Khóa luận Phương pháp ly trích,thu nhận và làm giàu Acid Docosahexaenoic trong mỡ cá Basa Pangasius Bocourti sauvage

id arachidonic (AA), các sản phẩm phân hủy của AA (endoperoxide và eicosanoid) tạo ra nhiều gốc tự do hơn sản phẩm của DHA nhưng DHA cũng ức chế sự tổng hợp nitric oxide (làm giảm sự hình thành các gốc tự do peroxynitrite) và ức chế sự phiên mã yếu tố NF-κB (giảm sự hình thành các cytokine tiền phản ứng viêm). Các cytokine và các yếu tố điều hòa sự viêm khác như interleukin IL và yếu tố hoại tử khối u TNF có một hoạt động tế bào tiền phản ứng viêm. DHA cùng với acid eicosapentaenoic ức chế sự hình thành các cytokine IL-1β và TNF-α qua một cơ chế hiện vẫn chưa được biết đến. g) Tác dụng đối với bệnh thấp khớp [10] DHA có khả năng ngăn chặn phản ứng của hệ miễn dịch gây ra chứng viêm khớp, khiến khớp bớt cứng và sưng, làm thuyên giảm các triệu chứng của bệnh này. Một số công trình nghiên cứu khi cho bệnh nhân dùng những liều dầu cá từ 2-4g, thậm chí 5g/ngày, đã cho một số kết quả khá hứa hẹn: khớp bớt cứng và ít đau hơn. h) DHA và bệnh ung thư [3] Noding và các cộng sự đã quan sát được rằng sự nhạy cảm của các tế bào khối u in vitro đối với DHA và những sản phẩm oxid hóa của DHA phụ thuộc vào trạng thái chống khối u. Có bằng chứng đề nghị rằng các ω-3 LC PUFAS, đặc biệt là DHA, làm tăng sự nhạy cảm của các tế bào ung thư đối với các tác nhân chống ung thư vú và các tiền chất oxid hóa. Đề nghị này được ủng hộ bởi các kết quả nghiên cứu có uy tín của Bougnoux và các cộng sự, người đã theo dõi phản ứng được cải thiện đối với việc hóa trị liệu (chemotherapy) ở những bệnh nhân ung thư vú có hàm lượng DHA cao trong mô mỡ ở ngực. i) Ăn nhiều cá giúp bạn bớt … cáu bẳn[37] Các nghiên cứu đang chứng minh cho thấy, thiếu acid béo trong chế độ ăn sẽ làm cho chúng ta... dữ dằn hơn và kém thông minh hơn. Tiến sĩ Jackie Stordy, cựu trưởng khoa nghiên cứu dinh dưỡng đại học Surrey (Anh) cho biết sự hấp thu nhiều cá giàu acid béo có mối liên hệ tới khả năng làm dịu đi sự hằn học, cáu bẳn. Thực phẩm có tác động trực tiếp đến cảm xúc và tâm trạng. 1.1.3.3. Nguồn hiện diện và tình hình nghiên cứu DHA.[29] DHA được tìm thấy nhiều ở cá, đặc biệt là các loại cá béo, chứa nhiều mỡ và dầu như cá trích, cá thu, cá mòi, cá hồi, cá ngừ, cá tuyết và các loại cá da trơn. Vài loại thực vật nhất định bao gồm dầu đậu nành và dầu cải cũng chứa tiền 15 chất của DHA là α-linolenic acid. Ngoài ra, DHA cũng là một trong những acid béo chính trong thành phần acid béo của một số loài vi nấm sống ở biển như Tharaustochytrium roseum, T. aureum và Schizochytrium aggeratum.[2] Hiện nay, dầu cá là nguồn thu nhận DHA chủ yếu, nhưng DHA cũng có thể được sản xuất bằng cách sử dụng vi sinh vật. Các vi sinh vật biển có thể chứa một lượng lớn DHA và được xem như là nguồn thu nhận hiệu quả của acid béo quan trọng này. Vài loài trong đó có thể tăng trưởng theo lối dị dưỡng trên những chất nền hữu cơ ở điều kiện không có ánh sáng (như vi tảo crypthecodinium cohnii). Gần đây đã có nhiều tiến bộ trong việc sản xuất DHA trong công nghệ sinh học từ các vi sinh vật biển.