Luận án Nghiên cứu chế tạo hệ vi cảm biến điện hóa trên cơ sở polyme dẫn biến tính để ứng dụng trong y sinh và môi trường

Sau khi các màng compozít trên cơ sở màng polyme dẫn đa chức năng (được biến tính bằng vật liệu cấu trúc nano) được tổng hợp điện hóa trên bề mặt vi điện cực làm việc (của hệ vi điện cực tích hợp), các phần tử sinh học (đầu dò sinh học như: enzym, aptamer, chuỗi ADN hoặc kháng thể đơn dòng) cần được cố định lên bề mặt màng compozít để phát triển cảm biến sinh học điện hóa. Các đầu dò sinh học được cố định lên bề mặt màng compozít thông qua các liên kết hóa học (-NH-COO-) bằng kỹ thuật sinh học. Các đầu dò sinh học được sử dụng trong luận án này là các đầu dò sinh học có độ đặc hiệu cao như: enzym (Glucose oxidase, Cholesterol oxidase), kháng thể đơn dòng, chuỗi ADN, chuỗi aptamer. III.1 Cố định các phần tử sinh học trên màng polyanilin biến tính III.1.1 Cố định các phân tử enzym lên màng PANi biến tính Kỹ thuật sử dụng để cố định enzym là một trong những vấn đề quyết định cho việc chế tạo một cảm biến sinh học [81]. Từ trước tới nay đã có nhiều phương pháp khác nhau để cố định enzym được sử dụng. Nhưng phổ biến nhất vẫn là 4 phương pháp:  Phương pháp hấp thụ vật lý enzym lên các vật liệu cố định không hòa tan có mang hoặc không mang điện tích.  Phương pháp nhốt enzym ở bên trong polyme tạo thành xung quanh enzym một hệ thống lưới có lỗ nhỏ để không cho phân tử enzym đi khỏi màng, nhưng các lỗ đủ lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra đi qua được dễ dàng.  Phương pháp hóa học : liên kết cộng hóa trị và liên lết ion.  Phương pháp khâu mạch. Trong luận án này, các loại đầu dò sinh học enzym đã được cố định lên màng polyanilin biến tính bằng phương pháp hóa học (liên kết chéo – cross linkage) thông qua chất liên kết Glutaraldehít. 54 a. Cố định enzym Glucose oxidase (GOx) trên vi điện cực Lấy 5 μl dung dịch enzym GOx 1 U/l được pha trong đệm PBS 1x tiến hành nhỏ phủ (drip coating) lên bề mặt vi cực điện hóa tích hợp (có một trong các màng PANi- MWCNTs; PANi-Fe3O4-COOH; điện cực PANi-Fe3O4/Graphen), sau đó điện cực được ủ trong hơi bão hòa glutaraldehít 25 % trong 1 h, sau đó làm khô trong không khí ở nhiệt độ thường. Điện cực sau khi cố định enzym được rửa bằng dung dịch đệm PBS 1x (pH = 7 ) để loại bỏ glutaraldehít dư và các enzym không được cố định vào màng. Vi điện cực điện hóa sau khi cố định enzyme được bảo quản trong dung dịch đệm PBS 1x (pH = 7) ở 4 0C [44-45, 78-79]. b. Cố định enzym Cholesterol Oxidase (ChOx) trên vi điện cực Vi điện cực điện hóa có phủ màng nanocomposite PANi/MWCNT-c hoặc PANi- Fe3O4-COOH hoặc PANi-Fe3O4/Graphen được ngâm trong K3[Fe(CN)6] 0,1 M trong 24 h. Ta lấy 5 μl dung dịch ChOx 24 U/ml (được pha trong đệm PBS 1x tiến hành nhỏ phủ (drip coating)) lên bề mặt màng và ủ trong dung dịch glutaraldehít 25 % trong 1 h. Sau đó, rồi làm khô trong không khí ở nhiệt độ thường. Điện cực sau khi cố định enzyme ChOx được rửa bằng dung dịch đệm PBS 1x (pH = 7) để loại bỏ glutaraldehít dư và các enzym không được cố định. Bảo quản điện cực trong dung dịch đệm PBS 1x ở 4 0C [77, 79]. Phản ứng cố định enzym Cholesterol oxidase lên bề mặt vi điện cực điện hóa được biểu diễn trong Hình II.14 dưới đây. Hình II.14. Cố định enzym qua liên kết chéo sử dụng tác nhân glutaraldehít [77] III.1.2 Cố định phần tử sinh học aptamer lên màng PANi biến tính Aptamer là phân tử ADN hay ARN tái tổ hợp, có cấu trúc đặc biệt, có khả năng gắn kết với các phân tử đích có kích thước khác nhau (protein, tế bào ung thư, phân tử nhỏ hapten) [82]. Các aptamer đặc hiệu với phân tử đích nhận được bằng chu 55 trình chọn lọc in vitro trên phân tử đích có tên gọi SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) [83]. So với các kháng thể đơn dòng thì các phân tử aptamer có các ưu điểm sau: i) phân tử nhỏ hơn kháng thể; ii) khả năng nhận biết phân tử đích tương đương hoặc hơn kháng thể; iii) chế tạo đơn giản, nhanh, hiệu quả, vượt trội so với phương pháp chế tạo kháng thể; iv) độ bền với các tác nhân hóa, lý, môi trường cao hơn kháng thể. Vì vậy aptamer là một trong những hướng nghiên cứu mới của công nghệ gen, có thể áp dụng trong cả chẩn đoán (chế tạo cảm biến) và điều trị miễn dịch. Hình II.16 Sàng lọc aptamer đặc hiệu theo chu trình SELEX a. Cố định aptamer của HPV Trong luận án này, aptamer đặc hiệu của virút HPV–16–L1 đã được cố định lên điện cực điện hóa có phủ màng PANi/MWCNTs. Việc cố định phần tử đầu dò sinh học (như là aptamer) là bước quyết định trong việc chế tạo cảm biến sinh học điện hóa. Aptamer HPV–16–L1 là một chuỗi peptide nhỏ (với MW = 1825 Da) vì vậy có thể cố định mà không quá quan trọng với việc bảo vệ bề mặt điện cực. Chúng ta có thể tiến hành gắn peptide aptamer lên bề mặt cảm biến với nồng độ thấp [48]. 56 Để cố định phân tử HPV-16-L1 lên bề mặt vi điện cực, ta pha dung dịch chứa 0,15 mM EDC và 0,3 mM NHS pha trong nước khử ion. Sau đó, ta thêm 50 nM aptamer HPV-16-L1 vào dung dịch. Nồng độ 50 nmol/L là nồng độ thường được sự dụng trong các thí nghiệm phổ quang kế; nồng độ HPV–16–L1 này đảm bảo cho phản ứng miễn dịch giữa HPV–16–L1 và kháng HPV có hiệu quả hoàn toàn. 0,1 nmol/L HPV–16–L1 sẽ sinh ra các tín hiệu SWV không đáng kể sau khi gắn. Điện cực PANi/MWCNT-c được ngâm trong dung dịch trong 2 h (tại nhiệt độ 37 0C, có khuấy đều). Sau đó, điện cực được rửa trong nước khử ion trong 30 phút, tại nhiệt độ 37 0C có khuấy đều để loại bỏ các phân tử aptame dư khỏi bề mặt điện cực. b. Cố định aptamer Anti-Aflatoxin M1 Dung dịch Aptamer Aflatoxin M1 (APT) nồng độ 180 pM được nhỏ lên điện cực Pt/PANi/Fe3O4, sau đó màng được ủ trong hơi bão hòa glutaraldehít trong 1 h tại nhiệt độ phòng. Cuối cùng, điện cực được rửa bằng nước DI nhằm loại bỏ các liên kết không đặc hiệu. Điện cực được bảo quản trong nước DI tại 4 0C [36]. III.1.3 Cố định kháng thể Atrazin Kháng thể đơn dòng Anti-Atrazin (-ATZ) (Mw = 150 kDa) được cố định lên bề mặt điện cực PANi/Gr bằng kỹ thuật liên kết chéo sử dụng Glutraldehyde như sau: - Pha chế dung dịch -ATZ có nồng độ 10-6 bM trong dung môi nước khử ion có chứa BSA (tỷ lệ -ATZ:BSA là 1:2) - Nhỏ 1 l dung dịch -ATZ lên bề mặt vi điện cực Pt/PANi/Graphen - Ủ vi điện cực trong môi