Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học trên cao ethyl acetate của cây mộc ký ngũ hùng dendrophtoe pentandra (l.) miq., họ chùm gửi (loranthceae) ký sinh trên cây xoài mangifera indica, họ đào lộn hột (anacardiaceae)

OH HO O O O HO OH OH (10) (11) (12) Trang 15 OOH HO O OH O OH OH OH O O O HO OH OH OH HO HO (13) (14) H H H H3COCO H O O O H H (15) (16) H H O O H H H3COC H O O H (17) (18) Trang 16 H HOOC(H3C)HC H O O H O O H H HO O HO(H3C)2C (19) (20) O OH H H EtO O O OH H HO MeO (21) (22) O OH H HO HO O O OH HO H H (23) (24) 1.2 Cây Xoài – Cây chủ 1.2.1 Đặc tính thực vật Cây xoài có tên khoa học Mangifera Indica L, thuộc họ Đào lộn hột (Anacardiaceae). Trang 17 Hình 3: cây xoài Còn có tên khác là muỗm, swai, makmounang, manguier. Cây to cao 15-20m. Lá nguyên, mọc so le, đơn, thuôn dài, nhẵn, bóng, dài 15-30cm, rộng 5-7cm. Hoa nhỏ, màu vàng nhạt, thành chùy ở đầu cành. Quả hạch khá to, dẹt, hình thận, cứng trên có những thớ sới khi nảy mầm thì hơi mở ra. Hạt có lớp vỏ mỏng, màu nâu, không phôi nhũ, lá mầm không đều. Cây xoài có nguồn gốc Ấn Độ; du nhập đến Đông Nam Á, khoảng thế kỷ thứ IV-V trước công nguyên, và khoảng thế kỷ thứ X mới du nhập đến Brazil, Mehicô,.. Cây Xoài được trồng phổ biến ở các nước Châu Á. Ở nước ta trồng nhiều ở miền Nam. 1.2.2 Nghiên cứu về dược tính Theo kết quả phân tích các chất dinh dưỡng có trong 100g Xoài (FAO, 1976): nước 86,5g; glucid15,9g; protein 0,6g; lipid 0,3g; tro 0,6g; các chất khoáng: Ca 10mg, P 15 mg, Fe 0,3mg; các vitamin: A 1880 microgam, B1 0,06mg, C 36mg; cung cấp 62 calo, 78% nhu cầu vitamin A mỗi ngày, rất tốt cho sự phát triển của trẻ em, làn da và thị lực; 46% nhu cầu vitamin C. Xoài chín có tác dụng bổ não, có lợi cho người làm việc trí óc, suy nhược thần kinh, giúp tăng cường sức đề kháng, chống viêm, phòng ngừa ung thư, giảm béo, cải thiện hệ tiêu hóa, giúp hạ cholesterol máu, hạ huyết áp, phòng bệnh mạch vành, ngừa ung thư ruột kết (do làm tăng nhu động ruột, chống táo bón). Theo đông y, quả xoài chín có vị ngọt, chua, tính mát, tác dụng ít dạ dày, tiêu tích trệ, làm hết nôn mửa, thanh nhiệt, giải khát, lợi tiểu, nhuận phế, tiêu đàm. Thường dùng trong các trường hợp ho do nhiệt, đàm vàng đặc, tiêu hóa kém, bệnh hoại huyết, suy nhược thần kinh, cao huyết áp, mỡ trong máu cao, táo bón, dễ bị chuột rút. Hạch của quả xoài (nhân Xoài) chứa nhiều tinh bột, dầu, tannin, acid galic tự do, có vị đắng chát. Tác dụng làm hết ho, mạnh dạ dày, trợ tiêu hóa. Dùng chữa ho, kiết lỵ, tiêu chảy, trừ giun sán. Lá xoài chứa chất tannin và một hợp chất flavonoid là mangiferin. Tác dụng hành khí, lợi tiểu, tiêu độc tiêu tích trệ. Dùng chữa bệnh đường hô hấp trên, ho, viêm phế quản cấp và mãn tính. Dùng ngoài chữa viêm da ngứa da. Có thể lấy lá nấu nước để rửa hoặc xông. Trang 18 Vỏ thân cây Xoài chứa tannin và mangiferin 3%. Tác dụng làm se niêm mạc, sát trùng. Dùng chữa ho, đau sưng cổ họng, đau răng. 1.2.3 Nghiên cứu về hóa học Các nghiên cứu về hóa học trên cây Xoài cho thấy trong cây