[5],[11] Như vậy, DHA có trong mỡ cá vùng biển sâu, vùng Green land Nhật Bản, hoặc đi theo con đường tổng hợp nhưng hiện nay đã xác định được trong thành phần mỡ cá basa Việt Nam (Pangasius baucourti) cá nước ngọt, nuôi bè trên dòng sông Mêkông không những có đủ thành phần acid béo không no – acid béo thiết yếu mà còn có thành phần DHA. Ở Việt Nam hiện nay phát hiện có 2 loại cá chứa DHA đó là cá tra và cá ba sa với thành phần chất béo như bảng 6. Bảng 6: Thành phần dinh dưỡng của cá tra, cá basa [30] Thành phần dinh dưỡng trên 100g sản phẩm ăn được Tên Calo (cal) Calo từ chất béo Tổng lượng chất béo (g) Chất béo bão hòa (g) Cholesterol (mg) Natri (mg) Protein (g) Cá tra 124,52 30,84 3,42 1,64 25,2 70,6 23,42 Cá basa 170 60 7 2 22 70,6 28 Qua bảng 6 nhận thấy rằng nguồn dinh dưỡng của cá ba sa nhiều hơn đặc biệt là tổng lượng chất béo, đó là lý do hiện nay ở nước ta đang cố gắng làm giàu DHA, tiến tới tách DHA từ mỡ cá basa dần dần khỏi phải nhập ngoài, để bổ sung vào sản phẩm thực phẩm nhằm góp phần cho con em chúng ta sau này thông minh hơn, khỏe mạnh hơn. Hình 2: Cá tra Tên khoa học: Pangasius hypophthalmus (Sauvage, 1878) 16 Hình 3: Cá basa Tên khoa học: Pangasius bocourti (Sauvage, 1880) 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP DHA 1.2.1. Phương pháp chưng cất phân đoạn bằng li tâm phân tử[19] Acid béo của dầu cá mòi (10% DHA) được phân chia thành những phân đoạn bằng ly tâm phân tử cho đến khi được những phân đoạn chứa hàm lượng acid béo lần lượt là 5, 11, 20, 21 và 30%. Phân đoạn cuối cùng được khuấy với urê trong MeOH ở 45oC, làm lạnh trong 18 giờ ở 16oC, lọc, nước lọc cho tiếp xúc với nhiều urê hơn, làm lạnh ở 13oC qua đêm, lọc, nước lọc được cô đặc và tái xử lý với urê. Nước lọc cuối cùng được rót vào nước, dung dịch nước này được trích ly với ether, làm khan dung dịch ether với Na2SO4 và dung môi được loại bỏ. Sản phẩm bây giờ chứa 88% DHA, và được làm tinh khiết hơn bằng cách chuyển thành methyl ester, đi qua silica gel, giải li bằng dung môi ether dầu hỏa, và loại bỏ những tạp chất còn dư bởi sự chưng cất phân tử. 1.2.2. Phương pháp sắc kí khí định lượng (preparative scale gas chromatography)[16] Dầu gan cá tuyết chứa 3 loại acid béo không bão hòa cần thiết (C18:4, C20:5, C22:6) được xà phòng hóa, và acid được tìm thấy có chỉ số iod là 205. Phổ UV cho thấy sự hiện diện của 0,11% nối đôi liên hợp và 0,07% nối ba liên hợp, những đồng phân khác không hiện diện. Từ 200g dầu, polyenoic ester được cô đặc bằng phương pháp urea – MeOH và hydro hóa để cho 36,5g các acid có giá trị iod 401. Hỗn hợp này được ester hóa với MeOH-H2SO4 và hỗn hợp ester qua sắc kí cho thấy có chứa 11% C18:4, 32,6% C20:5 và 49,7% C22:6, trong khi phổ UV cho thấy 1,5% nối đôi tiếp cách. Sắc kí định lượng được tiến hành trên cột cao 152,4 cm được nhồi bằng 5% Apiezon trên Chromosorb G. Dòng khí N là 150ml/phút. Nhiệt độ cột và ống góp là 225oC. Phân đoạn thu được có thể được là tinh sạch hơn bằng sắc kí cột. 1.2.3. Phương pháp sắc kí cột (column chromatography)[12] Các acid béo bất bão hòa và những dẫn xuất của chúng được tách bởi sắc kí