trường hơi bão hòa của Glutaraldehít trong 1 h. - Sau đó, vi điện cực được rửa sạch bằng dung dịch PBS 1x để rửa trôi các phân tử kháng thể không liên kết, điện cực được làm khô bằng N2 và bảo quản trong dung dịch PBS 1x tại 4 0C. III.2 Cố định phần tử sinh học enzym trên màng PDAN biến tính - Pha chế dung dịch tổ hợp 2 enzym trong dung dịch PBS 1x: 10 mg enzym - Galactosidase và 90 mg enzym Glucose oxidase được pha trong 1 ml dung dịch PBS 1x. 57 - Nhỏ giọt 10 l dung dịch enzym lên bề mặt vi điện cực làm việc Pt/Gr/P(1,5- DAN), ủ trong môi trường hơi bão hòa Glutaraldehít trong 1 h, rửa sạch bằng dung dịch PBS 1x. Điện cực được để khô 12 h trong môi trường khô tại 4 0C, trước khi sử dụng [84]. IV. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐIỆN HÓA Trong luận án này, chúng tôi đã sử dụng nhiều phương pháp phân tích điện hóa khác nhau để khảo sát tính chất của màng compozít (trên cơ sở polyaniline và polydiaminonaphthalen) và xác định hàm lượng chất cần phân tích trong dung dịch như: Vôn-Ampe tuần hoàn, xung sóng vuông, đo dòng, phổ tổng trở điện hóa. Các thực nghiệm điện hóa được thực hiện trên thiết bị điện hóa đa năng Autolab PGS/TAT 30 (Ecochimie, Hà Lan) tại Viện Khoa học vật liệu (VAST), Viện Kỹ thuật nhiệt đới (VAST), Trung tâm CETASD (Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội). IV.1 Phương pháp Vôn-Ampe tuần hoàn (CV – Cyclic Voltammetry) Trong luận án này, phương pháp Vôn-Ampe tuần hoàn được sử dụng để khảo sát tính chất điện hóa của các màng compozít (PANi và PDAN) trong quá trình chế tạo cảm biến. - Với màng compozít trên cơ sở polyanilin: phổ CV của màng thường được quét trong khoảng từ -0,8 ÷ +0,8V (có thể thay đổi theo cấu trúc vật liệu bề mặt màng), tốc độ quét 50 mV/s, bước thế là 10 mV trong dung dịch PBS hoặc HCl 0,1 M. Cảm biến enzym ban đầu được quét trong dung dịch PBS 50 mM, sau đó cơ chất là glucose hoặc cholesterol tương ứng với cảm biến GOx hoặc ChOx được thêm vào bình điện hóa, khuấy trong 10 s. Quan sát sự thay đổi giữa các vòng quét và ghi lại khi các vòng quét tương đối ổn định. - Với màng compozít trên cơ sở polydiaminonapthalen: phổ CV của màng thường được quét trong dải thế từ dải thế -0,02 ÷ +0,95 V, tốc độ quét 50 mV/s, bước quét 10 mV trong dung dịch PBS 1x. Cảm biến enzym ban đầu được quét trong dung dịch PBS 50 mM, sau đó cơ chất là glucôzơ hoặc cholesterol tương ứng với 58 cảm biến GOx hoặc ChOx được thêm vào bình điện hóa, khuấy trong 10 s. Quan sát sự thay đổi giữa các vòng quét và ghi lại khi các vòng quét tương đối ổn định. IV.2 Phương pháp đo dòng thời gian thực (Chronoamperometric) Trong thực nghiệm của luận án, phương pháp đo dòng thời gian thực (Chronoamprometric) được sử dụng trong phân tích định lượng Glucôzơ, Cholesterol hoặc Lactôzơ như sau: - Phân tích định lượng glucôzơ: điện áp đặt vào là +0,7 V, bình điện phân là 10 ml dung dịch PBS 50 mM, dung dịch glucôzơ (nồng độ chuẩn trước) được thêm liên tiếp (injection) vào trong bình điện phân (sau khi cường độ dòng đạt được 95 % giá trị cân bằng). Đồ thị mô tả mối tương quan giữa đáp ứng dòng và thời gian