Luận án Nghiên cứu đa hình / đột biến gen cyp2c9, cyp2c19, cyp3a5 và cyp2d6 cytochrome p450 ở ngườ i kinh Việt Nam

LỜI CAM ĐOAN.i

LỜI CẢM ƠN .ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN.vii

DANH MỤC BẢNG .ix

DANH MỤC HÌNH .x

MỞ ĐẦU .1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .4

1.1. CYP450 và chuyển hóa thuốc trong gan .4

1.2. Đa dạng di truyền các gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa

thuốc. .6

1.2.1. Gen CYP2C9 .7

1.2.2. Gen CYP2C19 . 11

1.2.3. Gen CYP2D6 . 14

1.2.4. Gen CYP3A5. 17

1.3. Ảnh hưởng của đa dạng di truyền các gen dược học đối với các ADR và sự khác

biệt trong đáp ứng thuốc . 20

1.3.1. Khái quát về các ADR . 20

1.3.2. Một số trường hợp đa dạng di truyền các gen dược học gây nên khác biệt trong

đáp ứng thuốc. 22

1.4. Ứng dụng và triển vọng của di truyền dược học trong lâm sàng. 29

1.5. Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền của các gen CYP450 . 32

1.5.1. Các phương pháp nghiên cứu SNP và indel . 32

1.5.2. Các phương pháp nghiên cứu CNV. 34

1.6. Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền một số gen CYP450 trên người Việt Nam

và phạm vi nghiên cứu của luận án. 37

1.6.1. Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền của các gen CYP450 tại Việt Nam và