có sự phong phú về các loại hợp chất hữu cơ gồm các Steroid, Flavonoid, Terpen, Tanin, Dẫn xuất furane, Ancol, acid, hợp chất phenol, Cho tới nay có rất nhiều hợp chất cô lập được từ cây xoài[11,14,15,17,21,23,24,28]: Steroid : acid ambolic (25)¸ acid ambonic (26), cycloartane-3,24,25-triol (27), 24- acethyl-9,19-cyclolanostane-3,25-diol (28), 3-tetradecanoyl cycloartane-24,25-diol (29), 3-hexadecanoylcycloartane-24,25-diol (30), 24,25-Dihydroxycycloartan-3-one (31), 25-methoxylcycloartane-3,24-diol (32), 25-methoxyl-3- hexadecanoylcycoartane-24-ol (33), cycloartane-3,29-diol (34), cycloart-24-ene- 3,22,26-triol (35), acid 3,22-dihydroxycycloart-24-en-26-oic (36), cycloart-24-ene- 3,21-diol (37), cycloart-24-ene-3,26-diol (38), oxocycloart-24-ene-26-al (39), cycloartan-29-ol (40), cycloart-25-ene-3,24,27-triol (41), 20,26-dihydroxy-24- dammaren-3-one (42), acid 3,23-dihydroxycycloart-24-en-26-oic (43), acid 3,22- dihydroxycycloart-24-en-26-oic (44), 20,24-epoxydammarane-3,25,26- triol (45), 20,24-epoxy-25,26-dihydroxydammaran-3-one (46), acid isomangiferolic (47), acid mangiferolic (48), 3-hydroxycycloart-24-en-26-al (49), acid 3-acethylmangiferolic (50), manglupenone (51), 26-hydroxy-24-methylenecycloartan-3-one (52), acid 28- hydroxymangiferonic (53), acid 3-oxocycloart-24-en-26-oic (54). Flavonoid : 3-hydroxy-2-(4-methylbenzoyl)chromone (55), 3-methoxy-2-(4- methylbenzoyl)chromone (56), 1,7-dihydroxyxanthone (57), inriflophenone (58), 2’’,6’’-Di-O-galloyl-3-glucosyliriflophenone (59), 2’’,3’’,6’’-Tri-O-galloyl-3- glucosyliriflophenone (60), 3-glucosylmaclurin (61), 6’’-(4-hydroxybenzoyl)-3- glucosylmaclurin (62), 2’’-(3,4,5-trihydroxybenzoyl)-6’’-(p-hydroxybenzoyl)-3- glucosylmaclurin (63), 6’’-(3,4,5-trihydroxybenzoyl)-2’’-(p-hydroxybenzoyl)-3- glucosylmaclurin (63), 2’’,3’’,6’’-(3,4,5-Trihydroxybenzoyl)-3-glucosylmaclurin (65), telephone A (66), telephone B (67), mangiferin (68), mangiferin 6’-galate Trang 19 (69), homomangiferin (70), isomangiferin (71), glucoisomangiferin (72), isomangiferin-O-glucoside (73), 2-O-methylisomangiferin (74), 7-O- methylisomangiferin (75) Terpenoid : 4-epiaubergenone (76)¸ aubergenone (77), 20-hydroxy-30-norursan-3-one (78), 3,20-taraxastanediol (79), Y-taraxastanonol (80), 3-ursanone (81), mangiferoleanone (82) Hợp chất phenol: 5-Heptadecyl-1,3-benzenediol (83), 5-(2-Heptadecenyl)-1,3-benzenediol (84), 5-(10-Heptadecenyl)-1,3-benzenediol (85), 5-(12-Heptadecenyl)-1,3- benzenediol (86). Tanin: acid metatrigallic (87) Dẫn xuất furane: 2-methyl-4-butanolide (88), 15,5-farnesanolide (89) Ancol: Mangalkanol (90), 7(14)-Farnaesene-9,12-diol (91) Acid: Acid mangfarnasoic (92), acid citric (93) Cấu trúc hóa học của các hợp chất có trong cây Xoài: Steroid : COOH HO (25) COOH O (26) OH OR HO (27) R: H (28) R: CH3CO OH OH RO (29) R: tetradecanoyl (30) R: hexadecanoyl Trang 20 OH OH O (31) O OH RO (32) R: H (33) R: hexadecanoyl HO OH (34) OH OH HO (35) OHOH HO (36) O HO HO (37) HO OH (38) O CHO (39) OH (40) OHHO HO (41) Trang 21 O OHHO (42) COOH HO HO (43) COOH HO (44) OH (45) OH OH O HO (46) OH OH O O COOH ∗ HO (47) *: (R) (48) *: (S) CHO HO (49) O CH2OH (50) CH2OH O (51) O CH2OH (52) COOH CH2OH HO (53) COOH O (54) Trang 22 Flavonoid : O O OR O CH3 (55) R: H (56) R: CH3 O O HO OH (57) O OH OHHO OH O OR1 R2O HO R3O (58) R1 = R2 = R3: H (59) R1 = R3: galloyl; R2: H (60) R1 = R2 = R3: galloyl O OH OHHO OH O OH HO HO HO OH (61) O OH OHHO OH O OR1 R2O HO R3O OH (61) R1= R2 = R3: H (62) R1= R2: H; R3: 4-hydroxybenzoyl (63) R1: 3,4,5-trihydroxybenzoyl; R2: H; R3: p-hydroxybenzoyl (64) R1: p-hydroxybenzoyl; R2: H; R3: 3,4,5-trihydroxybenzoyl (65) R1 = R2 = R3: 3,4,5-trihydroxybenzoyl O OH OR2HO OH O OH HO HO HO OR1 (66) R1: CH3; R2: H (67) R1 = R2: CH3 O O OR2R1O OH O OH HO HO HO (68) R1 = R2: H (69) R1: H; R2: 3,4,5-trihydroxybezol (70) R1: CH3; R2: H OH O O OR3R1O OR2 (71) R1 = R2 = R3: H (72) R1 = R3: H; R2: glucosyl (73) R1: glucosyl; R2 = R3: H (74) R1: CH3; R2 = R3: H (75) R1= R2: H; R3: CH3 OH O HO OH OH OH Trang 23 Terpenoid : ∗ O OH (76) *: (S) (77) *: (R) O OH (78) HO HO (79) HO O (80) O (81) (82) O Hợp chất phenol: OH OH 16 (83) HO OH 13 (84) HO OH 59 (85) OH HO 11 (86) 3 Tanin: O HO OH OH O O O O OH OH OH OH OH(87) Trang 24 Dẫn xuất furane: O O (89) O O (88) Ancol: OH 8 HO OH (90) (91) Acid: HO O 3 3 O OH O OH O HO OH (92) (93) Trang 25 Chương 2 THỰC NGHIỆM Trang 26 2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 2.1.1 Nguyên liệu Nguyên liệu được thu hái tại vườn nhà xã Xuân Trường, huyện Xuân lộc, tỉnh Đồng Nai vào tháng 7 năm 2009. Tiến sĩ Phạm Văn Ngọt, khoa sinh, trường ĐH Sư phạm Tp.HCM nhận danh: Mộc ký ngũ hùng, Dendrophtoe pentandra (L.) Miq., họ Chùm gửi (Loranthaceae). Toàn thân cây,sau khi thu hái được rửa sạch, cắt ngắn, sấy khô ở 600C -700C và xay thành bột. Phần nghiên cứu được thực hiện trên 2,5gam của phân đoạn EA.1và 1,9gam phân đoạn EA.2 của cao EA của sinh viên Khưu Kiến Toàn để lại từ năm 2011. 2.1.2 Hóa chất + Dung môi: chlorofom, methanol, H2O. + Silica gel: Silica gel 60, 0.04 – 0.06 mm, Merck dùng cho sắc kí cột. + Sắc kí bảng mỏng loại 25DC – Alufolien 20 x 20, Kiesel gel 60F254, Merck. + Thuốc thử hiện hình sắc kí bảng mỏng: H2SO4 đặc. 2.1.3 Thiết bị + Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu. + Cột sắc kí. + Máy cô quay chân không Heidolph, máy sấy. + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được thực hiện trên máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AC.500, tần số cộng hưởng 500MHz. + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT-NMR được thực hiện trên máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AC.500, tần số cộng hưởng 125MHz. Tất cả phổ được ghi tại phòng phân tích cấu trúc, Viện Hóa Học - Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, 18 - Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội. 2.2 Điều chế cao thô Phần này đã được sinh viên năm trước làm. Trang 27 Bột cây được trích bằng Ethanol theo phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng. Cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp, thu được cao ethanol thô. Bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng trên cao Ethanol thô với hệ dung môi Chloroform: nước (1:1), đuổi dung môi phần dịch chiết, thu được 2 loại cao chiết: cao Chloroform và cao nước (chưa khảo sát). Thực hiện sắc ký cột silica gel trên cao chiết Chloroform giải ly bằng các đơn dung môi Ether dầu hỏa, Chloroform, Ethyl Acetate, Methanol cô quay thu hồi dung môi thu được 4 loại cao tương ứng. Quy trình điều chế các loại cao được trình bày tóm tắt trong sơ đồ 1 Trang 28 Sơ đồ 1: Sơ đồ điều chế các loại cao Bột cây khô Cao Ethanol Cao nước Cao Chloroform MX4 MX3 MX5 MX9 MX1 MX13 Ngâm dầm với Ethanol Lọc, cô quay thu hồi dmôi Dùng phương pháp chiết lỏng -lỏng C- H2O SKC Silicagel Giải ly với ED, C, EA , Me Cao Ether dầu Cao Ethyl Acetate Cao Chloroform Cao Methanol SKC Silica gel Giải ly bằng ED:EA (từ 97:3 - 75:25) SKC Silica gel Giải ly bằng C:M (từ 100 - 94:6) Đã cô lập Đã cô lập Trang 29 2.3 Cô lập các hợp chất từ cao EA Trong luận văn này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát cao EA 2.3.1 Sắc kí cột cho phân đoạn EA.2 Sắc kí cột silica gel áp dụng cho 2,5g của phân đoạn EA.1, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các hũ bi. Dùng sắc kí bảng mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 4 phân đoạn, các phân đoạn được trình bày trong bảng 1. Bảng 1: Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.2. Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Sắc kí bảng mỏng Ghi chú EA.2.1 C : M : H20 (95 : 5 : 1) 50 Một vết rõ, có nhiều vết dơ Không khảo sát EA.2.2 C : M : H20 (95 : 5 : 1) 400 Một vết rõ, tròn, có nhiều vết dơ Khảo sát EA.2.3 C : M : H20 (95 : 5 : 1) 180 Một vết rõ giống M.2 nhưng có nhiều vết dơ hơn Chưa khảo sát EA.2.4 C : M : H20 ( 95 : 5 : 1) 70 Nhiều vết Chưa khảo sát Ghi chú: C (chloroform), M (methanol). 2.3.1.1. Sắc kí cột cho phân đoạn EA.2.2 của bảng 1 Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn EA.2.2 (400mg) trong bảng 1, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các hũ bi. Dùng sắc kí bảng mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 3 phân đoạn, các phân đoạn được trình bày trong bảng 2. Trang 30 Bảng 2: Sắc kí cột trên phân đoạn EA.2.2 của bảng 1. Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Sắc kí bảng mỏng Ghi chú EA.2.2.1 C : M :H20 (95 : 5 :1,5) 350 Vết rõ, tròn, đẹp Khảo sát EA.2.2.2 C : M : H20 (95 : 5 : 1,5) 10 Nhiều vết Chưa khảo sát EA.2.2.3 C : M : H20 (95 : 5 : 1,5) 20 Vết dài Chưa khảo sát 2.3.1.2. Sắc kí cột cho phân đoạn EA.2.2.1 của bảng 2 Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn EA.1.2.1 (350mg) trong bảng 2, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào hũ bi. Dùng sắc kí bảng mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 3 phân đoạn, các phân đoạn được trình bày trong bảng 3. Bảng 3: Sắc kí cột trên phân đoạn EA.2.2.1 của bảng 2. Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Sắc kí bảng mỏng Ghi chú EA.2.2.1.1 C : M : H20 (95 : 5 : 1,5) 35 Vết mờ Chưa khảo sát EA.2.2.1.2 C : M : H20 (95 : 5 : 1,5) 200 Vết màu tím, còn vết dơ rất mờ Khảo sát EA.2.2.1.3 C : M : H20 (95 : 5 : 1,5) 20 Vết mờ Chưa khảo sát Trang 31 2.3.1.3. Sắc kí cột cho phân đoạn EA.2.2.1.2 của bảng 3 Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn EA.2.2.1.2 (200mg) trong bảng 2, giải ly bằng hỗn hợp dung môi C:M:H2O với tỉ lệ 95:5:1,5 nhiều lần, kết quả thu được chất bột màu vàng (50mg). Kiểm tra nhiều lần bằng sắc ký bảng mỏng với hệ dung môi C:M (8:2) cho một vết rõ, màu đen, Rf=0,57. Hợp chất này được ký hiệu là MX10. 2.3.2 Sắc kí cột cho phân đoạn EA.1 Sắc kí cột silica gel áp dụng cho 1,90g của phân đoạn EA.2, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc ký được hứng vào các hũ bi. Dùng sắc kí bảng mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 4 phân đoạn, các phân đoạn được trình bày trong bảng 4. Bảng 4: Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.1 Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Sắc kí bảng mỏng Ghi chú EA.1.1 C : M : H2O (95 : 5 : 2) 287 Vết dài Chưa khảo sát EA.1.2 C : M : H2O (95 : 5 : 2) 100 Nhiều vết Chưa khảo sát EA.1.3 C : M : H2O (95 : 5 : 2) 250 Một vết rõ, đẹp, vết dơ mờ Khảo sát EA.1.4 C : M : H2O (95 : 5 : 2) 160 Vết dài Chưa khảo sát 2.3.2.1. Sắc kí cột cho phân đoạn EA.1.3 của bảng 4 Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn EA.1.3 (250g) trong bảng 4, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các hũ bi. Dùng sắc kí bảng mỏng để kiểm tra phần cao thu được, Trang 32 những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 4 phân đoạn, các phân đoạn được trình bày trong bảng 5. Bảng 5: Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.1.3 của bảng 4 Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (mg) Sắc kí bảng mỏng Ghi chú EA.1.3.1 C : M : H20 (95 : 5 : 3) 40 Một vết rõ, tròn, đẹp Trùng với MX9 EA.1.3.2 C : M : H20 (95 : 5 : 3) 150 Một vết rõ, tròn, đẹp Khảo sát EA.1.3.3 C : M : H20 (95 : 5 : 3) 10 Vệt dài Chưa khảo sát EA.1.3.4 C : M : H20 (95 : 5 : 3) 10 Nhiều vết Chưa khảo sát 2.3.2.2. Sắc kí cột cho phân đoạn EA.1.3.2 của bảng 5 Phần cao thu được từ phân đoạn EA.1.3.2 của bảng 5 được rửa nhiều lần bằng chloroform. Sau đó tiếp tục sắc kí cột silica gel, giải ly bằng hỗn hợp dung môi C:M:H2O (95:5:3). Kết quả thu được chất rắn hình kim màu vàng nhạt (25mg). Kiểm tra nhiều lần bằng sắc kí bảng mỏng với hệ dung môi C : M (8: 2) cho một vết rõ, màu tím, Rf = 0,55. Hợp chất này được kí hiệu là MX11. Trang 33 Sơ đồ 2: Sơ đồ cô lập MX10 từ phân đoạn EA.2 + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly C:M:H2O. Phân đoạn EA.2 (2,5g) Phân đoạn EA.2.1 (50mg) Phân đoạnEA.2.2 (400mg) Phân đoạn EA.2.3 (180mg) Phân đoạn EA.2.4 (70mg) + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly C:M:H2O. Phân đoạn EA.2.2.2 (10mg) Phân đoạn EA.2.2.1 (350mg) Phân đoạn EA.2.2.3 (20mg) MX10 (50mg) + Sắc kí cột