cột sử dụng CO2 siêu tới hạn hoặc CO2 lỏng như là pha động và oxid nhôm đã xử lý với kiềm như là pha tĩnh. Việc xử lý trước, tốt nhất là với NaOH trong dung môi nước hữu cơ, cho thấy những kết quả được cải thiện với acid béo bất bão hòa đa. Phosphate kim loại cũng được sử dụng như là tác nhân tách chiết các acid béo bất bão hòa và các chất tương đồng của chúng. Các tác nhân tách chiết bao gồm các muối phosphoric acid với Ag (và các kim loại khác). Hỗn hợp chứa ethyl eicosapentaenoate và ethyl docosahexaenoate được đưa lên sắc ký cột silica gel phủ Ag phosphate và cột được giải li với hỗn hợp n-hexane và n-hexane-isopropanol để thu nhận lượng ester. Phương pháp sắc kí cột ion bạc cũng được dùng để thay thế cho việc trích pha rắn để tách các acid béo methyl ester. Cột trích pha rắn loại Bond Elut SCX (0,5g propylbenzene sulphonic acid) được cân bằng bởi 5ml NaOH 1M, 10ml nước, 5ml HCl 4M, nước cho đến khi đạt pH trung tính và tiếp tục với acetonitrile-nước (10:1). Cột được bọc lại trong cuộn nhôm để tránh ánh sáng. 17 Cột được chuyển sang dạng ion bạc bằng cách cho ngấm kiệt từ từ 1ml dung dịch AgNO3 (40mg AgNO3 trong 1ml acetonitrile-nước 10:1). Sau đó cột được giải ly lần lượt với 5ml acetonitrile, 5ml acetone và 10ml dichloromethane. 0,1ml dichloromethane chứa không quá 1mg acid béo methyl ester. Các (hệ) dung môi dùng để giải ly có độ phân cực tăng dần (từ dichloromethane đến acetone-acetonitrile) theo số liên kết đôi của acid béo (từ acid béo bão hòa đến acid béo 6 nối đôi). Sự giải li tiến hành ở áp suất khí quyển (vận tốc dòng chảy 0,5ml/phút). DHA và các dẫn xuất của nó được cô lập từ hỗn hợp các acid béo bất bão hòa đa từ nguồn tự nhiên bằng phương pháp bạc nitrate. Phương pháp bao gồm sự tính toán lượng bạc nitrate cần để tạo phức với các acid bất bão hòa đa dựa trên số mol nối đôi có trong acid béo bất bão hòa. DHA được tách chiết và tinh sạch từ dầu cá ngừ bằng phương pháp tách chiết nhiệt độ thấp kết hợp với phương pháp kết tinh sắc kí cột Ag+/silica gel hoặc phương pháp riêng l3 với sắc kí cột Ag+/silica gel. Dung môi giải li cột là hỗn hợp của aceton (hoặc diethyl ether)-hexane. 1.2.4. Phương pháp CO2 siêu tới hạn (supercritical carbon dioxide) [20] CO2 siêu tới hạn (SC-CO2) là một chất thích hợp để trích ly các chất không phân cực (triacylglycerol). Hiệu quả trong việc sử dụng SC-CO2 và hỗn hợp ethanol để trích ly và phân đoạn các phospholipid từ trứng cá hồi đã được khảo sát. Sự trích ly được thực hiện ở nhiệt độ 33oC và áp suất thấp 17.7MPa để tránh sự oxid hóa các acid béo bất bão hòa đa. Các phospholipid đươc trích ly hiệu quả với 10, 15 hay 20% ethanol trong SC-CO2. Lượng phospholipid được trích ly tăng cùng với sự bổ sung ethanol (với hỗn hợp 20% ethanol, có 80% các phospholipid được thu nhận). Các acid béo được trích ly từ cá bằng cách sử dụng một máy đặc biệt gọi là “máy trích CO2 lỏng siêu tới hạn” (Supercritical Fluid CO2 Extraction Machine). Ba mức áp suất khác nhau (200, 240 và 280 bar), ba mức nhiệt độ khác nhau (35, 40 và 45oC) và 5 khoảng thời gian khác nhau (60, 120, 180, 240 và 300 phút) được