Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn a5 cao chloroform rễ cây hà thủ ô trắng streptocaulon juventas

thời gian em học tập tại trƣờng. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn Trần Thị Tú Quyên, bạn Nguyễn Thị Ngọc Nƣơng, chị Trần Thị Thu Sƣơng đã đồng hành cùng em trong suốt thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn MỤC LỤC MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC LỜI MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................................. 2 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT ...................................................................................... 2 1.1.1. Mô tả chung .................................................................................................... 2 1.1.2. Vùng phân bố .................................................................................................. 3 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƢỢC TÍNH ............................................................... 3 1.2.1. Dƣợc tính theo y học cổ truyền ...................................................................... 3 1.2.2. Nghiên cứu về dƣợc tính ................................................................................. 3 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ........................................ 4 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................................ 12 2.1. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƢƠNG PHÁP........................................................ 12 2.1.1. Hoá chất ........................................................................................................ 12 2.1.2. Thiết bị .......................................................................................................... 12 2.1.3. Phƣơng pháp tiến hành ................................................................................. 12 2.2. NGUYÊN LIỆU .................................................................................................. 12 2.2.1. Thu hái nguyên liệu ...................................................................................... 12 2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu ................................................................................. 13 2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO ............................................................................. 13 2.4. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO CHLOROFORM ........... 14 2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform ...................................................... 14 2.4.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn A5 của bảng 2.1 ................................... 14 2.4.3. Sắc kí cột pha đảo trên phân đoạn A5.4 của bảng 2.2 .................................. 15 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 17 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................... 20 4.1. KẾT LUẬN ......................................................................................................... 20 4.2. ĐỀ XUẤT ........................................................................................................... 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................... 