Luận án Nghiên cứu khu hệ vi sinh vật vùng rễ cây nghệ vàng curcuma longa l. nhằm định hướng tăng năng suất và chất lượng củ nghệ

phần mềm BioEdit 7.0 [172] và MEGA X [173] [174]. 2.2.5.4 Xác định đặc điểm hình thái của bào tử nấm AM Các bào tử đã phân lập được đặt vào đĩa Petri nhỏ, và cố định vào các phiến kính với PVA (polyvinyl alcohol) và nhuộm bằng thuốc thử Melzer’s. Hình dạng, kích thước, màu sắc của bào tử và các túi bào tử đã được ghi lại. Các bào tử được phân loại thành từng nhóm dựa trên hình thái. Quá trình quan sát đặc điểm hình thái được tiến hành đưới 44 kính hiển vi Zeiss (Đức) và so sánh với dữ liệu của bộ sưu tập quốc tế INVAM ( 2.2.6 Nghiên cứu tạo và thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật vùng rễ cho cây nghệ 2.2.6.1 Tạo chế phẩm VSV vùng rễ cho cây nghệ  Xác định khả năng gây độc của chủng VSV Khả năng gây bệnh trên động vật của chủng VSV được xác định theo phương pháp mô tả bởi Carter [177]. Cụ thể, chủng VSV được cấy chuyển vào môi trường canh thang BHI (Merck, Đức) trong 18-20 giờ để thu canh trùng thí nghiệm. Tiêm 0,5 mL canh trùng cho chuột nhắt trắng (BALB/c) với đường tiêm xoang phúc mạc (XPM) và 0,2 mL canh trùng cho mỗi chuột nhắt trắng với đường tiêm tĩnh mạch đuôi (TMĐ). Với mỗi đường tiêm, dịch VSV được tiêm cho 6 chuột. Lô đối chứng: 06 chuột tiêm 0,5 mL canh thang BHI vào XPM, 06 chuột tiêm 0,2 mL dịch BHI vào TM. Theo dõi chuột và thống kê số chuột ốm, chết, và thời gian gây chết chuột thí nghiệm. Chủng VSV được coi là an toàn trên động vật khi không gây ốm và chết chuột thí nghiệm so với đối chứng. Các quy trình nhân nuôi nấm AM, nhân sinh khối, và phối trộn, tạo chế phẩm nấm AM được thực hiện dựa trên một số kinh nghiệm nghiên cứu kế thừa từ Đề tài Nghị định thư mã số 53/2011/ HĐ-NĐT của Bộ Khoa học và Công nghệ và đề tài VAST 0205/17-18 của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ đã thực hiện tại Phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên.  Nhân nuôi nấm AM Bào tử nấm AM được nhân giống trên cây mã đề Ribwort (Plantago lanceolata) (được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học - Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam). Quy trình nhân nuôi được thực hiện theo các bước cụ thể như sau: - Xử lý hạt giống cây P. lanceolata: Hạt giống cây được khử trùng bằng cồn 70%, NaOCl 3% và rửa lại bằng nước cất; - Tạo giá thể bằng cách trộn cát vàng và than bùn theo tỉ lệ 1:2, khử trùng ở 1210C trong 1 giờ. Trộn bào tử nấm AM vào giá thể; - Gieo hạt giống cây P. lanceolata vào giá thể đã bổ sung bào tử nấm AM. Mỗi bầu gieo từ 10-15 hạt giống. Sau khoảng 2 tuần hạt đã nảy mầm ổn định, tiến hành tỉa bỏ những cây không đạt tiêu chuẩn và chỉ giữ lại mỗi bầu đồng đều 10 cây. 45 - Sau 4 tháng nhân nuôi trên cây, tiến hành phân lập lại bào tử nấm rễ bằng phương pháp lọc ướt (xem mục 2.2.5).  