silica gel nhiều lần +Giải ly C:M:H2O + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly C:M:H2O. Ph đoạn EA.2.2.1.1 (35mg) Phân đoạn EA.2.2.1.2 (200mg) Phân đoạn EA.2.2.1.3 (20mg) Trang 34 Sơ đồ 3: Sơ đồ cô lập MX11 từ phân đoạn EA.1 Phân đoạn EA.1 (1,9g) Phân đoạn EA.1.1 (287mg) Phân đoạn EA.1.2 (100mg) Phân đoạn EA.1.3 (250mg) Phân đoạn EA.1.3.1 (40mg) Phân đoạn EA.1.3.2 (150mg) Phân đoạn EA.1.3.3 (10mg) Phân đoạn EA.1.3.4 (10mg) Phân đoạn EA.1.4 (160mg) MX11 (25mg) + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly C:M:H2O + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly C:M:H2O. + Rửa nhiều lần bằng chloroform. + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly C:M:H2O Trang 35 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trang 36 3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của chất MX10 Hợp chất MX10 (50mg) là chất rắn hình kim màu vàng, Rf = 0,55(C:M tỉ lệ 8:2) có đặc điểm phổ: Phổ 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT-NMR (125MHz, DMSO, δppm) (phụ lục 5,6,7,8) cho thấy có các tín hiệu cộng hưởng của 29 cacbon: 1 cacbon loại – CH3, 2 cacbon loại –OCH3, 1 cacbon loại –CH2, 7 cacbon loại , 5 cacbon loại =CH-, 2 cacbon loại =C< , 2 tín hiệu cacbon với δC 101,17 ppm và δC 100,59 ppm đặc trưng cho 2 C-anomer của đường, 1 cacbon với δC 177,5 ppm đặc trưng cho nhóm >C=O, 8 cacbon của đường dạng >CH-O- xuất hiện trong vùng 76,41- 68,24 ppm, chi tiết độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử cacbon được trình bày trong bảng 6. Phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO, δppm) (phụ lục 2,3) : 7,54 (1H; d; 4J=2,5Hz); 7,04 (1H; d; 3J=8,5Hz); 7,73 (1H; dd; 3J=8,5Hz; 4J=2,5Hz); 6,68 (1H; d; 4J=2,0Hz); 6,37 (1H; d; 4J=2,0Hz); 1tín hiệu mũi đơn của proton –OH tại δH 12,53ppm; 1 tín hiệu mũi đôi tại δH 5,39ppm (1H; d; J=7,5Hz) và 1 tín hiệu mũi đơn tại δH 4,39ppm đặc trưng cho 2 H-anomer của đường. Chi tiết độ dịch chuyển hóa học của tất cả các proton được trình bày chi tiết trong bảng 6. Phổ COSY, HSQC, HMBC (phụ lục 9-21) Biện luận cấu trúc hóa học: Phổ 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT-NMR của hợp chất MX10 cho thấy có 29 cacbon, trong đó có 7 cacbon loại với δC [156,7; 133,8; 160,9; 165,2; 156,4; 145,9; 150,2]; 5 cacbon loại =CH- với δC [97,9; 92,3; 115,8; 111,4; 121,6]. Điều này phù hợp với phổ 1H-NMR xuất hiện 5 tín hiệu proton của vòng thơm: 7,54 (1H; d; 4J=2,5Hz); 7,04 (1H; d; 3J=8,5Hz); 7,73 (1H; dd; 3J=8,5Hz; 4J=2,5Hz); 6,68 (1H; d; 4J=2,0Hz); 6,37 (1H; d; 4J=2,0Hz). Ngoài ra, trên phổ 13C- NMR còn xuất hiện 1 cacbon với δC 177,5 ppm đặc trưng cho nhóm >C=O. Từ những dữ kiện của phổ 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT-NMR và phổ 1H-NMR, chúng tôi dự đoán hợp chất MX10 có khung flavone. C O C O Trang 37 O O A B 3 2 5' 1 6' 1' 2' 3' 4' 8 7 6 5 10 4 9 Flavone Phổ 1H-NMR (phụ lục 2,3) của hợp chất MX10 có xuất hiện tín hiệu của proton trong vùng 4-3ppm; 1 tín hiệu của 3 proton nhóm –CH3 [δH 0,98 ppm (3H; d; J=6Hz)]; 