chọn. Điều kiện lý tưởng nhất cho sự trích ly acid béo bất bão hòa đa được xác định là áp suất 280 bar ở nhiệt độ 40oC và 300 phút. 1.2.5. Phương pháp sắc ký điều chế với pha tĩnh được sử lý với nitrate bạc (silver nitrate method) [8] Một phương pháp khác được sử dụng để tinh sạch hỗn hợp các acid béo methyl ester từ dầu cá hoặc dầu thực vật là phương pháp sắc kí lớp mỏng ion bạc. Các bản mỏng silica gel được nhúng trong 1 phút vào dung dịch bạc nitrate 4% trong methanol-nước (9:1). Sau đó bản mỏng được sấy khô 2 phút dưới ánh sáng mờ trong tủ sấy thông gió và tiếp tục trong 20 phút ở 100oC. Chúng được giữ trong 1 hộp được đậy kín ở trong tối. Dung môi giải ly có thể là hexane-diethyl ether (9:1) để tách các acid béo bão hòa, acid béo có 1 nối đôi và acid béo có 2 nối đôi, hoặc là toluen-ethyl acetate (9:1) để tách tất cả các loại acid béo theo độ bất bão hòa. Tỷ lệ dung môi có thể thay đổi 1 ít theo điều kiện thí nghiệm (loại bản mỏng, độ ẩm, nhiệt độ, hình dạng của bình giải ly …) để nâng cao hiệu quả của việc phân tách. Việc thêm 1% acid acetic theo thể tích vào pha động cho phép các vết acid béo đạt độ phân giải tốt. Bản mỏng được sấy trong tủ sấy thông gió, nhúng vào dung dịch nước đã bão hòa sodium thiosulphate trong 1 phút và rửa dưới dòng nước chảy trong 1 phút. Sau đó tiếp tục sấy khô và phun xịt với primuline để phát hiện các vết acid béo phát huỳnh quang dưới đèn UV. 18 1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.3.1. Phương pháp transester hóa [13] Trong phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật, một triglycerid sẽ phản ứng với một alcol có mặt chất xúc tác sẽ thu được sản phẩm là một hỗn hợp alkyl ester của acid béo và glycerin. Phương trình phản ứng : 3ROH C C C H2 H2 H OH OH OH R1COOR R2COOR R3COOR xuùc taùc CH2 O R1 O C O R2 CH2 O C O R3 CH C O Triglycerid Rượu Glycerin Hỗn hợp akyl ester Để thực hiện phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật có thể sử dụng các loại xúc tác khác nhau như: 1.3.1.1. Sử dụng xúc tác acid[33],[9] a) Ưu điểm: Là loại xúc tác cơ bản từ lâu đời. Dễ sử dụng, cho hiệu suất cao, rẻ tiền. b) Nhược điểm: Quá trình transester hóa được xúc tác bằng acid Bronsted như acid sulfuric cho một hiệu xuất rất cao nhưng lại xảy ra chậm, đòi hỏi nhiệt độ trên 100oC và 3giờ mới đạt độ chuyển hóa hoàn toàn. Ngoài ra, phản ứng trên phải được thực hiện trong môi trường không có nước để tránh có sự cạnh tranh tạo ra acid carboxilic làm giảm hiệu suất phản ứng. Thiết bị phản ứng mau hư do bị ăn mòn. Theo William W. Christie (Scotland) thông thường lipid được hòa tan trong chất phản ứng và hỗn hợp được đun nóng khoảng 2 giờ, nhưng nó có thể cũng được đun nóng trong ống kín ở nhiệt độ cao và thời gian ngắn hơn. Lượng xúc tác H2SO4 cho vào khoảng 1-2% trong dung môi là methanol. 