21 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 1 H-NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của proton (1) 13 C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của carbon (13) HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua một liên kết HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết s Singlet Mũi đơn d Doublet Mũi đôi t Triplet Mũi ba dd Double of doublet Mũi đôi đôi m Multiplet Mũi đa  Chemical shift Độ chuyển dịch hoá học J Coupling constant Hằng số ghép spin ppm Part per million Một phần một triệu UV Ultra Violet Tia cực tím EA Ethyl Acetate Etyl axetat C Chloroform Clorofom Me Methanol Metanol Et Ethanol Etanol H n-Hexane Hexan AcOH Acetic acid Axit axetic Ac Acetone Axeton SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng g Gam Gam mg Miligam Mi-li-gam MHz Mega Hertz Me-ga-héc Hz Hertz Héc cm Centimeter Xăng - ti- mét mm Milimeter Mi-li-mét m Micrometer Mi-crô-mét nm Nanometer Na-nô-mét Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học ................................................................. 4 Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform ............................................................. 14 Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn A5 ............................................................... 15 Bảng 3.1. So sánh số liệu phổ của hợp chất SJ1 và hợp chất 5-pregnen-3,17,20-triol ....... 19 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế cao chloroform từ rễ cây Hà thủ ô trắng ......................... 13 Sơ đồ 2.2. Quy trình cô lập hợp chất ................................................................................... 16 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây và củ Hà thủ ô trắng ............................................................................................ 2 Hình 3.1. Cấu trúc hợp chất SJ1 ............................................................................................... 18 Hình 3.2. Một số tƣơng quan HMBC của hợp chất SJ1 ........................................................... 18 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC  Phụ lục 1a. Phổ 1H-NMR (MeOD) của hợp chất SJ1  Phụ lục 1b. Phổ 13C-NMR (MeOD) của hợp chất SJ1  Phụ lục 1c. Phổ HSQC (MeOD) của hợp chất SJ1  Phụ lục 1d. Phổ HMBC (MeOD) của hợp chất SJ1 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 1 LỜI MỞ ĐẦU Việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các chất có trong thảo mộc đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển y học nói chung và Đông Y nói riêng. Kết quả thu đƣợc từ các nghiên cứu mở ra con đƣờng tổng hợp các hợp chất có những hoạt tính quý, có tác dụng chữa bệnh. Cây Hà thủ ô trắng có tên khoa học là Streptocaulon juventas (Lour) Merr, thuộc họ thiên lý Asclepiadaceae. Cây Hà thủ ô trắng có công dụng làm cho ngƣời già trẻ lại, giúp cho sự giao hợp đƣợc bền lâu, tóc bạc hóa đen. Trong kháng chiến tại các vùng dân tộc, ngƣời ta dùng củ và thân lá cây này chữa cảm sốt, cảm nắng, sốt rét. Ngoài ra, có nơi ngƣời ta sắc cây này với nƣớc cho phụ nữ mới sinh uống để ra sữa. Hi vọng với đề tài “Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn A5 cao chloroform rễ cây Hà thủ ô trắng” có thể đóng góp một phần nhỏ chứng cứ khoa học có giá trị vào kho dƣợc liệu của Y học dân tộc Việt Nam. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT Tên thông thƣờng: Hà thủ ô trắng. Tên gọi khác: hà thủ ô nam, bạch hà thủ ô, củ vú bò, dây sữa bò, dây mốc, cây sừng bò, cây đa lông, khâu cần cà (Thổ), khâu nƣớc (Lạng Sơn), mã liên an, mã lìn ón, khua mak tang ning (Lào), khua khao (Luang Prabang), chừa ma sìn (Thái) [1]. Tên khoa học: Streptocaulon juventas (Lour) Merr. Thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae). Hình 1.1. Cây và củ Hà thủ ô trắng 1.1.1. Mô tả chung Hà thủ ô trắng là một loại dây leo dài từ 2 đến 5m. Thân và cành màu hơi đỏ hay nâu đỏ, có rất nhiều lông, khi già thì nhẵn dần. Lá mọc đối, hình mác dài, đầu nhọn, đáy tròn hoặc hơi hình nón cụt, có lông mịn và nhiều ở mặt dƣới, mặt trên cũng có lông nhƣng ngắn hơn. Phiến lá dài 4-14 cm, rộng 2-9 cm, cuống lá dài 5-8 cm cũng có nhiều lông. Hoa màu nâu nhạt hoặc vàng tía mọc thành xim, rất nhiều lông. Quả đại tách đôi ngang ra trông nhƣ Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 3 sừng bò. Quả hình thoi, màu xám nhiều lông, dài 7-11 cm, rộng 8 mm. Hạt dẹt, phồng ở lƣng, dài 5-7 mm, rộng 2 mm, có chùm lông mịn dài 2 cm. Toàn cây bấm thân, lá, quả non chỗ nào cũng ứa ra thứ nhựa trắng nhƣ sữa. Rễ củ dài mẫm và trắng, giữa có lõi trông nhƣ củ sắn nhƣng có vị đắng [1]. 1.1.2. Vùng phân bố Cây Hà thủ ô trắng mọc hoang ở khắp đồi núi trọc nƣớc ta. Thƣờng ƣa những nơi đất đồi cứng vùng Vĩnh Phúc, Hà Tây, Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng, Lạng Sơn [1]. Ngoài ra, cây còn mọc ở Trung Quốc, Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Lào, Myanmar, Thái Lan. 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƢỢC TÍNH 1.2.1. Dƣợc tính theo y học cổ truyền Cây Hà thủ ô trắng làm cho ngƣời già trẻ lại, giúp cho sự giao hợp đƣợc bền lâu, tóc bạc hóa đen. Ngƣời ta dùng củ và thân lá cây chữa cảm sốt, cảm nắng, sốt rét [1]. Dịch trích nƣớc rễ cây Hà thủ ô trắng dùng giải độc, chữa cảm sốt, trị vết sƣng đau, vết thƣơng do rắn cắn, làm thuốc bổ cho các bệnh khác nhƣ thấp khớp, suy nhƣợc thần kinh, và chứng khó tiêu. 1.2.2. Nghiên cứu về dƣợc tính Năm 2002, có nghiên cứu dùng cao chiết cồn đậm đặc của rễ củ Hà thủ ô trắng tăng cholesterol ngoại sinh trên chuột [2]. Sau đó, nghiên cứu trong dịch chiết rễ cây Hà thủ ô trắng có ức chế mạnh đối với các dòng tế bào ung thƣ là ung thƣ cổ tử cung Hela ở ngƣời, tế bào ung thƣ phổi ngƣời A549, tế bào ung thƣ đại tràng chuột 26-L5, tế bào ung thƣ phổi chuột LLC, các dòng tế bào ung thƣ ác tính chuột B16-BL6 [6], tế bào ung thƣ phổi lớn tế bào NCl-H460, nguyên bào phổi của thai nhi tế bào MRC-5 [11], cùng các tế bào khối u khác nhƣ: PC3, SMMC7721, CNE [13]. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 4 Ngoài ra, trong dịch chiết của cây Hà thủ ô trắng có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ bạch cầu HL-60 ở ngƣời đáng kể [14]. 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC Bảng 1.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học Năm Tác giả Số chất cô lập Tên chất 2003 Jun-ya Ueda và cộng sự 21 acovenosigenin A digitoxoside (1), digitoxigenin gentiobioside (2), digitoxigenin 3-O- [O-β-D-glucopyranosyl- (1 → 6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)-3-O-acetyl-β-D- digitoxopyranoside] (3), digitoxigenin 3-O-[O-β-D- glucopyranosyl-(1 → 6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)–O- β-D-digitalopyranosyl-(1 → 4)–β-D-cymaropyranoside] (4), periplogenin 3-O-(4-O-β-D-glucopyranosyl-β-D- digitalopyranoside) (5), (4R)-4-hydroxyl-3- (1- metyletyl)pentyl rutinoside (6), (R)-2-etyl-3-metylbutyl rutinoside (7), acovenosigenin A (8), periplogenin 3-O-β- digitoxoside (9), periplocymarin (10), periplogenin (11), digitoxigenin (12), digitoxigenin 3-O-[O-β-D- glucopyranosyl-(1 → 6)–O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 4)–β- D-digitoxopyranoside] (13), digitoxigenin sophoroside (14), echujin (15), periplogenin glucoside (16), corchorusoside C (17), subalpinoside (18), acid caffeic (19), 4,5-di-O- caffeoylquinic acid (20), 2-phenylethyl rutinoside (75) [6]. 