trên thế giới . 37

pdf169 trang | Chia sẻ: honganh20 | Ngày: 03/03/2022 | Lượt xem: 71 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu đa hình / đột biến gen cyp2c9, cyp2c19, cyp3a5 và cyp2d6 cytochrome p450 ở ngườ i kinh Việt Nam, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ược chứng minh bằng thực nghiệm. Ngoài ra các trình tự liên ứng và gen điều hòa cũng có trong cơ sở dữ liệu này. 55 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số sau khi tách chiết từ máu ngoại vi được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di cho thấy hầu hết sản phẩm DNA tổng số sau khi tách chiết có các dải băng rõ ràng và sáng tập trung ở khu vực có kích thước DNA khoảng 20 kb trên bản gel. Như vậy sản phẩm DNA tổng số thu được không bị đứt gãy và có độ tinh sạch cao, đảm bảo yêu cầu về chất lượng cho các bước sàng lọc gen tiếp theo. Nồng độ DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu thu được nằm trong khoảng từ 19,4 đến 139,6 ng/µl. Kết quả tách chiết DNA tổng số của một số mẫu được minh họa ở Hình 3.1 và nồng độ DNA được thể hiện chi tiết ở phụ lục 1. Hình 3.1. Điện di đồ 9 mẫu DNA tổng số M: Thang DNA chuẩn. Các giếng 1-8: DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu 3.2. Khuếch đại đặc hiệu các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A5 và giải trình tự Sử dụng các cặp mồi được thiết kế và tham khảo đã được trình bày chi tiết trong phương pháp nghiên cứu, nghiên cứu này đã tiến hành khuếch đại các vùng gen quan tâm của 4 gen nghiên cứu. Chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR để khuếch đại đặc hiệu vùng promoter, toàn bộ 9 exon và vùng biên của 2 gen CYP2C9 và CYP2C19 của 100 mẫu nghiên cứu (40 nam, 60 nữ). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agrose 1%. 56 Hình ảnh điện di cho thấy đã khuếch đại thành công trình tự đặc hiệu cho tất cả các mẫu, kích thước băng điện di phù hợp với tính toán lý thuyết của CYP2C9 (Hình 3.2) và CYP2C19 (Hình 3.3). Cụ thể, kích thước theo dự đoán lí thuyết của các đoạn gen CYP2C9 là: Promoter-Exon 1 (1165 bp), Exon 2-Exon 3 (794 bp), Exon 4 (440 bp), Exon 5 (537 bp), Exon 6 (483 bp), Exon 7 (722 bp), Exon 8 (362 bp) và Exon 9 (1116 bp). Đối với CYP2C19, kích thước dự đoán lí thuyết của các đoạn gen là: Promoter (776 bp), Exon 1 (600 bp), Exon 2-3 (845 bp), Exon 4 (619 bp), Exon 5 (541 bp), Exon 6 (709 bp), Exon 7 (615 bp), Exon 8 (506 bp) và Exon 9 (1032 bp). Các băng điện di sáng, gọn và không có sản phẩm phụ, thể hiện độ đặc hiệu của phản ứng. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch theo quy trình để sử dụng cho các phản ứng giải trình tự tiếp theo. Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2C9 của 8 mẫu nghiên cứu M: Thang DNA chuẩn. Các giếng 1-8: Sản phẩm PCR các vùng promoter-exon 1 (a), exon 2-exon 3 (b), exon 4 (c), exon 5 (d), exon 6 (e), exon 7 (f), exon 8 (g) và exon 9 (h). 57 Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2C19 của 8 mẫu nghiên cứu M: Thang DNA chuẩn. Các giếng 1-8: Sản phẩm PCR các vùng promoter(a), exon 1 (b), exon 2-exon 3 (c), exon 4 (d), exon 5 (e), exon 6 (f), exon 7 (g) exon 8 (h) và exon 9 (i). Đối với gen CYP2D6, phản ứng PCR được tiến hành để khuếch đại đặc hiệu vùng promoter, toàn bộ 9 exon và vùng biên của gen CYP2D6 của136 mẫu nghiên cứu (55 nam, 81 nữ). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agrose 1%. Hình ảnh điện di cho thấy chúng tôi đã khuếch đại thành công trình tự đặc hiệu cho tất cả các mẫu, kích thước băng điện di phù hợp với tính toán lý thuyết (Hình 3.4). Các kích thước sản phẩm PCR theo dự đoán lí thuyết lần lượt là: Promoter-Exon 2 (2080 bp), Exon 3-4 (801 bp), Exon 5-8 (1889 bp), Exon 8-9 (853 bp). Các băng điện di đều không thể hiện có sản phẩm phụ, cho thấy phản ứng đã khuếch đại đặc hiệu vùng gen quan tâm. Các sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch để sử dụng cho các phản ứng giải trình tự tiếp theo. 58 Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2D6 của 5 mẫu nghiên cứu M: Thang DNA chuẩn. Các giếng 1-5: Sản phẩm PCR các vùng promoter-exon 2 (a), exon3-exon 4 (b), exon 5-exon 8 (c) và exon 8-exon 9 (d). Đối với gen CYP3A5, phản ứng PCR được tiến hành để khuếch đại đặc hiệu các vùng gen này mang các biến thể *3, *6, *8 và *9 của tổng số 100 mẫu nghiên cứu (40 nam, 60 nữ). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agrose 1%. Hình ảnh điện di cho thấy đã khuếch đại thành công vùng gen mang các biến thể quan tâm và đoạn khuếch đại là đặc hiệu cho tất cả các mẫu, kích thước băng điện di phù hợp với tính toán lý thuyết: CYP3A5*3 (503 bp), CYP3A5*6 (578 bp), CYP3A5*8 (476 bp), CYP3A5*9 (680 bp). Một số hình ảnh điện di các mẫu đại diện được thể hiện ở Hình 3.5. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch để sử dụng cho các phản ứng giải trình tự tiếp theo. Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP3A5 của 8 mẫu nghiên cứu M: Thang DNA chuẩn. Các giếng 1-8: Sản phẩm PCR các allele CYP3A5*3 (a), *6 (b), *8(c) và *9 (d). 59 3.3. Phân tích đa hình/đột biến các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở quần thể người Kinh Việt Nam Với mục đích phân tích đa hình/đột biến của của các gen CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6, vùng promoter cùng tất cả 9 exon và vùng biên của mỗi gen được giải trình tự trực tiếp. Đối với gen CYP3A5, các đoạn khuếch đại đặc hiệu chứa các allele *3, *6, *8 và *9 cũng được giải trình tự trực tiếp. Các dữ liệu sau khi giải trình tự được so sánh với trình tự tham chiếu của các gen tương ứng. Bên cạnh đó, CNV của 4 gen nói trên cũng được phân tích sử dụng phương pháp MLPA. Nghiên cứu này đã tiến hành giải trình tự thành công các vùng gen quan tâm cũng như phân tích CNV của các gen CYP2C9, CYP2C19 và CYP3A5 ở 100 mẫu. Đối với gen CYP2D6, đã thực hiện giải trình tự và phân tích CNV gen này ở 136 mẫu người Kinh Việt Nam. 3.3.1. Đa hình/đột biến của gen CYP2C9 *Các biến thể của CYP2C9 được xác định bằng phương pháp giải trình tự Đối với CYP2C9, có tổng số 14 biến thể đã được xác định trong 100 mẫu nghiên cứu (Bảng 3.1). Tất cả các biến thể đều được khảo sát ở 100 mẫu, trừ biến thể 33622T>C chỉ xác định được ở1/99 mẫu. Trong số các biến thể này, có 7 biến thể đã được công bố trên cơ sở dữ liệu PharmVar và 01 biến thể được công bố trong cơ sở dữ liệu 1000 Genomes. Đáng chú ý, có 6 biến thể mới của CYP2C9 chưa được công bố trên cả 3 cơ sở dữ liệu đa hình di truyền dược học, NCBI dbSNP và 1000 Genomes. Những biến thể mới này bao gồm 4 thay đổi đơn nucleotide trong intron 2 (3415C>T), intron 6 (33622T>C, 38658A>G) và intron 7 (42801A>G), 01 biến thể xóa nucleotide trong intron 8 (47543delT) và một biến thể thay thế đơn nucleotide trong exon 7 (42627C>A) (Hình 3.6). Đồng thời, nghiên cứu này không phát hiện được biến thể thêm nucleotide ở CYP2C9 trong tất cả 100 mẫu. Phân tích bằng phần mềm Haploview cho thấy có 13/14 biến thể của CYP2C9 đạt cân bằng Hardy-Weinberg (HWpval>0,05), ngoại trừ biến thể 251T>C (HWpval=0,0101) (Phụ lục 2). 