Nhân sinh khối, tạo hỗn hợp vi khuẩn Sinh khối chủng vi khuẩn PGPR không gây độc được nhân nuôi trên môi trường LB dịch thể trong bình lên men dung tích 10 L có sục khí. Sau 48 giờ nuôi, tiến hành thu dịch lên men chứa sinh khối VSV và trộn với chất mang CM1 theo tỉ lệ 1:4 (w/w). Trong đó, CM1 gồm các thành phần theo khối lượng (Than bùn : cám gạo = 9 : 1). Sấy khô (45oC) để đạt độ ẩm 15-20%, thu được hỗn hợp vi khuẩn (Kí hiệu: HHVK).  Thu hồi bào tử, tạo hỗn hợp bào tử nấm rễ Thu hồi bào tử nấm rễ Glomus spp. sau khi nhân giống in vivo trên cây Mã đề Ribwort bằng phương pháp lọc ướt, hỗn hợp bào tử thu được kí hiệu là BT1. Trộn hỗn hợp bào tử BT1 với chất mang CM2 theo tỉ lệ 400 bào tử/1 gam chất mang. Trong đó, CM2 gồm các thành phần với tỉ lệ thành phần theo khối lượng (Bột đậu tương : glucose : cám gạo : CaCO3 = 2 : 1 : 5 : 0,5) đã được sấy ở 50oC trong 24 giờ trước khi trộn. Sau đó sấy khô sản phẩm phối trộn ở 40-45oC đến khi đạt độ ẩm 10%, thu được hỗn hợp bào tử nấm rễ (Kí hiệu: HHNR).  Phối trộn, tạo chế phẩm Phối trộn HHVK và HHNR theo tỉ lệ 1:1 (w/w). Bổ sung thêm các đoạn rễ của cây P. lanceolata (2-5%, w/w) vào sản phẩm phối trộn để hỗ trợ duy trì bào tử của nấm rễ AM. Tiến hành bổ sung hạt polyacrylamide tự phân được với tỉ lệ 0,8-1,2% tổng trọng lượng chế phẩm. Chế phẩm VSV được đóng túi 200 g/túi trước khi thử nghiệm trên cây nghệ. 2.2.6.2 Thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm VSV vùng rễ cho cây nghệ  Bố trí thí nghiệm Thử nghiệm xác định hiệu quả của chế phẩm VSV cho cây nghệ vàng được tiến hành tại Vườn thuốc Bộ Y tế tại Thanh Trì, Hà Nội từ tháng 5 đến tháng 11 năm 2018. Thí nghiệm thực hiện trên 2 nhóm: (i) Nhóm bổ sung chế phẩm VSV (Kí hiệu: CP) và (ii) Nhóm đối chứng (Kí hiệu: ĐC). Các gốc nghệ giống (nghệ giống C. longa var. Hung- yen được chọn lọc từ các củ nghệ khi cây được 2 - 3 lá, chọn cây khoẻ mạnh, không sâu bệnh) được trồng với khoảng cách 30x30 cm. Nghệ được trồng ở mỗi nhóm CP và ĐC trên diện tích 12 m2, tổng diện tích khu vực thí nghiệm 30 m2 (bao gồm cả phần diện tích của luống bảo vệ). 46  Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất Các chỉ tiêu sinh trưởng (Xem mục 2.2.2.2) được theo dõi định kỳ. Năng suất được xác định dựa theo sinh khối tươi tại thời điểm kết thúc thử nghiệm.  Xác định khả năng tập nhiễm của các chủng VSV trong chế phẩm Khả năng tập nhiễm của các chủng nấm AM trong chế phẩm vào vùng rễ cây nghệ được xác định bằng phương pháp mô tả bởi Liu & Luo (1994) [178]. Theo đó, khả năng tập nhiễm (inoculum potential, IP) của chủng nấm nghiên cứu được xác định bằng công thức: IP = (N x L) + S, trong đó N là số bào tử trong 1 cm mẫu rễ khảo sát (bào tử/cm); L là chiều dài các đoạn rễ của cây khảo sát (cm/cây), và S là số bào tử nấm AM phân lập được từ đất vùng rễ của cây khảo sát. Khả năng tập nhiễm của các chủng vi khuẩn PGPR thuộc chi Bacillus được xác định bằng phương pháp định lượng đếm khuẩn lạc (Most Probable Number, MPN) sau khi làm nóng mẫu ở 80oC và so sánh giữa nhóm mẫu ĐC và CP. 47 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ bón phân đạm hóa học đến năng suất cây nghệ Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng nói chung chịu chi phối bởi nhiều yếu tố liên quan đến khí hậu và thổ nhưỡng. Trong tương quan với phần lớn đối tượng cây trồng trên thế giới, nhu cầu dinh dưỡng của cây nghệ luôn ở mức rất cao [179]. Đặc biệt, để đảm bảo canh tác nghệ ở quy mô lớn và duy trì năng suất, nhất định phải sử dụng một lượng phân bón N-P-K hóa học rất lớn [180]. Theo Harper (1994), N đóng góp từ 26 đến 41% năng suất thu hoạch của cây nông nghiệp [181]. Chính vì vậy, trong khuôn khổ luận án này, chúng tôi ưu tiên thực hiện khảo sát ảnh hưởng của chế độ phân đạm (N) đến năng suất nghệ và hàm lượng curcumin trong điều kiện được cung cấp đầy đủ phân P và K. 3.1.1 Xác định chất lượng nghệ giống thích hợp Trước khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát các tác động của phân bón đến đến năng suất, chúng tôi đã xác định chất lượng nghệ giống thích hợp thông qua nghiên cứu ảnh hưởng của trọng lượng củ nghệ giống đến các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất của cây nghệ. Các mẫu cây nghệ trồng trong phòng thí nghiệm được quan sát và theo dõi các đặc điểm trong suốt quá trình phát triển theo thời gian. Kết quả đạt được (Bảng 3.1) cho thấy, nghệ giống có khối lượng lớn thì có sức sống cao hơn. Khi củ nghệ giống có khối lượng trên 35 g thì chiều cao cây, số lượng lá tạo ra theo từng giai đoạn, cũng như số lượng nhánh củ tương tự nhau. Từ thời điểm 4 tháng đến 7 tháng, nghệ phát triển ổn định về chiều cao và số lượng lá/cây. Từ thời điểm 8 tháng tuổi, phần lá nghệ dần héo và khô, tiến hành thu hoạch và xác định khối lượng củ nghệ. Từ sự thay đổi của năng suất thu hoạch so với khối lượng củ nghệ giống, có thể nói, trong khoảng khối lượng củ giống nghệ từ 15 đến 50 g, năng suất củ nghệ tươi tăng tỉ lệ thuận với khối lượng củ nghệ giống, điều này có thể liên quan chặt chẽ đến các yếu tố sinh trưởng của cây nghệ: Khi khối lượng củ giống tăng thì sự sinh trưởng của cơ quan dinh dưỡng nghệ cũng tăng, dẫn đến năng suất nghệ tăng. 48 Bảng 3. 1. Một số đặc điểm sinh trưởng và khối lượng củ nghệ theo thời gian. Kí hiệu củ Khối lượng củ giống (g) Đặc điểm sinh trưởng Khối lượng củ tươi khi thu hoạch (g) Tỉ lệ củ tươi/khô sau khi thu hoạch 2 tháng 3 tháng 1 15,35 4 lá 6 lá, 0 mầm mới 29,76 18,44 2 17,75 4 lá 7 lá, 0 mầm mới 46,93 20,03 3 21,3 4 lá 7 lá, 0 mầm mới 43,67 19,39 4 35,5 4 lá 7 lá, 0 mầm mới 121,96 18,94 5 41,24 5 lá 7 lá, 1 mầm mới 109,26 17,93 6 41,62 5 lá 7 lá, 1 mầm mới 150,07 20,09 7 52,81 5 lá 7 lá, 1 mầm mới 261,77 19,62 8 57,45 5 lá 7 lá, 2 mầm mới 227,75 18,75 9 75,8 5 lá 7 lá, 1 mầm mới 193,45 18,14 10 92,35 5 lá 7 lá, 2 mầm mới 227,85 19,52 11 96,15 5 lá 7 lá, 2 mầm mới 226,69 20,51 12 101,37 5 lá 7 lá, 1 mầm mới 215,88 18,85 13 101,92 5 lá 7 lá, 2 mầm mới 232,42 19,33 14 113,8 5 lá 7 lá, 2 mầm mới 257,31 19,05 15 115,4 5 lá 7 lá, 2 mầm mới 230,74 18,96 Hình 3. 