2005 Ma Chunhui và cộng sự 12 periplogenin - 3β-acetate (21), -amyrol acetate (22), - amyrol tridecanoate (23), ursolic acid (24), 9,19-cyclolart-25- en-3β,24R-diol (25), 9,19-cyclolart-25-en-3β,24S-diol (26), cycloeucalenol (27), 9,19-cycloart-23E-en-3 β, 25-diol (28), 25-methoxy-9,19-cycloart-23E-en-3 β-ol (29), 11,12- Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 5 epoxytaraxer-14-en-3β-acetate (30), oleanolic acid (76), uzarigenin (77) [8]. 2007 Myint Myint Khine và cộng sự 2 17β-H-Periplogenin 3-O-β-D-digitoxoside (31), ∆5-Pregnene- 3β,16α-diol 3-O-[2,4-O-diacetyl-β-D- digitalopyranosyl(1→4)-β-D-cymaropyranoside]- 16-O-[β-D- glucopyranoside] (32) [9]. 2008 Zhinhui Liu cùng cộng sự 9 β –sitosterol (33), syringaldehyde (34), acid syringic (35), isofraxidin (36), scopoletin (37), scoparone (38), acid ferulic (39), salicylaldehyde (40), daucosterol (74) [14]. 2009 Bùi Xuân Hào 1 acovenosigenin A 3-O-glucoside (41) [3]. 2011 Luay J. Rashan và cộng sự 6 17-H-periplogenin-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl- β-D-digitalopyranoside (42), oleandrin (43), oleandrigenin-3- O-β-D-sarmentoside (44), neritaloside (45), odoroside H (46), odoroside A (47) [7]. 2013 Rui Xue và cộng sự 15 1-14β-dihudroxy-5β-card-20 (22)-enolide 3-O-[O-β-D- digitalopyranoside] (48), acovenosigenin A 3-O-[O-β-D- glucopyranosyl-(1→4)-β-D-digitalopyranoside] (49), 16-O- acetyl-hdroxyperiplogenin 3-O-β-D-digitoxopyranoside (50), 16-O-acetyl-hydroxyacovenosigenin (51), 3-O-(β- glucopyranosyl) acovenosigenin A (52), evonogenin (53), glucoevonogenin (54), digitoxigenin 3-O-[O-β-D- glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O- acetyl-β-D- digitalopyranoside] (55), digitoxigenin (56), digitoxigenin 3-O-β-D-glucoside (57) echunbioside (58), 1β, 3β, 14β-trihydroxy-5β-card-16,20 (22)-dienolide (59), griffithigenin (60), ∆(16) -digitoxigenin –β-D-glucoside (61), emicymarin (78) [10]. 2015 Chun Ye và cộng sự 9 periplogenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D- glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl-β-D-digitalopyranoside] (62), periplogenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-O-β- D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-digitoxopyranoside] (63), Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 6 acovenosigenin A 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β- D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside] (64), acovenosigenin A 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β- D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl-β-D-digitalopyranoside] (65), 16-O-acetyl-hydroxyacovenosigenin 3-O-[O-β-D- glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-O- acetyl-β-D-digitalopyranoside] (66), acovenosigenin A 3-O- [O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β- D-glucopyranosyl- (1→4)-O-β-D-digitalopyranosyl-(1→4)-β-D- cymaropyranoside] (67), digitoxigenin 3-O-β-D-cellobioside (68), digitoxigenin-3-O-β-D-glucosyl-(1→4)-3-O-acetyl-β-D- digitoxoside (69), 5β-Hydroxygitoxigenin (70) [4]. 2017 Yi-Chao Ge và cộng sự 6 28, 29-nor-3β, 4β-dihydroxyl-9, 19-cycloartan-26-acid (71), 28, 29-nor-3β, 4β-dihydroxyl-9, 19-cycloartan-26-acid methylester (72), 30-nor-3-β-acetoxy-lupan-20-one (73), - amyrin (79), betulinic acid (80), lupeol palmitate (81) [13]. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 7 Các công thức cấu tạo của một số hợp chất trong cây Streptocaulon juventas (Lour) Merr. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 8 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 9 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 10 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 11 Chú thích: Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 12 CHƢƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, PHƢƠNG PHÁP 2.1.1. Hoá chất Silica gel 37 – 63 μm, Himedia dùng cho sắc kí cột. Sắc kí lớp mỏng loại DC - Alufolein 20×20, Kiesel gel 60 F 254 , Merck. Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, chloroform , ethyl acetate, ethanol, methanol, n-butanol và nƣớc cất. Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng: dung dịch H2SO4 20%. 2.1.2. Thiết bị Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu. Các cột sắc kí. Máy cô quay chân không. Bếp cách thuỷ. Đèn soi UV: bƣớc sóng 254 nm và 365 nm. Cân điện tử. 2.1.3. Phƣơng pháp tiến hành Phƣơng pháp phân lập các hợp chất Cô lập các hợp chất hữu cơ bằng phƣơng pháp sắc kí, bao gồm kỹ thuật sắc kí cột silica gel pha thƣờng; pha đảo và sắc kí lớp mỏng. Đƣợc hiện hình bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D-NMR trên máy Bruker Avance đƣợc ghi tại phòng NMR, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 18, Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội. 2.2. NGUYÊN LIỆU 2.2.1. Thu hái nguyên liệu Mẫu cây dùng trong nghiên cứu đề tài là rễ cây Hà thủ ô trắng (Streptocaulon Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 13 juventas (Lour) Merr.) đƣợc thu hái ở Tịnh Biên tỉnh An Giang vào tháng 10 năm 2016. Mẫu cây đã đƣợc Th.S Hoàng Việt, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh nhận danh tên khoa học là “Streptocaulon juventas”, họ Thiên lý (Asclepiadaceae). 2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu đƣợc rửa sạch, loại bỏ sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn. 2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Bột rễ cây Hà thủ ô đƣợc đun hoàn lƣu với dung môi methanol ở nhiệt độ 64-65oC, mỗi mẻ đun 3 lần, mỗi lần đun trong 2 giờ. Sau đó đem lọc, thu đƣợc dịch, rồi đem cô quay với áp suất thấp thu đƣợc cao methanol thô. Cao methanol thô đƣợc chiết lỏng – lỏng với dung môi chloroform, cô quay dịch chiết thu đƣợc cao chloroform. Quá trình thực hiện đƣợc tóm tắt theo sơ đồ 2.1. Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế cao chloroform từ rễ cây Hà thủ ô trắng Bột thô rễ Hà thủ ô (20 kg) Bã khô Cao methanol (2.02 kg) Cao chloroform (400 gam) Cao ethyl acetate (80 gam) Cao n-butanol (350 gam) - Đun hoàn lƣu với methanol (3 lần x 2 giờ). - Lọc bã. - Cô quay thu hồi dung môi ở áp suất thấp. - Phân tán vào nƣớc - Chiếc lỏng-lỏng lần lƣợt với các dung môi choloroform; ethyl acetate và n-butanol - Cô quay thu hồi dung môi ở áp suất thấp. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 14 2.4. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO CHLOROFORM 2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform Cao chloroform (400g) đƣợc sắc kí cột (SKC) silica gel, giải ly với hệ dung môi H:EA có độ phân cực tăng dần từ 0% đến 100% EA, sau đó giải ly lần lƣợt với các hệ dung môi EA:Me 9:1, EA:Me:H2O 8:1:1, EA:Me:H2O 4:1:1, EA:Me:H2O 2:1:1 và 100% Me. Kết quả thu đƣợc mƣời ba phân đoạn ký hiệu từ A1 đến A13 Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao chloroform STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lƣợng (g) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 A1 H 3.6 Nhiều vết Chƣa khảo sát 2 A2 H: EA 99:1 5.0 Nhiều vết Chƣa khảo sát 3 A3 H:EA 95:5 5.6 Nhiều vết Đã khảo sát 4 A4 H:EA 9:1 8.4 Nhiều vết Chƣa khảo sát 5 A5 H:EA 85:15 6.0 Nhiều vết Khảo sát 6 A6 H:EA 8:2 8.4 Nhiều vết Chƣa khảo sát 7 A7 H:EA 1:1 13.0 Nhiều vết Chƣa khảo sát 8 A8 EA 19.6 Nhiều vết Chƣa khảo sát 9 A9 EA:Me 9:1 26.8 Nhiều vết Chƣa khảo sát 10 A10 EA:Me:H2O 8:1:1 31.0 Nhiều vết Chƣa khảo sát 11 A11 EA:Me:H2O 4:1:1 41.2 Nhiều vết Chƣa khảo sát 12 A12 EA:Me:H2O 2:1:1 53.0 Vệt dài Chƣa khảo sát 13 A13 Me 71.6 Vệt dài Chƣa khảo sát 2.4.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn A5 của bảng 2.1 Phân đoạn A5 (6.0 gam) cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn A5 đƣợc thực hiện SKC silica gel, giải ly với hệ dung môi Hexane:Ethanol có độ phân cực tăng dần. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 15 Tiến hành các bƣớc tƣơng tự nhƣ khi sắc kí cột phân đoạn trƣớc. Kết quả thu đƣợc năm phân đoạn phụ ký hiệu từ A5.1 đến A5.5 Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn A5 STT Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lƣợng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 A5.1 H 960 Nhiều vết Chƣa khảo sát 2 A5.2 H:Et 100:1 882 Nhiều vết Chƣa khảo sát 3 A5.3 H:Et 50:1 798 Nhiều vết Chƣa khảo sát 4 A5.4 H:Et 19:1 950 Nhiều vết Khảo sát 5 A5.5 H:Et 9:1 940 Nhiều vết Chƣa khảo sát 2.4.3. Sắc kí cột pha đảo trên phân đoạn A5.4 của bảng 2.2 Phân đoạn A5.4 có SKLM cho nhiều vết tách rõ. Tiến hành SKC pha đảo, C-18 nhiều lần với hệ dung môi giải ly MeOH: H2O 9:1 thu đƣợc hợp chất SJ1 có dạng tinh thể hình kim, không màu, tan hoàn toàn trong dung môi methanol. Quá trình thực hiện đƣợc tóm tắt theo sơ đồ 2.2. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 16 Sơ đồ 2.2. Quy trình cô lập hợp chất Cao chloroform (400 gam) A1 3.6 g A2 5.0 g A3 5.6 g A4 8.4 g A5 6.0 g A5.1 960 mg A5.2 882 mg A5.3 798 mg A5.4 950 mg SJ1 122.5 mg A5.5 940mg A6 8.4 g A7 13.0 g A8 19.6 g A9 26.8 g A10 31.0 g A11 41.2 g A12 53.0 g A13 71.6 g - Sắc kí cột silica gel - Giải ly H:EA, EA:Me:H2O - Cô quay thu hồi dung môi - Sắc kí cột silica gel - Giải ly Hexane:Ethanol - Sắc kí cột pha đảo, C-18 - Giải ly hệ MeOH:H2O 9:1 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 17 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT SJ1 Hợp chất SJ1 (122,5 mg) thu đƣợc đƣợc từ phân đoạn A5.4 của cao chloroform, có các tính chất sau: - Dạng tinh thể hình kim, không màu, tan hoàn toàn trong dung môi methanol. - Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất khi nhúng bằng H2SO4 20% và sấy nóng đến khi hiện vết, bảng mỏng cho vết màu nâu rêu.  Phổ 1H-NMR (MeOD): Phụ lục 1a.  Phổ 13C-NMR (MeOD): Phụ lục 1b.  Phổ HSQC (MeOD): Phụ lục 1c.  Phổ HMBC (MeOD): Phụ lục 1d.  BIỆN LUẬN CÁU TRÚC Phổ 1H-NMR của hợp chất SJ1 (phụ lục 1a) cho thấy sự hiện diện tín hiệu cộng hƣởng của ba nhóm methyl ở H 1.19 (3H, d, J = 6.0 Hz); 0.8 (3H, s) và 1.05 (3H, s). Trên phổ 1H-NMR còn cho thấy tín hiệu cộng hƣởng của proton olefin ở H 5.37 (1H, m), hai proton methine gắn oxygen ở H 3.42 (1H, m) và 3.80 (1H, dd, J = 6.3; 12.5 Hz). Ngoài ra, phổ proton còn có sự hiện diện của các tín hiệu cộng hƣởng proton methylene và methine trong khoảng H 1.3 - 2.2 ppm. Phổ 13C-NMR của hợp chất SJ1 (phụ lục 1b) cho thấy sự hiện diện của 21 carbon, gồm có tín hiệu cộng hƣởng của ba carbon methyl ở C 14.8 (C-18); 18.8 (C-21); 