1.3.1.2. Sử dụng xúc tác bazơ [9],[31] Xúc tác bazơ thường được sử dụng trong công nghiệp như: NaOH, KOH, Carbonat kim loại kiềm, CH3ONa,… Trong đó, CH3ONa được xem là xúc tác hoạt động tốt nhất (cho hiệu suất trên 98% trong 30 phút với một lượng nhỏ 0,5%). a) Ưu điểm: - Xúc tác bazơ ít có tính ăn mòn đồng thời cũng thúc đẩy tiến trình xảy ra nhanh hơn khi so sánh với xúc tác acid. - Giá thành rẻ (KOH, NaOH). Việc tăng nồng độ xúc tác lên khoảng 1% hoặc 2% là có hiệu suất cao không kém gì alkoxid kim loại. - K2CO3 được dùng với nồng độ 2% hoặc 3% cũng cho hiệu suất cao đồng thời tránh được sự thủy phân ester do bicarbonat được tạo thành thay vì nước ở xúc tác hydroxyd. 19 b) Nhược điểm: - KOH và NaOH với giá thành rẻ nhưng kém hoạt động hơn K2CO3, CH3ONa. Tuy nhiên, với loại xúc tác hyroxyd này sẽ làm sản sinh ra một lượng nước ngay cả trong môi trường khan nước ban đầu (do phản ứng với rượu), điều này sẽ làm giảm hiệu suất phản ứng (do có nước sẽ thúc đẩy quá trình thủy phân ester tạo thành). - Việc sử dụng xúc tác bazơ mạnh trong phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật rất dễ xảy ra quá trình xà phòng hóa, điều đó dẫn đến làm giảm hiệu suất phản ứng và việc tách loại ester và glycerin tạo thành cũng gặp khó khăn. Theo nghiên cứu của trường đại học Idaho [31], quá trình transester hóa dầu cải chịu tác động của nhiều yếu tố: 1) nhiệt độ, 2) xúc tác, 3) tốc độ khuấy trộn, 4) nước trong alcol được sử dụng, 5) lượng alcol dư được sử dụng. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu là: 1) nhiệt độ phòng, 2) xúc tác NaOCH3 0,5% hoặc KOH 1% so với trọng lượng dầu cải, 3) tốc độ khuấy trộn nhanh, mãnh liệt trong những giai đoạn đầu của phản ứng và không quan trọng lắm sau khi đã trở thành hỗn hợp đồng nhất, 4) ethanol tuyệt đối thì cho tốc độ chuyển hóa nhanh, 5) lượng alcol dư là hơn 50% đối với NaOCH3 và hơn 100% đối với KOH. Theo cuộc nghiên cứu đó thì quá trình transester hóa trải qua ba giai đoạn: 1) phản ứng transester hóa, 2) sự phân lớp, 3) quá trình rửa. 1.3.1.3. Sử dụng xúc tác enzym[41],[42] Sự tạo thành acid docosahexaenoic (DHA) đã được nghiên cứu trong dầu cây anh thảo (Oenothera biennis L) và dầu cây borage (Borago officinalis L.) (một loại cây mà hoa và lá được dùng làm món sà lát và tạo hương vị cho thức uống) bằng con đường transester hoá với xúc tác lipase.[41] Có 6 loại lipase: Novozym 435 từ Candida antarctica, Lipozyme IM từ Mucor miehei, PS-30 từ Pseudomonas sp., AP-12 từ Aspergillus niger, AY-30 từ Candida rugosa, và Novozym-677BG từ Thermomycelanuginosus được kiểm tra cho khả năng hợp thành DHA (22:6 ω-3) trong dầu cây anh thảo. Trong số các enzym đã ví dụ thì Novozym 435 từ Candida antarctica được chọn làm xúc tác cho phản ứng transester hóa vì lý do hợp thành DHA cao. Khi có sự tập trung của enzym cao, tỷ lệ chất nền, và thời gian ủ tăng thì sự hợp thành DHA cũng tăng. Trong một tiến trình phản ứng sự hợp thành DHA tăng lên 25,2% sau 24giờ. Cao nhất là 37,4% khi tỷ lệ dầu cây anh thảo/DHA là 1/3. Cây anh thảo[42] (Oenothera biennis L.) là cây hai năm thuộc họ dừa nước (Onagraceae) là một loại cây thông thường sống ở Bắc Mỹ. Điều thú vị là dầu anh thảo có chứa γ-linolenic acid (GLA; 18:3 ω-6) (Senanayake và Shahidi, 1999a). Ưu điểm:[14] Đa số các enzym làm xúc tác đều được thực hiện ở điều kiện bình thường (nhiệt độ phản ứng là 20-40oC), không tốn năng lượng và không đòi hỏi