được ghi lại liên tục trên máy. - Phân tích định lượng cholesterol: điện áp được đặt vào hệ điện hóa là -0,3 V, bình điện phân là 5 ml dung dịch PBS 50 mM, dung dịch cholesterol (nồng độ chuẩn trước) được thêm liên tiếp (injection) vào trong bình điện phân (sau khi cường độ dòng đạt được 95 % giá trị cân bằng). - Xác định hàm lượng D-lactôzơ bằng phương pháp đo dòng (Chronoamperometric) của cảm biến sinh điện hóa Pt/Gr/PDAN: thêm liên tục các nồng độ D-lactôzơ vào dung dịch, đo dòng đáp ứng ra với điện thế áp là +0,55 V hoặc +0,4 V (sau khi cường độ dòng đạt được 95 % giá trị cân bằng). IV.3 Phương pháp xung sóng vuông (SWV – Square Wave Voltammetry) Kỹ thuật xung sóng vuông (SWV) là kỹ thuật phân tích điện hóa rất phù hợp để nghiên cứu và đánh giá các liên kết sinh học của cảm biến sinh học điện hóa sử dụng phản ứng miễn dịch [85]. Trong luận án này, dòng điện hóa được đo bằng cả xung dương và xung âm của phổ điện hóa, và dòng ra là hiệu số của đỉnh ô xi hóa và đỉnh khử; do đó mật độ dòng lớn hơn rất nhiều so với phương pháp Vôn-Ampe vòng. Bên cạnh đó, dòng điện dung (tụ điện) cũng được loại trừ do sự giảm của ôxy hòa tan; chúng tôi sử dụng sự giảm tín hiệu của xung sóng vuông SWV để xác định sự tạo phức của phản ứng miễn dịch giữa phân tử dò sinh học (kháng thể ATZ, aptamer...) 59 và chất cần phân tích (Atrazin, Aflatoxin M1...), từ đó, nồng độ của chất cần phần tích sẽ được nhận biết tương ứng với độ suy giảm tín hiệu điện hóa. - Quét xung sóng vuông (SWV) của cảm biến trong dung dịch (có chứa các nồng độ của chất cần phân tích): tần số xung 12,5 Hz, biên độ xung 25 mV, thế bắt đầu là -0,6 V, thế kết thúc +0,75 V, bước thế 10 mV. - Sau mỗi lần quét xung sóng vuông, cảm biến được rửa bằng nước khử ion và làm khô bằng dòng khí N2. IV.4 Phương pháp phổ tổng trở điện hóa Nguyên tắc của phương pháp phổ tổng trở là đưa vào hệ điện hóa 1 tín hiệu nhỏ tuần hoàn hình sin nên hệ điện hóa luôn được giữ ở trạng thái cân bằng. Do đó ưu điểm nổi bật của phương pháp này là độ ổn định cao, cho phép phân tích không chỉ tổng toàn bộ quá trình điện hóa mà cả các hoạt động điện hóa riêng rẽ xảy ra trong hệ nghiên cứu [86]. Trong luận án này, chúng tôi sử dụng phương pháp phổ tổng trở điện hóa để nghiên cứu – đánh giá đặc tính điện hóa của cảm biến GOx và ChOx. - Nghiên cứu phổ tổng trở của cảm biến GOx được tiến hành trong dung dịch đệm PBS 50 mM (pH = 7 có chứa NaCl 0,9 %) tại điện thế +0,7 V. Dòng xoay chiều (amplitude) đặt vào có biên độ Uo = 5 mV, tần số biến thiên f = 0,01 tới 105 Hz. - Nghiên cứu phổ tổng trở của cảm biến ChOx được tiến hành trong dung dịch đệm PBS 50 mM (pH = 7 có chứa NaCl 0,9 %) tại điện thế -0,3 V. Dòng xoay chiều (amplitude) đặt vào có biên độ Uo = 5 mV, tần số biến thiên f = 0,01÷ 105 Hz. Trong thực nghiệm phân tích điện hóa, các kết quả đều được ghi lại và lưu trữ bằng phần mềm GPES 4.9 và được xử lý bằng phần mềm Origin. 