19.8 (C-19), tám carbon methylene, sáu carbon methine trong đó có hai carbon methine gắn với oxygen ở C 72.4 (C-3) và C 72.9 (C-20), một carbon methine của olefin ở C 122.4 (C-6), và bốn carbon bậc bốn trong đó có một carbon olefin ở C 142.3 (C-5), một carbon gắn với oxygen ở C 87 (C-17). Phổ HMBC của hợp chất SJ1 (phụ lục 3d) cho thấy có sự tƣơng quan của proton nhóm methyl H 1.05 (3H, s, H-19) với carbon olefin C 142.3 (C-5) và các carbon ở C 38.6 (C- 1), 51.5 (C-9), 37.7 (C-10). Đồng thời proton olefin ở H 5.37 (1H, m, H-6) tƣơng quan với carbon C 33.2 (C-7), 33.3 (C-8), 37.7 (C-10) xác nhận sự hiện diện của liên kết đôi ở vị trí C5-C6. Proton nhóm methyl ở H 1.19 (3H, d, H-21) tƣơng quan với hai carbon ở C 87 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 18 (C-17); 72.9 (C-20). Đồng thời proton nhóm methyl ở H 0.8 (3H, s, H-18) tƣơng quan với carbon ở C 87.0 (C-17), 47 (C-13), 52.6 (C-14) xác nhận sự hiện diện của hai nhóm hydroxyl ở vị trí C-17 và C-20. Các tƣơng quan HMBC còn lại đƣợc trình bày cụ thể trong Hình 3.2 và Bảng 3.1. Từ các số liệu phổ trên, kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo (đƣợc trình bày trong Bảng 3.1) [12], cấu trúc của SJ1 đƣợc đề nghị là 5-pregnen-3,17,20-triol. Hình 3.1. Cấu trúc hợp chất SJ1 Hình 3.2. Một số tƣơng quan HMBC của hợp chất SJ1 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 19 Bảng 3.1. So sánh số liệu phổ của hợp chất SJ1 và hợp chất 5-pregnen-3,17,20-triol Vị trí carbon Loại carbon Hợp chất SJ1 (MeOD) Hợp chất 5-pregnen-3,17,20-triol (CD3)2CO δH (ppm) δC (ppm) HMBC ( 1 H⟶13C) δC (ppm) 1 -CH2- 1.9; 1.1 (m) 38.6 38.3 2 -CH2- 1.58; 1.52 (m) 33.2 32.6 3 >CH-O- 3.42 (m) 72.4 71.1 4 -CH2- 2.25; 2.20 (m) 43.0 C-3; 5; 6 43.4 5 >C= - 142.3 142.4 6 =CH- 5.37 (m) 122.4 C-7; 8; 10 121.6 7 -CH2- 2.05; 2.0 (m) 32.3 C-5; 6; 8; 9 32.8 8 >CH- 1.52 (m) 33.3 C-7; 9; 14 32.8 9 >CH- 0.97 (m) 51.5 C-10; 11; 19 51.1 10 >C< - 37.7 37.4 11 -CH2- 1.5; 1.61 (m) 21.7 C-8; 9; 10; 13 21.4 12 -CH2- 1.72; 1.8 (m) 32.4 31.9 13 >C< - 47.0 46.3 14 >CH- 1.75 (m) 52.6 C-8; 13; 16; 18 52.2 15 -CH2- 2.08; 1.73 (m) 38.1 C-14; 16 38.6 16 -CH2- 1.76; 1.17 (m) 24.5 C-17 24.2 17 >C-O- - 87.0 85.8 18 -CH3 0.80 (s) 14.8 C-13; 14; 17; 14.4 19 -CH3 1.05 (s) 19.8 C-5; 9; 10 19.8 20 >CH-O- 3.80 (q, J=6.3) 72.9 C-21 72.2 21 -CH3 1.19 (d, J=6.0) 18.8 C-17; 20 19.2 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 20 CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. KẾT LUẬN Từ mẫu rễ cây Hà thủ ô trắng thu hái đƣợc ở huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang, tôi đã khảo sát thành phần hoá học cao chlorofom của rễ cây Hà thủ ô trắng. Bằng kỹ thuật sắc ký cột trên silica gel pha thƣờng, pha đảo, sắc ký lớp mỏng, đã cô lập đƣợc hợp chất: 5- pregnen-3,17, 20-triol. 4.2. ĐỀ XUẤT Trong thời gian tới chúng tôi sẽ tiếp tục khảo sát các phân đoạn khác của cây với hy vọng cô lập thêm những hợp chất có cấu trúc mới. Với mong muốn đóng góp những chứng cứ khoa học có giá trị trong Y học, tôi sẽ tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các hợp chất cô lập đƣợc. Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Hữu Toàn 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1]. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, 836-837. [2]. Phạm Thanh Tâm, Trần Hùng (2002), Chuyên đề Nghiên cứu Khoa học Dƣợc, Y Học TP. Hồ Chí Minh, 49-52. Tài liệu Tiếng Anh [3]. Bui Xuan Hao, Nguyen Thi Hong Yen, Nguyen Minh Duc, Tran Le Quan (2009), Chemical constituents from the roots of S