60 Bảng 3.1. Các biến thể của CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam STT Vùng gen Vị trí SNP ID GenBank Thay đổi nucleotide Allele Ảnh hưởng Tần số (%) 1 Intron 1 251 - T>C # (1/100) 1 2 Exon 2 3235 - G>C Val76 (1/100) 1 3 Intron 2 3411 rs9332120 T>C # (1/100) 1 4 3415 Mới C>T # (1/100) 1 5 Intron 3 9032 rs9332127 G>C # (6/100) 6 6 Intron 4 10311 rs9332129 A>G # (6/100) 6 7 10376 rs201512316 T>C # (1/100) 1 8 Intron 6 33622 Mới T>C # (1/99) 1,01 9 38658 Mới A>G # (1/100) 1 10 Exon 7 42614 rs1057910 A>C *3 Ile359Leu (7/100) 7 11 42627 Mới C>A Pro363His (2/100) 2 12 Intron 7 42726 rs17847029 C>T # (6/100) 6 13 42801 Mới A>G # (1/100) 1 14 Intron 8 47543 Mới delT # (1/100) 1 # những biến đổi này không làm ảnh hưởng đến chức năng của protein. Vị trí của mỗi SNP được xác định bằng trình tự tham chiếu của CYP2C9: NG-008385.1 trên cơ sở dữ liệu NCBI. Các nucleotide được đánh số bắt đầu từ base A (+1) của mã mở đầu ATG trên gen. 61 Hình 3.6. Các biến thể mới trong vùng intron và exon của CYP2C9 Các biến thể mới được xác định trong vùng từ intron 2 đến intron 8 của CYP2C9, bao gồm 5 biến thể mới trong intron và 1 biến thể mới trong exon 7. a) 3415C>T (intron 2), b) 33622T>C (intron 6), c) 38658A>G (intron 6), e) 42801A>G (intron 7), f) 47543delT (intron 8), và d) 42627C>A (exon 7). Vị trí nucleotide bị thay đổi được đánh dấu bằng mũi tên. 62 * Xác định CNV của CYP2C9 bằng MLPA Khi tiến hành xác định các CNV của CYP2C9, có 3/100 mẫu nghiên cứu được xác định là mất 1 bản sao của gen này. Cụ thể, bộ kit MLPA thiết kế 5 đầu dò đặc hiệu cho các exon 1 (1 đầu dò), 7 (1 đầu dò), 8 (2 đầu dò) và 9 (1 đầu dò) của CYP2C9. Kết quả tỉ lệ sau chuẩn hóa bằng phần mềm Coffalyzer của 5 đầu dò thuộc 3 mẫu MVN 21, MVN 23, MVN 24 đều cho giá trị nằm trong khoảng từ 0,4-0,65 (Bảng 3.2). Những mẫu còn lại (97/100 mẫu) mang 2 bản sao CYP2C9 có kết quả tỉ lệ sau chuẩn hóa của 5 đầu dò nằm trong khoảng 0,8-1,2. Số liệu về tỉ lệ của các đầu dò sau chuẩn hóa của một số mẫu được thể hiện trong Bảng 3.2. Kết quả MLPA được trình bày trong Hình 3.7 dưới dạng biểu đồ sóng và sự phân bố của các giá trị tỉ lệ sau chuẩn hóa. Bảng 3.2. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP2C9 của một số mẫu nghiên cứu Tên mẫu Vị trí đầu dò của kit MLPA và các tỉ lệ sau chuẩn hóa (Final ratio) Exon 1 Exon 7 Exon 8 (1) Exon 8 (2) Exon 9 FVN 01 0,98 0,87 0,99 1,06 1,05 FVN 02 0,96 0,97 0,98 1,01 1,11 FVN 79 0,96 1,23 1,15 1,1 1,01 FVN 90 0,96 0,98 1,09 1 1,04 MVN 21 0,39 0,57 0,45 0,42 0,67 MVN 23 0,52 0,57 0,55 0,5 0,64 MVN 24 0,59 0,65 0,62 0,61 0,69 63 a) b) Hình 3.7. Kết quả MLPA xác định mất toàn bộ 01 bản sao của gen CYP2C9. a) Biểu đồ sóng, b) Phân bố các giá trị tỉ lệ sau chuẩn hóa. Mẫu MVN 23: mất toàn bộ 1 allele CYP2C9. Tỉ lệ số bản sao của các exon 1, 5, 8(1), 8(2) và 9 là 1:1:1:1. Vị trí các đầu dò trên CYP2C9 được thể hiện bằng các mũi tên màu đỏ. 64 Phương pháp real-time PCR sử dụng các mồi đặc hiệu cho exon 4 và exon 7 của CYP2C9 được thực hiện nhằm kiểm tra lại hiện tượng mất bản sao CYP2C9 ở 2 trong số 3 mẫu nói trên. Trong nghiên cứu này, mẫu đối chứng được sử dụng là các mẫu có 2 bản sao của CYP2C9 đã được xác định bằng phương pháp MLPA. Kết quả real- time PCR thu được tương đồng 100% với dữ liệu của MLPA (Hình 3.8). Mặt khác, hiện tượng tăng số bản sao và mất toàn bộ 2 allele của CYP2C9 không được xác định trong tất cả 100 mẫu nghiên cứu. Hình 3.8. Kết quả Real-time PCR kiểm tra mất số bản sao của CYP2C9 Các mồi được thiết kế đặc hiệu cho exon 4 và exon 7 của