8.0. V. CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BỀ MẶT VÀ CẤU TRÚC MÀNG Trong luận án này, chúng tôi sử dụng các kỹ thuật phân tích bề mặt và cấu trúc để khảo sát hình thái bề mặt (chiều dày, độ rỗng, xốp) của các màng vật liệu trên bề mặt vi điện cực như: - Phân tích hình thái bề mặt bằng kỹ thuật hiển vi điện tử quét (FESEM) trên thiết bị kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FESEM S4800, Hitachi, Nhật Bản) 60 tại Viện Khoa học vật liệu. Thiết bị có độ phóng đại đến 100.000 lần, độ phân giải ~ vài nm. - Khảo sát hình thái bề mặt màng compozít, màng graphene bẳng kỹ thuật hiển vi lực nguyên tử (AFM) trên thiết bị hiển vi đầu dò nguyên tử (SPM, Aligent, Mỹ ) tại Viện Khoa học vật liệu. Thiết bị có độ phân giải ~ 1 nm, có khả năng đo nhiều thông số bề mặt khác nhau: độ dày màng, độ mấp mô bề mặt màng, kích thước màng - Các liên kết hóa học của màng compozít (pha tạp hạt nano Fe3O4 và ống CNTs) được khảo sát bằng phổ hấp thụ hồng ngoại (FTIR) trên thiết bị FTIR-6700 (Nicolet, Mỹ) tại Viện Kỹ thuật nhiệt đới theo phương pháp ép viên với KBr. Dải số sóng là 400 – 4000 cm-1 với độ phân giải 4 cm-1. - Cấu trúc bề mặt màng compozít biến tính bằng graphen được khảo sát bằng phổ Raman trên thiết bị LabRAM (Horiba, Nhật Bản) sử dụng nguồn phát laze He- Ne với bước sóng 623.8 nm. - Cấu trúc màng graphen được đánh giá bằng ảnh hiển vi điện tử truyền qua trên thiết bị kính hiển vi điện tử truyền qua phân giải cao (HRTEM, FEI TECNAI G20, Hàn Quốc) với độ phân giải ~ 0,14 nm và độ phóng đại đến 500.000 lần. VI. KẾT LUẬN Quy trình thực nghiệm nghiên cứu – chế tạo cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở vật liệu polyme dẫn (PANi, PDAN) được biến tính bởi các vật liệu cấu trúc nano đã được trình bày chi tiết trong chương này. Các cảm biến sinh học điện hóa đã được chế tạo thành công bằng cách kết hợp nhiều công nghệ và kỹ thuật chế tạo khác nhau từ công nghệ Vi điện tử, công nghệ Vi cơ điện tử (MEMS), kỹ thuật lắng đọng màng mỏng, phương pháp tổng hợp điện hóa màng polyme dẫn: - Các hệ vi điện cực điện hóa tích hợp (gồm 3 điện cực trên cùng 1 chíp: điện cực làm việc và điện cực đối là Pt, điện cực so sánh là Ag/AgCl) đã được chế tạo thành công bằng công nghệ Vi điện tử và Công nghệ Vi cơ điện tử. Điện cực làm việc có thể thay đổi đường kính từ 100 – 500 m. 61 - Màng compozít trên cơ sở vật liệu polyme dẫn (PANi, PDAN) biến tính các vật liệu nano (CNT, Fe3O4, Graphen) đã được tổng hợp điện hóa thành công trên bề mặt vi điện cực điện hóa tích hợp. - Chúng tôi đã sử dụng các phương pháp phân tích điện hóa hiện đại để khảo sát tính chất điện hóa màng polyme dẫn biến tính và xác định hàm lượng các chất cần phân tích như: phương pháp CV, phương pháp SWV, phương pháp đo dòng, phổ tổng trở điện hóa. - Tính chất và hình thái bề mặt của vật liệu và màng polyme dẫn biến tính được nghiên cứu khảo sát bằng các phương pháp phân tích: FESEM, TEM, AFM, FTIR và Raman.. Các kết quả về tính chất và ứng dụng cảm biến sinh học điện hóa sẽ được trình bày trong các chương sau. 62 CHƯƠNG III: NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VI CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ VẬT LIỆU POLYME DẪN Trong chương này, các kết quả về chế tạo và phát triển vi cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở biến tính – pha tạp các loại màng polyme dẫn (polyanilin, poly(1,5- diaminonapthalen) sẽ được trình bày và thảo luận. I. PHÁT TRIỂN VI CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ POLYME DẪN - POLYANILIN I.1. Pha tạp màng PANi bằng ống nano cácbon (CNTs)  Tổng hợp điện hóa màng PANi pha tạp MWCNTs Phổ tổng hợp điện hóa của màng PANi pha tạp MWCNTs được trình bày trong Hình III.1 dưới đây. Hình III.1. Phổ tổng hợp điện hóa theo phương pháp CV của màng PANi/MWCNTs trên điện cực tích hợp Từ Hình III.1, ta thấy các cặp đỉnh ôxy hóa-khử đặc trưng của polyanilin được thể hiện đầy đủ trong từng chu kỳ (tại các điện thế oxi hóa là : +0,2 V, +0,4 V và +0,7 V). Điều đó, chứng tỏ màng polyme được trùng hợp trên bề mặt điện cực Pt là polyanilin. Các cặp đỉnh này tương ứng với sự chuyển dạng từ Leucoemeraldin 63 thành muối Emeraldin, từ dạng muối Emeraldin thành dạng bazơ Emeraldin và cuối cùng là chuyển dạng Pernigranilin. Dạng cuối cùng của màng polyaniline trên bề mặt điện cực là muối Emeraldin, đây là dạng dẫn tốt của polyanilin. Hình III.2. Phổ tổng hợp điện hóa theo phương pháp CV của màng PANi (a) và màng PANi/MWCNTs (b) tại chu kỳ thứ 20 trên điện cực tích hợp Phổ CV thu được trong cả hai trường hợp được trình bày trên hình II.2 có hình dáng tương tự như nhau, đây chính là phổ CV đặc trưng của quá trình tổng hợp điện hóa màng PANi. Tuy nhiên một điều rất lý thú là cường độ dòng điện thu được của màng PANi/MWCNTs lớn hơn cỡ gần 10 lần so với màng PANi thuần. Như vậy với sự pha tạp MWCNT trong màng có thể đã làm tăng : (i) độ dẫn điện của màng và/hoặc (ii) bề mặt tiếp xúc giữa màng với dung dịch chứa monome. Với độ dẫn cao, quá trình tổng hợp điện hóa vẫn tiếp diễn ngay cả khi PANi đã phủ kín bề mặt Pt. Ảnh chụp điện cực có màng PANi/MWCNTs được đưa ra tại hình III.3 dưới đây. a b 64 Hình III.3. Ảnh chụp vi điện cực tích hợp có/không có màng PANi/MWCNTs Từ hình III.3, ta quan sát thấy: chíp trắng (bên phải) không được phủ màng polyme dẫn và màng PANi/MWCNTs (màu xanh-đen) đã được tổng hợp thành công trên bề mặt vi điện cực làm việc của chíp (bên trái), các vi điện cực đối và so sánh không có màng trên bề mặt (chế tạo bằng công nghệ vi điện tử - đã trình bày trong Chương II)..  Hình thái bề mặt của màng PANi/MWCNTs bằng ảnh FESEM Hình thái bề mặt của ống MWCNTs, màng PANi thuần và màng PANi/MWCNTs được khảo sát bằng FESEM, được thể hiện trong hình III.4 dưới đây. Dựa trên kết quả chụp FE-SEM (Hình III.4 a,b) có thể thấy MWCNTs thể hiện rõ cấu trúc dạng ống, đường kính ống khá đồng đều khoảng 80 ÷ 100 nm. Kết quả chụp ảnh FE-SEM màng PANi và màng PANi/MWCNTs tổng hợp theo phương pháp CV trong cùng điều kiện cho thấy có sự khác biệt về mặt hình thái học. Màng PANi thuần có kích thước sợi lớn hơn, cấu trúc đặc hơn (Hình III.4 c,d). Sự có mặt của MWCNT-COOH trong quá trình tổng hợp đã được pha tạp (doping) vào mạng lưới PANi (hình III.4 e,f). Màng PANi/MWCNTs có cấu trúc một chiều dạng sợi rõ rệt hơn, đường kính các sợi vào khoảng từ 100 ÷ 120 nm và được phân bố đều trên toàn bộ điện cực, màng