2 tín hiệu H-anomer [δH 5,39 ppm (d, J=6Hz) và 4,39 (s)]. Đồng thời trên phổ 13C-NMR (phụ lục 5,6) kết hợp kĩ thuật DEPT-NMR (phụ lục 7,8) xuất hiện 2 C-anomer (δC 101,17 ppm và 100,78 ppm); 1 tín hiệu của cacbon –CH3 (δC 17,71 ppm), và tín hiệu của 8 cacbon liền kề trong vùng 76,41-68,24 và 1 cacbon của –CH2- (δC 66,87 ppm). Từ những dữ kiện trên, chúng tôi dự đoán hợp chất MX10 có 2 phân tử đường: 1 phân tử đường β-D-glucose ứng với H-anomer [δH 5,39 ppm (d; J=6Hz)] và một phân tử đường α-L-rhamnose ứng với H-anomer [δH 4,39 ppm (s)]. Kết hợp tất cả các dữ kiện, chúng tôi dự đoán hợp chất MX10 gồm 1 khung flavone và 2 phân tử đường (β-D-glucose và α-L-rhamnose). Hình 4: Một phần phổ 1H-NMR của hợp chất MX10 Trang 38 Cấu trúc của phần aglycol:  Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu dạng singlet có độ dịch chuyển hóa học δH 3,86 ppm với cường độ tương đối 6H, đặc trưng cho proton của 2 nhóm – OCH3. Cacbon với δC 177,5 ppm được quy kết cho C-4.  Vòng A được dự đoán là 1 vòng benzen có 4 nhóm thế vì chỉ còn 2 tín hiệu proton tại δH 6,68 ppm (1H; d; 4J=2,0Hz) và δH 6,37 ppm (1H; d; 4J=2,0Hz) (2 proton này ở vị trí meta với nhau vì có hằng số ghép nhỏ, J=2Hz).  Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu proton tại δH 12,53 ppm chứng tỏ đây là nhóm –OH gắn ở vị trí C-5 của vòng A (vì H của nhóm –OH này tạo liên kết hydro nội phân tử với nhóm >C=O nên dịch chuyển về vùng trường yếu). Từ đó, chúng tôi cũng suy ra nhóm thế còn lại phải ở vị trí C-7.  Trên phổ HMBC, 2 tín hiệu proton của vòng A (δH 6,37 ppm và δH 6,68 ppm) cùng tương tác với tín hiệu cacbon loại tại δC 165,2 ppm và 105,0 ppm nên 2 cacbon này lần lượt được quy hết cho C-7 và C-10 [vì C-7 gắn trực tiếp với nhóm thế (nhóm –OH hoặc nhóm –OCH3)]. Đồng thời, tín hiệu proton tại δH 6,37 ppm là của H-6 và δH 6,68 ppm là của H-8 [vì H-6 có 2 nhóm đẩy điện tử (2 nhóm –OH hoặc 1 nhóm –OH và 1 nhóm –OCH3) ở vị trí ortho nên proton gắn trên C-6 sẽ cộng hưởng ở trường mạnh hơn so với proton gắn trên C-8]. Kết hợp phổ HSQC, chúng tôi quy kết được tín hiệu của C-6 là δC 97,9 ppm và C-8 là δC 92,3 ppm. C O Hình 5.1: Một phần phổ HMBC của hợp chất MX10 Trang 39 Trong phổ HMBC: ♦ H-6 tương tác với cacbon loại tại δC 160,9 ppm nên cacbon này được quy kết cho cho C-5. ♦ H-8 tương tác với cacbon loại tại δC 156,4 ppm nên cacbon này được quy kết cho C-9. ♦ Proton của nhóm –OCH3 (δH3,86 ppm) tương tác với cacbon tại δC 165,2 ppm (C-7). Điều này cho thấy nhóm –OCH3 được gắn vào vị trí số 7. 7 6 5 10 9 8 4 3 2 O OOH H H3CO H Hình 6: Tương quan phổ HMBC trên vòng A của MX10 Vòng B là 1 benzen mang 3 nhóm thế ở vị trí 1’, 3’, và 4’ với các tín hiệu proton tại δH 7,54 ppm (1H; d; 4J=2,5Hz); 7,73 ppm (1H; dd; 3J=8,5Hz; 4J=2,5Hz); 7,04 ppm (1H; d; 3J=8,5Hz), nên chúng tôi dự đoán vòng B mang 2 nhóm thế (-OH hoặc –OCH3) tại vị trí 3’ và 4’. Trên phổ HMBC, proton tại δH 7,54 ppm (1H; d; 4J=2,5Hz) tương tác với 3 cacbon dạng tại δC 150,2 ppm; 145,9 ppm; 156,7 ppm. Từ đó, có thể dự đoán proton tại δH 7,54 ppm là H-2’. Các tín hiệu còn lại tiếp tục được quy kết như sau:  H-2’ ghép meta với H-6’ có độ dịch chuyển là δH 7,73 ppm (1H; dd, J=8,5, J=2,5) nên tín hiệu proton tại δH 7,73 ppm là của H-6’ và do đó tín hiệu proton tại δH 7,04 ppm (1H; d, J=8,5) là tín hiệu của H-5’. Kết hợp phổ HSQC, có thể quy kết cacbon tại δC 115,8 ppm là của C-2’; 121,6 ppm là của C-6’; 111,4 là của C-5’.  