thiết bị phức tạp. Các chất thải enzym dễ bị phân hủy nên không gây ô nhiễm môi trường. Hiệu lực xúc tác của enzym lại rất lớn (vận tốc phản ứng gấp 108-1011 lần) so với những phản ứng dùng xúc tác hóa học thông thường. Nhược điểm:[14] Mỗi loại enzym chỉ xúc tác nên một số chất nền và kiểu nối hóa học nhất định trong phân tử. Ngoài ra, việc sử dụng xúc tác enzym có mặt hạn chế là thời gian phản ứng rất lâu (20 giờ). Đồng thời phải tìm được loại enzym phù hợp với đối tượng nghiên cứu. 20 1.3.1.4. Xúc tác zeolit[9] Trong những năm gần đây, người ta thường ứng dụng xúc tác acid, bazơ rắn,… đặc biệt là zeolit đang được xem là một chất xúc tác hiệu quả cho phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật do có một số ưu điểm nổi bật sau: • Có tính chọn lọc cao • Việc tách các sản phẩm sau phản ứng dễ dàng. • Xúc tác zeolit sau khi thu hồi có thể sử dụng lại. • Hiệu suất phản ứng cao • Phản ứng không sinh ra sản phẩm phụ (do không có hiện tượng xà phòng hóa so với các xúc tác bazơ cổ điển). Ngoài ra người ta còn thường sử dụng các chất xúc tác khác cho hiệu quả cao nhưng qui trình thực hiện lại khá phức tạp. Ví dụ như sử dụng chất xúc tác calicined Mg-Al hydrotalcites[43]. Xúc tác này gồm: 187ml dung dịch chứa Mg/Al theo tỷ lệ Mg(NO3)2.6H2O và Al(NO3)3.9H2O (tổng metal nitrat, 0,375mol), thêm từ từ 187ml dung dịch thứ hai chứa NaOH (0,4375 mol) và Na2CO3 (0,1125 mol), pH = 8-10. Trong phần thực nghiệm này chúng tôi không sử dụng xúc tác là Zeolit vì qui trình tổng hợp hơi phức tạp. Chúng tôi sử dụng loại xúc tác có sẵn là bazơ (KOH, NaOH) rẻ tiền và kinh tế với hàm lượng nhỏ khoảng 1-2%. 1.3.2. Phương pháp làm giàu DHA 1.3.2.1. Phương pháp sắc kí cột[12] Theo Teshima, S. et al [40], mô tả về phương pháp cô lập của EPA và DHA từ dầu cá bằng xà phòng hóa với ethanol xúc tác KOH. Phần metyl ester của acid béo thô được làm tinh bằng sắc kí cột trên silica gel và sau đó EPA được phân chia ra khỏi DHA bằng sắc kí cột trong hỗn hợp bạc nitrat và silica gel. Sắc ký pha lỏng trên cột (Sắc ký cột hở) là tên gọi chung cho một số hệ thống vật lý trong đó một cột được nạp chặt chẽ bởi chất hấp thu và có một pha lỏng di động chảy xuyên ngang qua. Sắc ký cột nhanh khô là một biến đổi của sắc ký cột nhanh, sử dụng áp suất kém để gia tăng vận tốc giải ly của pha động. Kỹ thuật này khác với sắc ký nhanh là cột sắc ký được rút khô sau mỗi phân đoạn thu được. Ưu điểm của sắc ký nhanh cột khô là nhờ có lực hút bên dưới để hút dung môi giải ly nên thời gian triển khai nhanh hơn sắc ký cột cổ điển. Ngoài ra, kỹ thuật này còn có thuận lợi là sử dụng các thiết bị có sẵn trong phòng thí nghiệm (phễu, bình tam giác, vòi nước tạo áp suất kém.v.v…). Hệ thống bao gồm: phễu lọc xốp thủy tinh loại 150ml, fiole, và hệ thống tạo áp suất bằng vòi nước (20-70 mmHg). Chất hấp thu là silica gel khô vào phễu đến tận miệng, gõ nhẹ ngoài thành phễu để chất hấp thu gọn lại. Gắn phễu vào hệ thống tạo áp suất kém và dùng nút thủy tinh có đáy bằng để nén ép đều silica gel xuống đáy phễu, tạo thành một khối cứng, đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt bằng phẳng. Chiều cao của chất hấp thu sau khi nén cao khoảng 5cm. Tiền giải ly cột bằng ether dầu hỏa. Rót dung môi lên đầu cột, gắn vào hệ thống tạo áp suất kém, dung môi sẽ đi xuống xuyên qua cột. Thực hiện vài lần để có cột đồng nhất. Cột được rút khô, tắt áp suất kém. 1.3.2.2. Phương pháp tủa urê [40],[43] 21 Các acid béo bất bão hòa đa (polyunsaturated fatty acid(s)) có thể được làm giàu lên bằng nhiều phương pháp khác nhau như tạo tinh thể ở nhiệt độ thấp, tủa urê, lọc phân tử, tạo kết tủa với ion bạc hoặc bằng cách sử dụng lipase. Tuy nhiên, phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất để thu nhận những acid béo bất bão hòa đa được làm giàu dưới dạng những acid béo tự do từ mỡ cá là phương pháp tủa urê. Đây là một phương pháp để tách các acid béo bão hòa ra khỏi acid béo bất bão hòa dựa trên hiện tượng urê sẽ tạo thành tinh thể (kết tủa) với các acid béo bão hòa ở nhiệt độ thấp. Bằng cách loại bỏ những kết tủa này có thể loại bỏ được những acid béo bão hòa trong hỗn hợp. Phương pháp này có thể gia tăng hàm lượng acid béo bất bão hòa đặc biệt là omega-3 trong hỗn hợp lên đến 60-85% (trong trường hợp là dầu cá hồi). Trong việc xử lý với urê, urê được thêm vào dung môi hữu cơ mà có thể hòa tan được cả urê và cả acid béo trong đó, ví dụ như methanol, ethanol, isopropanol, ether dầu hỏa, benzen, trichoroethylene và methyl isobutyl ketone. Ethanol được sử dụng tốt hơn do ít độc. Urê được hòa tan trong dung môi, nếu cần thiết thì đun nóng, lượng urê cho vào khoảng từ 10 – 20%. Dung dịch urê và hỗn hợp ester của acid béo được trộn chung với nhau. Khi trộn hỗn hợp acid béo vào trong dung dịch urê tốt hơn hết là hỗn hợp acid béo được pha loãng trong dung môi hữu cơ để tạo khả năng bảo vệ acid béo chống lại nhiệt độ cao của dung dịch urê. Lượng dung môi urê được điều chỉnh để tối thiểu là 0,5 phần trọng lượng. Dung dịch urê được trộn thành một hỗn hợp đồng nhất với acid béo. Urê sau đó sẽ được tủa bằng cách làm lạnh hỗn hợp. Vào lúc này acid béo bão hòa trong hỗn hợp acid béo sẽ hình thành phức với tinh thể urê và tủa xuống. Sự làm lạnh được kiểm soát bằng cách để dung dịch trong một khoảng thời gian thật lâu, nếu được yêu cầu (thường là qua đêm). Urê kết tinh khi có sự hiện diện metyl ester của acid béo, nó hình thành nên tinh thể hình lục giác có lỗ rỗng ở giữa, với lỗ rỗng này một vài acid béo có thể lọt vừa khít vào và nhờ thế được lọc, loại bỏ ra khỏi dung dịch. Acid béo mạch thẳng thì hình thành phức dễ dàng , nhưng acid béo, ester có nối đôi hoặc cầu metyl làm tăng mức độ phức tạp của cấu tạo thì hình thành kết tinh khó hơn hoặc không thể kết tinh. Khi tiến trình kết tinh hoàn thành, acid béo bão hòa và một phần acid béo bất bão hòa tạo phức, trong khi đó acid béo bất bão hòa đa, có phân nhánh, hoặc có vòng sẽ ở lại trong dung dịch. Phương pháp: Metyl ester (100mg) trộn trong hexan (4ml), methanol (1ml) và urê (1,5g). Để qua đêm, phần rắn được lọc ra khỏi dung dịch và rửa với hexan, phần được rửa và phần lọc trộn chung rồi rửa lại với nước, làm khô bằng muối sulfat natri khan và làm bay hơi. Còn lại phần bất bão