CYP2C9. REF-mẫu đối chứng có 2 bản sao CYP2C9, các mẫu MVN 21 và MVN 23 có 1 bản sao của CYP2C9. *Tần số kiểu gen và tần số allele của CYP2C9 ở quần thể người Kinh Từ các số liệu thu được bằng giải trình tự và phân tích MLPA, đã xác định được 3 kiểu gen của CYP2C9 trong 100 mẫu nghiên cứu. Trong đó, kiểu gen chiếm tần số lớn nhất là đồng hợp tử kiểu dại CYP2C9*1/*1 (90%) có hoạt tính enzyme bình thường. Hai kiểu gen ít phổ biến hơn là dị hợp tử CYP2C9*1/*3 (7%) có hoạt tính enzyme giảm (chuyển hóa thuốc trung bình) và CYP2C9*1/Del (mất 1 allele) với hoạt tính enzyme chưa rõ (Theo CPIC). Ngoài ra, nghiên cứu này không phát hiện được kiểu gen đồng hợp tử CYP2C9*3/*3 cũng như kiểu gen đồng hợp tử mất toàn 0 0.5 1 1.5 REF MVN 21 MVN 23 2 -Δ Δ C t Mẫu CYP2C9 qPCR Exon 4 Exon 7 65 bộ 2 allele (CYP2C9Del/Del) trong 100 mẫu nghiên cứu. Chi tiết các kiểu gen và tần số tương ứng được thể hiện ở Bảng 3.3. Từ đó, tổng số có 3 allele của CYP2C9 đã được xác định trong nghiên cứu này là CYP2C9*1, CYP2C9*3 và CYP2C9Del. Trong đó, *1 là allele kiểu dại và chiếm tỉ lệ cao nhất trong quần thể với 95%, *3 chiếm tỉ lệ thấp hơn với 3,5% và tỉ lệ thấp nhất là Del với 1,5% (Bảng 3.4). Ngoài ra, không xác định được sự tồn tại của allele CYP2C9*2 cũng như các allele khác đã được công bố của CYP2C9 trong 100 mẫu nghiên cứu. Bảng 3.3. Tần số kiểu gen CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam Kiểu gen Kiểu hình chuyển hóa thuốc (Theo CPIC) Tổng số (N=100) Tần số (%) *1/*1 EM 90 90 *1/*3 IM 7 7 *1/Del - 3 3 N: tổng số mẫu nghiên cứu Bảng 3.4. Tần số các allele CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam N: tổng số mẫu nghiên cứu, n: tổng số allele trong quần thể 3.3.2. Đa hình/đột biến của gen CYP2C19 *Các biến thể của CYP2C9 được xác định bằng phương pháp giải trình tự Đối với CYP2C19, đã xác định được tổng số 14 biến thể trong số 100 mẫu nghiên cứu. Trong số đó, có 11 biến thể đã được công bố và 3 biến thể mới (Bảng 3.5). Các biến thể đã được công bố của CYP2C19 bao gồm 2 biến thể trong promoter trong đó 1 biến thể đã được định danh là *17 (-806C>T), 4 biến thể trong intron và 5 biến thể Allele Tổng số (n=200) Tần số (%) *1 190 95 *3 7 3,5 Del 3 1,5 66 trong exon bao gồm 2 biến thể đã được định danh là *2 (19154G>A) và *3 (17948G>A). Các biến thể mới bao gồm 12637C>G (intron 2), 57637delG (intron 5) và 90008C>T (intron 8). Các biến thể mới được thể hiện cụ thể trong Hình 3.9. Đây là những biến thể nằm trong vùng không mã hóa, do đó có thể sẽ không gây ảnh hưởng đến chức năng của chuỗi polypetptide được mã hóa bởi CYP2C19. Nghiên cứu này cũng không phát hiện biến thể thêm nucleotide ở CYP2C19 trong 100 mẫu người Kinh. Bảng 3.5. Các biến thể của CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam STT Vùng gen Vị trí SNP ID Genebank Thay đổi nucleotide đổi Allele Ảnh hưởng Tần số (%) 1 Promoter -806 rs12248560 C>T *17 # (2/100) 2 2 -98 rs4986894 T>C # (41/98) 41,83 3 Intron 2 12637 Mới C>G # (5/100) 5 4 12662 rs12769205 A>G # (39/100) 39 5 Exon 4 17948 rs4986893 G>A *3 Trp212X (5/100) 5 6 Exon 5 19154 rs4244285 G>A *2 Splicing defect (38/100) 38 7 Intron 5 57637 Mới delG # (7/99) 7,07 8 57678 rs28399511 T>G # (1/100) 0,01 9 57740 rs4417205 G>C # (41/100) 41 10 Exon 7 80160 rs3758580 C>T Val330= (44/100) 44 11 80161 rs3758581 A>G Ile331Val (100/100) 100 12 Intron 7 87106 rs4917623 T>C # (89/100) 89 13 Exon 8 87313 rs17886522 A>C Gly417= (7/100) 7 14 Intron 8 90008 Mới C>T # (1/100) 1 #: những biến đổi này không làm ảnh hưởng đến chức