có cấu trúc rỗng hơn so với PANi thuần. Cấu trúc này có thể tạo cho vật liệu có bề mặt riêng lớn hơn nhiều so với màng PANi thuần, điều này cho thấy khả năng màng PANi/MWCNTs có thể cố định được nhiều phần tử Màng PANi/MWCNTs 65 sinh học hơn, có thể mở rộng được giới hạn đo, giảm thời gian đáp ứng cho cảm biến sinh học. Hình ảnh của MWCNTs với a) độ phóng đại 11.000 lần và b) độ phóng đại 50.000 lần Hình ảnh màng PANi tổng hợp theo phương pháp CV với (c) độ phóng đại 10.000 lần và (d) độ phóng đại 100.000 lần Ảnh FE-SEM màng PANi/MWCNTs tổng hợp theo phương pháp CV với (e) độ phóng đại 10.000 lần và (f) độ phóng đại 50.000 lần Hình III.4. Ảnh FESEM của ống MWCNTs, màng PANi thuần và màng PANi/MWCNTs a b c d e f 66 Với kết quả phổ tổng hợp điện hóa và so sánh hình thái học bề mặt như trên, ta có thể thấy rằng sự có mặt của MWCNTs trong dung dịch trùng hợp không chỉ hỗ trợ cho quá trình tổng hợp điện hóa mà còn tạo ra màng vật liệu có cấu trúc rỗng (độ xốp) cao hơn. Hình III.5. Ảnh FESEM của phóng đại cấu trúc bề mặt PANi/MWCNTs Hình ảnh phóng đại (hình III.5) trên một sợi PANi/MWCNTs có thể thấy cấu trúc dạng hoa lơ của vật liệu, hình thái học này rất thuận lợi cho việc cố định các phần tử sinh học nói chung và enzym hoặc DNA nói riêng.  Phân tích hình thái bề mặt màng PANi/MWCNTs bằng ảnh AFM Hình thái học màng PANi/MWCNTs quan sát được bằng phương pháp hiển vi lực nguyên tử AFM (Atomic Force Microscopy) (trên thiết bị SPM, Agilent, USA) được thể hiện trong Hình III.6. Kết quả cho thấy màng PANi/MWCNTs (bên phải) có chiều dày vào khoảng 500 nm và có ranh giới rõ ràng giữa màng PANi và màng PANi/MWCNTs. Điều đó chứng tỏ màng PANi/MWCNTs đã được tổng hợp trên điện cực. Bề mặt màng PANi/MWCNTs có độ mấp mô bề mặt (roughness) (~150 nm) lớn hơn hẳn so với màng PANi (~50 nm), tương tự như kết quả thu được với kết quả phân tích FESEM. Như vậy, việc pha tạp ống nano cácbon (MWCNTs) làm cho diện tích hiệu dụng bề mặt của màng sẽ lớn hơn, khả năng bắt cặp các phần tử sinh học sẽ lớn hơn và độ nhạy của cảm biến, dải đo của cảm biến sẽ được cải thiện [48]. 67 Hình III.6. Ảnh AFM của màng PANi và màng PANi/MWCNTs  Phổ hấp thụ hồng ngoại của màng PANi/MWCNTs Hình III.7. Phổ hấp thụ hồng ngoại FTIR của màng PANi và màng PANi/MWCNTs Trên phổ hồng ngoại của PANi (thể hiện trong Hình III.7), ta thấy xuất hiện vân phổ tại số sóng 1635 cm-1 và 1498 cm-1 có cường độ trung bình. Đây là các vân đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết cácbon-cácbon (dao động khung) trong nhân thơm. Tại số sóng 3455 cm-1, xuất hiện một vân hấp thụ mạnh đặc trưng cho dao PANi/MWCNTs PANi 68 động hóa trị của liên kết NH. Thêm vào đó, tại số sóng 1149 cm-1, phổ có một vân với cường độ mạnh là đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết CN. Với phổ hồng ngoại của màng PANi/MWCNTs, các vân phổ đặc trưng cho PANi tại các số sóng 3455 cm-1, 1635 cm-1, 1498 cm-1 và 1149 cm-1 vẫn quan sát thấy. Tuy nhiên, trên phổ hồng ngoại của màng PANi/MWCNTs xuất hiện thêm vân tại số sóng 2923 cm-1 của CNTs và vân tại số sóng 1735 