhiệt hồng ngoại, hiệu SCHOTT. Cột sắc ký đường kính từ 2 cm – 5,5 cm. Cân phân tích AND HR 200. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 30 2.2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nguyên liệu Lá cây Muồng hoàng yến Cassia fistula L. họ Vang (Caesalpiniaceae) được thu hái ở thành phố Hồ Chí Minh vào tháng 8 năm 2010. Lá tươi sau khi thu hái, loại bỏ những lá sâu bệnh, vàng úa, rửa sạch, để ráo, sấy khô, nghiền nhuyễn thành bột, được sử dụng cho phần nghiên cứu. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp ngâm dầm, trích kiệt bằng ethanol để trích ly các hợp chất ra khỏi nguyên liệu. Sử dụng kỹ thuật sắc kí cột với chất nhồi cột là silica gel pha thường, silica gel pha đảo RP-18; sắc kí lọc gel với chất nhồi cột là gel sephadex LH-20; kết hợp sắc kí lớp mỏng để cô lập các chất tinh khiết. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4/EtOH 10% hay FeCl3/EtOH 1%. 2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 2.3.1. Điều chế cao ethanol Bột lá khô của cây Muồng hoàng yến được ngâm dầm bằng ethanol 96o trong 24 giờ. Sau đó lọc lấy dung dịch, cô quay thu hồi dung môi. Tiếp tục thực hiện nhiều lần cho đến khi lượng cao thu được không đáng kể, thu được cao ethanol. 2.3.2. Điều chế các loại cao Cao ethanol được tiến hành trích pha rắn SKC silica gel với dung môi giải ly lần lượt là hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol. Sau đó cô quay và thu được các cao tương ứng. Qui trình điều chế các loại cao trong sơ đồ 2.1. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 31 2.4. QUÁ TRÌNH CÔ LẬP Sử dụng SKC silica gel pha thường trên cao ethyl acetate, sau đó tiến hành SKC silica gel pha thường, SKC silica gel pha đảo RP-18 và sắc kí cột sephadex LH- 20 nhiều lần trên những phân đoạn thu được để cô lập các hợp chất. Toàn bộ quá trình trên được theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng với thuốc thử hiện hình là dung dịch H2SO4/EtOH 10%, dung dịch FeCl3/EtOH 1%, soi đèn UV. Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế cao và cô lập các hợp chất từ lá cây Muồng hoàng yến Bột lá khô (2.9 kg) Cao ethanol (146.2g) Cao hexane (15.8g) EA1 (4.9g) EA2 (7.2g) EA3 (5.1g) EA4 (11.5g) EA5 (8.7g) Cao chloroform (32.1g) Cao ethyl acetate (41.4g) Cao methanol (25.9g) - Ngâm, tận trích bằng ethanol - Lọc. cô quay thu hồi dung môi - Trích pha rắn trên silica gel - Cô quay thu hồi dung môi CFA-IV (5.0mg) CFA-V (2.0mg) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 32 2.4.1. Khảo sát cao ethyl acetat (41,4 g) Cao EtOAc được SKC silica gel pha thường với các hệ dung môi rửa giải: H:EtOAc và EtOAc:MeOH có độ phân cực tăng dần, các đoạn giống nhau trên SKLM được gom chung lại thành 5 phân đoạn, kí hiệu là EA1-EA5. Quá trình khảo sát cao EtOAc được tóm tắt trong bảng 2.1. Bảng 2.1: Sắc kí cột trên cao EtOAc (41,4 g) Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (g) Kết quả SKLM Ghi chú EA1 H:EA 100:0-10:1 4,9 Nhiều vết Không khảo sát EA2 H:EA 5:1-1:1 9,2 Nhiều vết Không khảo sát EA3 EA 5,1 Vết vàng Khảo sát EA4 EA:M 1:1 11,5 Nhiều vết Không khảo sát EA5 M 8,7 Nhiều vết Không khảo sát 2.4.2. Khảo sát phân đoạn EA3 Cao EA3 được tiến hành SKC silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là H:EA 1:1, các đoạn giống nhau trên SKLM được gom chung lại thành 4 phân đoạn, kí hiệu là EA3.1-EA3.4. Phân đoạn EA3.2 được tiến hành SKC trên silica gel pha thường