1. Biểu đồ liên hệ giữa khối lượng củ nghệ giống và năng suất củ nghệ tươi sau thu hoạch. Hình 3.1 mô tả tương quan giữa khối lượng củ nghệ tại thời điểm thu hoạch và củ nghệ giống. Từ các số liệu liên quan đến khối lượng thu được, sử dụng hỗ trợ tính 49 toán của phần mềm Excel (Microsoft Office 2010, USA) chúng tôi đã xác định phương trình hồi quy y = 0,0004*x3 – 0,1124*x2 + 10,835*x – 124,38, với giá trị R2 = 0,8902, trong đó y là khối lượng củ tươi sau thu hoạch và x là khối lượng củ nghệ giống tính theo đơn vị g. Mặc dù phương trình thu được chỉ có ý nghĩa trong điều kiện thí nghiệm và với cỡ mẫu chưa cao, nhưng phần nào đã đưa ra cơ sở cho việc lựa chọn chất lượng củ giống nghệ thích hợp cho canh tác cũng như các thí nghiệm tiếp theo. Có thể nhận thấy, các cây nghệ giống có khối lượng trên 45 g cũng có năng suất củ tươi sau thu hoạch cao hơn hẳn so với nhóm các cây nghệ trồng từ củ giống trọng lượng từ 15-35 g. Đặc biệt, khi khối lượng củ nghệ giống lớn hơn 60 g thì không ghi nhận sự khác biệt rõ rệt trong năng suất nghệ tươi. Như vậy, củ nghệ giống trong khoảng khối lượng trên 60 g, đặc biệt là trên 80 g thích hợp cho canh tác nghệ diện rộng và đạt mức độ đồng đều cao về năng suất. Kết quả đạt được tạo cơ sở để lựa chọn được củ giống nghệ phù hợp, là nền tảng cho các thí nghiệm xác định ảnh hưởng yếu tố phân bón tới năng suất nghệ tiếp theo. 3.1.2 Điều kiện thổ nhưỡng khu vực thí nghiệm 3.1.2.1 Đặc điểm khí hậu Địa điểm nghiên cứu tại vùng canh tác nghệ tại xã Đại Tập, huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên. Theo số liệu năm 2017, khí hậu tại vùng canh tác có đặc điểm là khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, hàng năm có hai mùa nóng và lạnh rõ rệt [182]. Thời gian chiếu sáng trong năm là khoảng 1640-1650 giờ, trong đó số giờ nắng trong mùa nóng (tháng 5 đến tháng 10) từ 1080 đến 1100 giờ/năm, mùa lạnh (tháng 11 đến tháng 4) có số giờ nắng khoảng 500 – 520 giờ. Nhiệt độ trung bình năm là 23,2 oC, mùa hè là 27,3oC, mùa đông là 19,1oC ( Lượng mưa trung bình từ 1500-1650 mm, tháng 5 đến tháng 10 chiếm tới 70% lượng mưa cả năm, đây cũng là thời gian chính canh tác nghệ, là giai đoạn mà cây nghệ phát triển nhanh và mạnh nhất [183]. Mùa khô lượng mưa trung bình từ 200 - 300 mm chiếm khoảng 15 - 20% tổng lượng mưa cả năm. Độ ẩm không khí trung bình trong năm là 80- 90%, tháng cao nhất là tháng 2 với 92%, thấp nhất (tháng 11 và 12) 79%. Điểm canh tác cây nghệ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, với 2 mùa gió chính, đó là gió mùa đông bắc (từ tháng 9 đến tháng 3 năm sau), và gió mùa đông nam (từ tháng 3 đến tháng 7) [182]. 