Trong phổ HMBC, 3 proton H-2’, H-5’, H-6’ cùng tương tác với cacbon tại δC 150,2 ppm nên đây là tín hiệu của C-4’.  H-2’ và H-6’ cùng tương tác với cacbon có δC 156,7 ppm nên đây là C-2 (vì C-2 có gắn với O) C O C O C O Trang 40  H-2’ và H-5’ cùng tương tác với cacbon tại δC 145,9 ppm nên đây là C- 3’.  H-5’ tương quan với cacbon dạng =C< tại δC 122,4 ppm nên đây là C-1’.  Như vậy, trong 15 tín hiệu cacbon của khung flavone trên phổ 13C-NMR chỉ còn tín hiệu cacbon dạng =C< với δC 133,8 ppm nên cacbon này phải là C-3.  Ngoài ra, proton của nhóm –OCH3 (δH 3,68 ppm) tương tác với cacbon tại δC 150,2 ppm (C-4’). Điều này cho thấy nhóm –OCH3 được gắn vào vị trí C-4’. 7 6 5 10 9 8 4 3 2 O OOH H H3CO H 1' 2' 4' 5' 6' H H H OCH3 H 3' Hình 7: Tương quan phổ HMBC trên vòng B của hợp chất MX10 Hình 5.2: Một phần phổ HMBC của hợp chất MX10 Trang 41 Từ đó kết luận phần aglycol là 7,4’-Di-O-methylquercetin. Biện luận đường Phổ 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT xác định tín hiệu cacbon metyl – CH3 tại δC 17,17 ppm là C-6’’. Phổ HSQC xuất hiện tín hiệu tương quan H-anomer δH 4,39 ppm và cacbon tại δC 100,78 ppm nên đây là đường α-rhamnopyranose. Phổ HMBC kết hợp với phổ HSQC và COSY có thể quy kết các tín hiệu còn lại của đường α-rhamnopyranose như sau: C-2’’ (δC 70,4 ppm), C-3’’ (δC 70,6 ppm), C-4’’ (δC 71,8 ppm), C-5’’ (δC 68,2 ppm). Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của nhóm –CH2-O- tại 66,89 nên có thể dự đoán đây là đường glucose. Phổ HSQC có tương tác giữa δH 5,39 ppm và δC 101,17 ppm nên đây là C-1’’. Dựa vào phổ COSY, HMBC, HSQC chúng tôi quy kết các tín hiệu còn lại của đường D-glucose như sau C-2’’ (δC 74,1 ppm), C-3’’ ( δC 76,4 ppm), C-4’’ (δC 69,9 ppm), C-5’’ (δC 75,9 ppmm). Ngoài ra, trên phổ HMBC còn xuất hiện tương tác giữa H-1’’’ (δH 4,39 ppm) với C-6’’ (δC 66,89 ppm) và tương tác giữa H-6’’ (δH 3,7 ppm) với C-1’’’ (δC 100,8 ppm) nên có thể khẳng định đường rhamnose gắn vào vị trí C-6’’ của đường glucose. Hình 5.3: Một phần phổ HMBC của hợp chất MX10 Trang 42 Trên phổ HMBC không có tín hiệu của H-anomer (H-1’’) của đường glucose tương tác với cacbon nào nhưng dựa vào cấu trúc của phần aglycol, chúng tôi dự đoán H-1’’ gắn vào vị trí C-3 hoặc C-3’ của phần aglycol. Nên hợp chất MX10 có thể là 7,4’-Di-O-methylquercetin-3-O-β-rutinoside hoặc là 7,4’-Di-O- methylquercetin-3’-O-β-rutinoside. Kết hợp so sánh số liệu phổ của hợp chất MX10 với hợp chất 7,4’-Di-O- methylquercetin-3-O-β-rutinoside[16] chúng tôi thấy có sự trùng khớp tốt (kết quả so sánh được trình bày trong bảng 6). Từ đó, chúng tôi kết