cm-1, đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C=O trong nhóm -COOH là nhóm chức năng hóa của ống nano cácbon [48]. Với các kết quả phân tích phổ FTIR như trên, ta có thể khẳng định rằng MWCNTs-COOH đã được pha tạp thành công vào màng PANi bằng phương pháp tổng hợp điện hóa. Từ các kết quả trên, chúng tôi đề xuất cơ chế của quá trình pha tạp MWCNTs-COOH vào màng PANi như sơ đồ Hình III.8 dưới đây. Hình III.8. Sơ đồ hình thành liên kết giữa màng PANi dạng ES với MWCNTs thông qua các liên kết: (a) π-stacking (xếp lớp liên kết π của vòng thơm), (b) liên kết ion và (c)liên kết Hiđrô 69 Các phân tử PANi (dạng ES) liên kết với ống nano cacbon đã chức năng hóa thông qua ba kiểu liên kết. Thứ nhất là kiểu xếp lớp liên kết π (π-stacking) của các vòng thơm của PANi và MWCNTs-COOH; thứ hai là liên kết ion tạo ra giữa ion COO- của MWCNTs-COOH và NH+ của PANi và thứ ba là liên kết hiđrô H-O---H- N. Ba loại liên kết này giúp cho MWCNTs-COOH được pha tạp vào PANi để tăng độ dẫn cho màng polyme. I.2. Pha tạp màng PANi bằng hạt nano Fe3O4  Tổng hợp điện hóa màng PANi-Fe3O4 Phổ tổng hợp điện hóa của màng PANi pha tạp Fe3O4 được thể hiện trong Hình III.9 dưới đây. -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -600 -400 -200 0 200 400 600 800 1000 I / A E /V vs. Ag/AgCl Hình III.9: Phổ tổng hợp điện hóa CV của màng PANi pha tạp Fe3O4 Từ Hình III.9, ta thấy màng PANi pha tạp Fe3O4 được tổng hợp thành công, các cặp đỉnh điện hóa đặc trưng của PANi xuất hiện đầy đủ, rõ ràng trên phổ tổng hợp. Cường độ dòng lớn (đạt ~ 1000 A tại chu kỳ 20 của quá trình tổng hợp) chứng tỏ màng có độ dẫn lớn và độ hoạt động điện hóa lớn. Khi so sánh cường độ dòng của quá trình tổng hợp điện hóa màng PANi pha tạp Fe3O4 với màng PANi thuần, ta thu được kết quả như trong Hình III.10 dưới đây. 70 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -800 -600 -400 -200 0 200 400 600 800 1000 I / A E /V vs. Ag/AgCl Fe3O4/PANi PANi Hình III.10. So sánh phổ tổng hợp điện hóa tại chu kỳ 20 của màng PANi- Fe3O4 và PANi Từ hình III.10, ta thấy sự tăng cường độ dòng điện hóa của màng PANi pha tạp Fe3O4 (đường liền nét) khi so sánh với màng PANi (đường đứt nét); điều đó có nghĩa là hạt nano Fe3O4 có thể đã làm tăng cường độ dòng của màng PANi trong cùng điều kiện thực nghiệm (thiết kế của điện cực và tính chất màng PANi như nhau), chứng tỏ sự pha tạp Fe3O4 vào màng PANi làm tăng độ hoạt động điện hóa hoặc bề mặt tiếp xúc giữa màng với dung dịch chứa monome; điều đó dẫn đến việc tăng khả năng truyền điện tử trong cấu hình của vi cảm biến điện hóa.  Phổ hấp thụ hồng ngoại của PANi-Fe3O4 Phổ hấp thụ hồng ngoại FTIR của màng PANi-Fe3O4 được khảo sát trên thiết bị 6700 FT-IR Spectrometer (Nicolet) sử dụng viên KBr trong dải phổ từ 400 ÷ 4000 cm-1, với độ phân giải là 4 cm-1 (như biểu diễn trong Hình III.11 dưới đây). Trên phổ hồng ngoại của PANi xuất hiện dao động tại số sóng 1120 cm-1 và 1296 cm-1 có một vân với cường độ mạnh là đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C-N. Các vân hấp thụ ở số sóng 1490 cm-1 và 1537 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị củ