với dung môi rửa giải là CHCl3:MeOH 10:1, các đoạn giống nhau trên SKLM được gom chung lại thành 5 phân đoạn, kí hiệu là EA3.2.1-EA3.2.5. Cao EA3.2.3 được SKC sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải là CHCl3 :MeOH1:1, các phân đoạn giống nhau trên SKLM được gom chung lại thành 4 phân đoạn (V1-V4). Kết quả được tóm tắt trong bảng 2.2 sau: KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 33 Bảng 2.2: Kết quả sắc kí cột tại phân đoạn EA3.2.3 Phân đoạn Tên mã hóa Khối lượng (mg) Kết quả SKLM Ghi chú 1 2 3 4 V1 V2 V3 V4 40.1 121 25.5 10 Nhiều vết Nhiều vết Vết vàng Vết vàng Không khảo sát Không khảo sát Khảo sát Khảo sát 2.4.3. Khảo sát phân đoạn V3 (m= 25.5mg) Hình 2. 1: Hợp chất CFA-V Phân đoạn V3 được SKC sephadex LH-20 với hệ dung môi rửa giải MeOH- CHCl3 1:1, các đoạn giống nhau được gom chung thành 3 phân đoạn (V3.1-V3.3). Phân đoạn V3.1 tiếp tục được SKC silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi rửa giải MeOH:H2O thu được 3 phân đoạn (V3.1.1-V3.1.3). Tiếp tục SKC sephadex LH- 20 với hệ dung môi rửa giải CHCl3-MeOH 1:1 đối với phân đoạn V3.1.2, thu được hợp chất sạch, kí hiệu CFA-V (m= 2.0mg). Quá trình phân lập CFA-V được tóm tắt trong bảng 2.3. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 34 Bảng 2.3: Kết quả sắc kí cột tại phân đoạn V3 Phân đoạn Tên mã hóa Kết quả SKLM Ghi chú 1 2 3 V3.1.1 V3.1.2 V3.1.3 Nhiều vết Vết vàng Nhiều vết Không khảo sát Khảo sát, thu được CFA-V (m=2.0mg) Không khảo sát 2.4.4. Khảo sát phân đoạn V4 (m= 10.0 mg) Hình 2. 2: Hợp chất CFA-IV Phân đoạn V4 được SKC sephadex LH-20 với hệ dung môi CHCl3 –MeOH 1:1, các đoạn giống nhau được gom chung thành 2 phân đoạn (V4.1 và V4.2). Trong đó, phân đoạn V4.2 thu được là hợp chất sạch, kí hiệu là CFA-IV (m=5.0 mg). Quá trình cô lập CFA-IV được tóm tắt trong bảng sau: Bảng 2.4: Kết quả sắc kí cột tại phân đoạn V4 Phân đoạn Tên mã hóa Kết quả SKLM Ghi chú 1 2 V4.1 V4.2 Nhiều vệt Vệt rõ Không khảo sát Khảo sát, thu được CFA-IV (m=5.0mg) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 35 2.5 CÁC SỐ LIỆU THỰC NGHIỆM 2.5.1. Hợp chất CFA-IV Hợp chất CFA-IV thu được dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 276-278oC. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3COCD3), ( Phụ lục 1), δ (ppm), J (Hz): 12.16(1H, s, 5-OH); 9.76 (s. OH); 9.09 (s, OH) 8.15 (2H, d, 9Hz, H-2’/ H-6’); 7.02 (2H, d, 9Hz, H-3’/H-5’); 6.53 ( 1H, s, H-8); 6.26 (1H, s, H-6). Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3COCD3 ), (Phụ lục 2), δ (ppm): 176.6 (C-4); 165.0 (C-7); 162.3 (C-5); 160.1 (C-4’); 157.8 (C-9); 147.0 (C-2); 136.6 (C-3); 130.4 (C-2’/ C-6’); 123.3 (C-1’); 116.3 (C-3’/ C-5’); 104.1 (C-10); 99.2 (C-6); 94.5 (C-8). 2.5.2. Hợp chất CFA-V Hợp chất CFA-V thu được dạng tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 209-211oC. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3COCD3), (Phụ lục 6), δ (ppm), J (Hz): 7.73 (1H, d, 8.5Hz, H-5); 7.40 (2H, d, 9.0Hz, H-2’/H-6’); 6.90 (2H, d, 8.0Hz, H-3’/ H-5’); 6.57 (1H, dd, 8.0Hz; 2.5Hz, H-6); 6.42 ( 1H, d, 2.5Hz, H-8); 5.46 (1H, dd, 13.0Hz; 3.0Hz, H-2); 3.06 (1H, dd, 16.5Hz; 13Hz, H-3e); 2.69 (1H, dd, 16.5Hz; 3.0Hz, H-3a). Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3COCD3 ), (Phụ lục 7), δ (ppm): 190.48 ( C-4); 165.37 (C-7); 164.54 (C-9); 158.62 (C-4’); 131.31 (C-1’); 129.5 (C-5); 128.92 (C- 2’/C-6’); 116.15 (C-3’/C-5’); 115.20 (C-10); 111.23 (C-6); 103.70 (C-8); 80.54 (C-2); 44.69(C-3). KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 37 3.1. GIỚI THIỆU CHUNG Trong khoá luận này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cao ethyl acetate từ lá cây Muồng hoàng yến Cassia fistula L. họ Vang (Caesalpiniaceae). SKC silica gel pha thường trên cao ethyl acetate gom thành 5 phân đoạn. Tiến hành khảo sát phân đoạn 3, chúng tôi cô lập được các hợp chất được kí hiệu lần lượt là CFA-IV, CFA-V. Bằng các phương pháp phổ nghiệm, cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định lần lượt là kaempferol (4) và liquiritigenin (54). O O OH OH HO OH (4) O OH O HO (54) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 38 3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT 3.2.1. Hợp chất CFA-IV Hợp chất CFA-IV cô lập được ở dạng bột màu vàng có nhiệt độ nóng chảy 276- 278oC, tan trong dung môi acetone. Hợp chất này cho phản ứng dương tính với thuốc thử FeCl3/EtOH, chứng tỏ CFA-IV là một phenolic. Phổ 13C-NMR của hợp chất CFA-IV xuất hiện 13 tín hiệu, trong đó có 2 tín hiệu ở δC 130.46ppm và δC 116.35ppm có cường độ gấp đôi. Vậy trong công thức cấu tạo của hợp chất CFA-IV có tổng cộng 15 carbon, gồm 1 carbon carbonyl [δC 176.6 (C- 4)], 12 carbon vòng thơm [δC 165.0 (C-7); 162.3 (C-5); 157.8 (C-9); 130.4 (C-2’ và C- 6’); 123.3 (C-1’); 116.3 (C-3’ và C-5’); 104.1 (C-10); 99.2 (C-6) và 94.5 (C-8)] và 2 carbon olefin mang oxygen [δC 147.0 (C-2) và 136.6 (C-3)]. Từ dữ liệu phổ 1H NMR, 13C NMR và DEPT cho phép dự đoán CFA-IV có khung flavone (hình 3.1). 7 6 5 10 9 8 O 4 2 1' 3 6' 5' 4' 3' 2' O A B Hình 3. 1: Khung flavone Phổ 1H NMR còn sáu proton vòng thơm, trong đó, hai tín hiệu proton vòng thơm xuất hiện với cường độ gấp đôi [δH 8,15 (2H, d) và 7.02 (2H, d)], có hằng số ghép J = 8,5 cho thấy đây là 2 cặp proton tương đương nằm ở vị trí ortho với nhau. Tín hiệu proton tại δH 7.02 ppm cho tương quan với tín hiệu carbon tại δC 116.3 ppm và tín hiệu proton tại δH 8,15 ppm cho tương quan với tín hiệu carbon tại δC 130.4 ppm trên cả hai phổ HSQC và HMBC. Điều này chứng tỏ bốn proton này cùng nằm trên vòng B có tính đối xứng. Tín hiệu δH 12,16 ppm trên phổ 1H NMR khẳng định nhóm –OH phải gắn vào C- 5 khung flavone. Trên phổ HMBC, (Phụ lục 5), proton của -OH kiềm nối tương quan với một carbon vòng thơm mang oxygen [δC 162.3 ppm], một carbon vòng thơm tứ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Tiến Dũng SVTH: Võ Huỳnh Yến Phụng Trang 39 cấp [δC 104.1ppm] và một carbon vòng thơm mang hydrogen [δC 99.2 ppm] khẳng định ba tín hiệu carbon này lần lượt là C-5, C-10 và C-6. Proton H-6 [δH 6,26 ppm] ghép metha với proton δH 6,53 ppm, nên proton này chỉ có thể là H-8. Mặt khác, hai proton H-6 và H-8 cùng tương quan với carbon δC 165.0 ppm trên phổ HMBC, nên carbon này phải là C-7. Carbon δC 157.8 ppm cũng cho tương quan với với proton H-8 trên phổ HMBC nên carbon này là carbon C-9. Tương quan HMBC trong vòng A của CFA-IV được minh họa ở hình 3.2. OHO H H O O H H OH H H 2 3 4 10 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' H OH Hình 3. 2: Tương quan HMBC trên vòng A của CFA-IV Xét vòng B, trên phổ HMBC, tín hiệu proton δH 8,15 ppm cho tương quan với hai carbon sp2 mang oxygen [δC 160.1 ppm và 147.0 ppm] và một carbon sp2 tứ cấp [δC 123.3 ppm]. Tín hiệu proton δH 7.02 ppm cũng cho tương quan với hai trong ba carbon trên là δC 160.1 ppm và δC 123.3 ppm. Do đó