năng của protein. Vị trí của mỗi SNP được xác định bằng trình tự tham chiếu của CYP2C19: NG-008384.2 trên cơ sở dữ liệu NCBI. Các nucleotide được đánh số bắt đầu từ base A (+1) của mã mở đầu ATG trên gen. 67 Hình 3.9. Các biến thể mới trong vùng intron của CYP2C19. Nghiên cứu này đã xác định được 03 biến thể mới trong vùng intron của CYP2C19: a) biến thể 2637C>G (intron 2), b) biến thể 57637delG (intron 5) và c) biến thể 90008C>T (intron 8-sử dụng mồi ngược cho giải trình tự). Các vị trí nucleotide bị biến đổi được đánh dấu bằng mũi tên. 68 * Xác định CNV của CYP2C19 bằng MLPA Phân tích MLPA cho thấy không có bất thường số bản sao nào của CYP2C19 được xác định ở 100 mẫu nghiên cứu. Bộ kit MLPA thiết kế 03 đầu dò đặc hiệu cho các exon của CYP2C19 bao gồm exon 2, 6 và 9. Tất cả các mẫu nghiên cứu đều cho tỉ lệ của các đầu dò này sau chuẩn hóa nằm trong khoảng 0,8-1,2. Số liệu về tỉ lệ của các đầu dò sau chuẩn hóa của một số mẫu đại diện được thể hiện trong Bảng 3.6. Bảng 3.6. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP2C19 của một số mẫu nghiên cứu Tên mẫu Vị trí đầu dò của kit MLPA và các tỉ lệ sau chuẩn hóa (Final ratio) Exon 2 Exon 6 Exon 9 FVN 10 1,01 1,01 1,01 FVN 20 1,15 0,97 0,75 FVN 26 1,19 1,08 0,8 FVN 38 0,95 1,1 0,95 FVN 40 0,98 0,96 1 *Tần số kiểu gen và tần số allele của CYP2C19 trong quần thể người Kinh Chúng tôi cũng xác định được 6 kiểu gen của CYP2C19 trong các mẫu nghiên cứu với tỉ lệ dao động từ 1% đến 58% (Bảng 3.7). Trong số đó, kiểu gen phổ biến nhất là đồng hợp tử kiểu dại CYP2C19*1/*1 (58%) và dị hợp tử CYP2C19*1/*2 (32%). Kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2/*3 chiếm tỉ lệ thấp nhất với 1%. Các kiểu gen khác bao gồm CYP2C19*1/*3, CYP2C19*2/*2 và CYP2C19*2/*17 lần lượt có tần số 4%, 3% và 2%. Về hoạt tính, trong khi kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại có hoạt tính enzyme bình thường thì các kiểu gen CYP2C19*1/*2, CYP2C19*1/*3 và CYP2C19*2/*17 có hoạt tính enzyme giảm. Ngoài ra, các kiểu gen CYP2C19*2/*2 và CYP2C19*2/*3 có hoạt tính giảm mạnh hoặc không có hoạt tính (Theo CPIC). 69 Tổng số có 4 allele của CYP2C19 đã được tìm thấy trong số 100 mẫu nghiên cứu bao gồm: CYP2C19*1, CYP2C19*2, CYP2C19*3 và CYP2C19*17. Allele kiểu dại CYP2C19*1 chiếm tần số cao nhất với 76% trong số các mẫu nghiên cứu. Trong khi đó, các allele còn lại là CYP2C19*2, CYP2C19*3 và CYP2C19*17 lần lượt chiếm tỉ lệ 20,5%, 2,5% và 1% (Bảng 3.8). Phân tích bằng phần mềm Haploview cho thấy tất cả 14 biến thể của CYP2C19 xác định được trong 100 mẫu nghiên cứu đều đạt trạng thái cân bằng Hardy-Weinberg với giá trị Hwpval dao động từ 0,2769 đến 1 (Phụ lục 3). Bảng 3.7. Tần số kiểu gen của CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam Kiểu gen Tổng số Kiểu hình chuyển hóa thuốc (Theo CPIC) Tần số (%) (N=100) *1/*1 58 EM 58 *1/*2 32 IM 32 *1/*3 4 IM 4 *2/*2 3 PM 3 *2/*3 1 PM 1 *2/*17 2 IM 2 N: Tổng số mẫu nghiên cứu Bảng 3.8. Tần số các allele CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam Allele Tổng số Tần số % (n=200) *1 154 76 *2 41 20,5 *3 5 2,5 *17 2 1 n: tổng số allele trong quần thể 70 3.3.3. Đa hình/đột biến của gen CYP2D6 *Các biến thể của CYP2D6 xác định được bằng phương pháp giải trình tự Sử dụng phương pháp giải trình tự, nghiên cứu này đã giải trình tự thành công vùng promoter cùng với toàn bộ 9 exon và các vùng biên của gen CYP2D6 trên tổng số 136 mẫu người Kinh Việt Nam. Với phương pháp này, chúng tôi đã xác định được tống số 30 biến thể bao gồm các SNP và biến