hòa và/hoặc có phân nhánh. Một phương pháp khác từ Shucheng Liu và cộng sự[43]: Mỡ cá đem đi thủy giải để thu được những acid béo tự do. Acid béo tự do thu được sau đó sẽ được trộn lẫn với urê (10%, w/v) trong ethanol 95%. Hỗn hợp này được đun nóng kết hợp với khuấy kỹ ở 60 – 70oC đến khi thành một dung dịch đồng nhất. Ban đầu để kết tinh ở nhiệt độ phòng sau đó ở các nhiệt độ khác nhau (25oC, 15oC, 0oC, -15oC, -25oC). Tỷ lệ của urê với lượng acid béo tự do theo nghiên cứu tốt nhất là 1 : 15 theo số mol. Dung dịch này sau đó được cho vào tủ đông -5oC trong 20 giờ. Loại bỏ kết tủa tạo thành bằng phương pháp lọc. Nước lọc sau đó được pha loãng với một lượng nước cất và được acid hóa bởi acid H2SO4 đậm đặc sao cho pH = 2-3. Thêm vào dung dịch nước lọc một lượng hexan (hoặc ether dầu hỏa) và lắc kỹ. Dung dịch nước lọc sau đó sẽ tách làm hai lớp: lớp nước chứa urê nằm phía dưới và lớp hexan (ether dầu hỏa) chứa acid béo nằm phía trên. Thu lấy lớp hexan (ether dầu hỏa), làm khan nước, đem cô quay đuổi dung môi thu được acid béo tự do chứa chủ yếu là các acid béo bất bão hòa. 22 1.3.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng [7] Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), là kỹ thuật phân bố rắn lỏng; trong đó pha động là chất lỏng được cho đi ngang qua một lớp chất hấp thụ trơ. Chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng. Loại bản mỏng được sử dụng trong đề tài này là bản nhôm tráng silica gel có trộn thêm chất phát huỳnh quang (Merck) và sắc ký lớp mỏng được khai triển theo kiểu dung môi giải ly di chuyển xuống. Mẫu chất cần phân tích được hòa tan vào một dung môi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu chất thành một vết nhỏ gọn lên tấm lớp mỏng; vết chấm ở cách vị trí đáy 1 cm. Sấy nhẹ để đuổi một phần dung môi hòa tan mẫu, như thế mẫu chất chỉ còn ở dạng bột khô trên tấm bản mỏng. Đặt tấm lớp mỏng này theo chiều thẳng đứng, vào trong một ly có chứa sẵn một loại dung môi phù hợp (chiều dày của lớp dung môi không quá 1cm). Trước khi đặt bản vào ly, ly đựng dung môi phải ở trạng thái bão hòa dung môi để có được một bầu khí quyển đồng nhất bằng cách phủ lên bề mặt trong cua ly một tờ giấy lọc có tẩm ướt dung môi dùng để giải ly. Dung môi sẽ được lực mao quản hút di chuyển cao lên trong tấm bản, quá trình như thế thì sẽ phân chia hỗn hợp mẫu chất ban đầu thành những vết riêng biệt. Khi dung môi lên gần hết tấm bản (còn cách khoảng 0,5cm), lấy tấm bản ra khỏi bình, sấy khô. Các vết mẫu được xác định bằng phương pháp hóa học với dung dịch thuốc thử là H2SO4 đậm đặc. Bản mỏng sau đó được lưu trữ trong bao plastic. Dung môi giải ly phù hợp là dung môi có thể làm cho hỗn hợp các chất ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau. Các vết này sắc nét, rõ ràng và có vị trí nằm trong khoảng từ 1/3 - 2/3 chiều dài bản sắc ký (các vết chính có Rf khoảng từ 0,3 - 0,7). Mỗi hợp chất sẽ cho một vết, với giá trị Rf không đổi, trong một hệ giải ly xác định, bởi bản sắc ký của một lô sản xuất nhất định. Rf được tính bằng công thức: Mục đích chính của sắc ký lớp mỏng trong bài thực nghiệm n