thể thêm nucleotide của CYP2D6. Các biến thể này bao gồm 7 biến thể mới, ngoài ra 23 biến thể đã được công bố trên cơ sở dữ liệu PharmVar (Bảng 3.9). Các biến thể mới bao gồm 3 biến thể trong vùng promoter (-498C>A, -184A>T, -175A>T) (Hình 3.10), 2 biến thể trong intron 4 và 6 (2137G>C, 2988G>A) và 2 biến thể trong exon 7 và exon 8 (3157G>T, 3851G>A) (Hình 3.11). Biến thể mất nucleotide của CYP2D6 không được tìm thấy ở cả 136 mẫu nghiên cứu. Phân tích cân bằng di truyền quần thể bằng phần mềm Haploview cho thấy có 24/30 biến thể được xác định là đạt trạng thái cân bằng di truyền (Hwpval>0,05) và các biến thể còn lại không đạt trạng thái cân bằng di truyền (HwpvalT, 310G>T, 1039C>T, 3384A>C, 3790C>T và 4181G>C (Phụ lục 4). Bảng 3.9. Biến thể của CYP2D6 trong quần thể người Kinh Việt Nam xác định bằng phương pháp giải trình tự STT Vùng gen Vị trí SNP ID Genbank Thay đổi nucleotide Ảnh hưởng Tần số (%) 1 Promoter (-740) rs28624811 C>T, # 26/136 (19,1) 2 (-678) rs28633410 G>A # 32/136 (23,5) 3 (-498) Mới C>A # 16/136 (11,7) 4 (-184) Mới A>T # 1/136 (0,7) 5 (-175) Mới A>T # 10/136 (7,3) 6 Exon 1 100 rs1065852 C>T Pro34Ser 110/136 (80,8) 7 137-138 rs774671100 insT 47 frameshift 1/136 (0,7) 8 Intron 1 214 rs1080995 G>C # 25/136 (18,4) 71 9 221 rs1080996 C>A # 26/136 (19,1) 10 223 rs1080997 C>G # 22/136 (16,2) 11 227 rs1080998 T>C # 27/136 (19,9) 12 232 rs29001518 G>C # 34/136 (25) 13 233 rs28695233 A>C # 25/136 (18,4) 14 245 rs1081000 A>G # 21/136 (15,4) 15 310 rs28371699 G>T # 116/136 (85,3) 16 Exon 2 1039 rs1081003 C>T # 114/136 (83,8) 17 Exon 3 1661 rs1058164 G>C # 125/136 (91,9) 18 1759 rs5030865 G>A Gly169Arg 2/136 (1,5) 19 Intron 3 1846 rs3892097 G>A # 3/136 (2,2) 20 Intron 4 2097 rs2267447 A>G # 115/136 () 21 Intron 4 2137 Mới G>C # 1/136 (0,7) 22 Exon 5 2607 rs77913725 G>A Glu278Lys 5/136 (3,7) 23 2611 rs1135828 T>A Met279Lys 1/136 (0,7) 24 Exon 6 2851 rs16947 C>T Arg269Cys 35/136 (25,7) 25 Intron 6 2988 Mới G>A # 6/136 (4,4) 26 Exon 7 3157 Mới G>T Arg329Leu 1/136 (0,7) 27 Intron 7 3384 rs1985842 A>C # 66/136 (48,5) 28 3790 rs4987144 C>T # 33/136 (24,2) 29 Exon 8 3851 Mới G>A Trp358X 2/136 (1,5) 30 Exon 9 4181 rs1135840 G>C Ser486Thr 82/136 (60,3) #: những biến đổi này không làm ảnh hưởng đến chức năng của protein. Vị trí của nucleotide được xác định dựa trên trình tự tham chiếu của CYP2D6 là NG_008376.4 trên NCBI. Số thứ tự của nucleotide được đánh số +1 bắt đầu từ base A trong mã mở đầu ATG. 72 Hình 3.10. Các biến thể mới trong vùng promoter CYP2D6 Nghiên cứu này xác định được 03 biến thể mới trong vùng promoter (sử dụng mồi ngược cho giải trình tự): a) biến thể -175A>T, b) biến thể -184A>T, c) biến thể -498C>A. Các vị trí nucleotide bị biến đổi được đánh dấu bằng mũi tên. Các biến thể trên đều được xác định ở trạng thái dị hợp tử, riêng biến thể -498C>A được xác định cả ở trạng thái dị hợp tử và đồng hợp tử. 73 Hình 3.11. Các biến thể mới trong intron và exon của CYP2D6 Nghiên cứu này xác định được 2 biến thể mới trong intron và 2 biến thể mới trong exon của CYP2D6: a) biến thể 2137G>C (intron 4), b) biến thể 2988G>A (intron 6), c) biến thể 3157G>T (exon 7), d) biến thể 3851G>A (exon 8- sử dụng mồi ngược cho giải trình tự). Các vị trí nucleotide bị biến đổi được đánh dấu bằng mũi tên. Các biến thể trên đều được xác định ở trạng thái dị hợp tử. 74 *Xác định CNV của CYP2D6 bằng MLPA Phương pháp MLPA được sử dụng để xác định CNV của CYP2D6 trên tổng số 136 mẫu người Kinh Việt Nam. Kết quả phân tích sau quá trình chuẩn hóa được hiển thị dưới dạng bảng số liệu và biểu đồ sóng (electropherogram). Các mẫu thể hiện tăng hay giảm số bản sao ở các exon không liền kề nhau được loại bỏ ra khỏi các phân tích tiếp theo và coi như có số bản sao bình thường (2 bản sao). Kết quả cho thấy có 12 kiểu tập hợp số bản sao của 4 exon nói trên. Số liệu MLPA (giá trị tỉ lệ sau chuẩn hóa) về CNV gen CYP2D6 của một số mẫu trong nghiên cứu được thể hiện ở phụ lục 7. Một số kết quả MLPA của CYP2D6 của dưới dạng biểu đồ sóng được trình bày trong các hình 3.12-3.14. Hình 3.12. Kết quả MLPA xác định số bản sao bình thường của gen CYP2D6 Mẫu FVN37: Mang số bản sao CYP2D6 bình thường. Tỉ lệ số bản sao của các exon 1, 5, 6 và 9 là 2:2:2:2. Vị trí các đầu dò trên CYP2D6 được thể hiện bởi các mũi tên màu đỏ. 75 Hình 3.13. Kết quả MLPA xác định bất thường số bản sao (các exon 1,5,6) gen CYP2D6. Mẫu FVN19: Tỉ lệ số bản sao của các exon 1, 5, 6 và 9 là 3:3:3:2. Vị trí các đầu dò trên CYP2D6 được thể hiện bởi các mũi tên màu đỏ. Hình 3.14. Kết quả MLPA xác định mất toàn bộ 01 bản sao của gen CYP2D6. Mẫu FVN 57: mất toàn bộ 1 allele CYP2D6. Tỉ lệ số bản sao của các exon 1, 5, 6 và 9 là 1:1:1:1. Vị trí các đầu dò trên CYP2D6 được thể hiện bởi các mũi tên màu đỏ. 76 Phân tích kết quả MLPA cho thấy có 21/136 mẫu nghiên cứu xuất hiện mất 1 allele CYP2D6 với tỉ lệ số bản sao của các exon 1:5:6:9 là 1:1:1:1. Kết quả tỉ lệ sau chuẩn hóa bằng phần mềm Coffalyzer của 4 đầu dò của 21 mẫu này đều cho giá trị nằm trong khoảng 0,4-0,65. Các mẫu mà kết quả MLPA cho thấy bị mất hoàn toàn 1 bản sao của CYP2D6 được kiểm tra lại ngẫu nhiên bằng phương pháp LR-PCR. Sơ đồ vị trí các mồi sử dụng cho LR-PCR được thể hiện ở Hình 3.15a. Phân tích kết quả cho thấy phù hợp 100% với dữ liệu thu được từ MLPA với các mẫu mất 1 allele CYP2D6 đều xuất hiện 2 băng gồm: băng đặc hiệu cho allele đột biến với kích thước 3,2 kb và băng đặc hiệu cho allele nguyên vẹn là 5,1 kb. Trong khi đó, mẫu đối chứng có 2 bản sao của gen này chỉ xuất hiện 1 băng có kích thước 5,1 kb (Hình 3.15b). a) b) Hình 3.15. LR-PCR kiểm tra allele CYP2D6*5. a) Sơ đồ vị trí các cặp mồi sử dụng cho LR-PCR tương ứng với các allele CYP2D6*1 và CYP2D6*5. Đột biến mất 1 allele CYP2D6 sẽ tạo sản phẩm là 2 đoạn có kích thước 3,2 kb- allele *5 (cặp mồi Dup và Dlow) và 5,1 kb-allele kiểu dại *1(cặp mồi DPKup và DPKlow). Các mẫu đồng hợp tử kiểu dại chỉ xuất hiện 1 sản phẩm có kích thước 5,1 kb [110]. b) Giếng 1: Thang DNA chuẩn, giếng 2-3: các mẫu đồng hợp tử kiểu dại CYP2D6*1/*1, giếng 4-5: các mẫu mất 1 bản sao CYP2D6 có kiểu gen dị hợp tử CYP2D6*1/*5. 77 Bên cạnh đó, nghiên cứu này không xác định được sự tồn tại của biến thể tăng số bản sao của CYP2D6 trong số 136 mẫu (CYP2D6*nxN, N>2) cũng như hiện tượng mất hoàn toàn 2 allele của CYP2D6 (giá trị DQ sau chuẩn hóa = 0). *Tần số allele và kiểu gen của CYP2D6 trên người Kinh Việt Nam Để xác định các kiểu gen của CYP2D6, dữ liệu thu được từ giải trình tự và phân tích số bản sao bằng MLPA được kết hợp và đối chiếu để đưa ra kiểu gen cuối cùng ở mỗi mẫu nghiên cứu. Bên cạnh việc sử dụng dữ liệu của các biến thể đã công bố của CYP2D6 trên cơ sở dữ liệu PharmVar (bao gồm các biến thể dạng SNP, indel, CNV và SV), nghiên cứu này còn cập nhật và tham khảo các kết quả từ công bố của các nhóm nghiên cứu trên thế giới về một số SV khác của CYP2D6 để đối chiếu và đưa ra kết luận về kiểu gen của các mẫu nghiên cứu.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_da_hinh_dot_bien_gen_cyp2c9_cyp2c19_cyp3a.pdf
Tài liệu liên quan