50 3.1.2.2 Khảo sát các chỉ số môi trường của đất trồng nghệ Từ các mẫu đất tại vùng chuyên canh, chúng tôi đã thực hiện đánh giá các chỉ số môi trường của mẫu đất. Kết quả xác định các chỉ số thu được giai đoạn trước khi trồng nghệ được thể hiện trong Bảng 3.2. Bảng 3. 2. Kết quả phân tích các chỉ số môi trường của mẫu đất trồng nghệ tại vùng chuyên canh. STT Chỉ tiêu phân tích Đơn vị tính Kết quả phân tích 1 Thành phần cơ giới của đất Cát thô (2-0,2 mm) (%) 8,13 ± 1,1 Cát mịn (0,2-0,02 mm) (%) 58,57 ± 2,0 Limon (0,02-0,002 mm) (%) 26,50 ± 2,4 Sét (<0,002 mm) (%) 6,80 ± 1,7 2 pH của đất 6,75 3 Nitơ tổng số (%N) 0,35 ± 0,1 4 Phốt pho tổng số (%P2O5) 0,20 ± 0,1 5 Kali tổng số (%K2O) 1,31 ± 0,0 6 Nitơ dễ tiêu (mg Ndt / 100 g đất) 29,94 ± 1,6 7 Phốt pho dễ tiêu (mg Pdt / 100 g đất) 27,33 ± 2,2 8 Kali dễ tiêu (mg Kdt / 100 g đất) 58,69 ± 2,8 9 Số lượng vi sinh vật Vi khuẩn CFU/g 1,01 * 107 Nấm CFU/g 2,33 * 105 Chỉ số pH trong khoảng từ 6-7 của các mẫu đất trồng nghệ rất thích hợp cho canh tác các cây nông nghiệp. Số lượng vi khuẩn tổng số là 1,01*107 CFU/g, nấm tổng số là 2,33*105 CFU/g, cho thấy rằng đất tại vùng canh tác có độ phì nhiêu nhất định, thích hợp để trồng nhiều loại cây nông nghiệp. Đánh giá các chỉ số phân tích bằng cách so sánh với TCVN 7373:2004, 7374:2004, 7375:2004, có thể nhận thấy, đất trồng nghệ có các chỉ số về hàm lượng N, P, K tương ứng với chỉ số của đất phù sa. Điều này phù hợp với điều kiện tự nhiên của vùng canh tác nghệ nằm trong khu vực đồng bằng Sông Hồng. Riêng hàm lượng Nts trong đất phân tích (0,35 ± 0,1 mg/100 g đất) có phần cao hơn so với chỉ tiêu chung của đất phù sa, điều này có thể lý giải do sự tồn đọng của phân đạm từ vụ canh tác trước. Vì lý do các mùa vụ tại vùng canh tác thường được thực hiện từ 51 tháng 3 đến tháng 12 hàng năm, nên khả năng phân bón của mùa vụ trước còn tồn đọng đến mùa canh tác sau là rất cao. Chính vì vậy, việc quan trắc chất lượng đất trồng thường xuyên và định kỳ có ý nghĩa rất quan trọng trong hoạch định chế độ canh tác nông nghiệp nói chung và cây nghệ nói riêng. 3.1.3 Xác định năng suất nghệ theo chế độ bón phân N Năng suất củ nghệ sau thu hoạch tại mỗi chế độ dinh dưỡng được xác định sau khi thu hoạch như sau: Chế độ N0: 21038 ± 5013 kg/ha/năm; Chế độ N150: 27003 ± 4703 kg/ha/năm; Chế độ N350: 30902 ± 1642 kg/ha/năm; Chế độ N500: 20578 ± 2306 kg/ha/năm. Các thông số liên quan đến năng suất củ nghệ, gồm có khối lượng củ khô và khối lượng củ tươi thu được của mỗi chế độ canh tác được nêu trong Bảng 3.3. Bảng 3. 3. Năng suất củ nghệ tươi sau thu hoạch và hệ số khối lượng khô/tươi của củ nghệ tại mỗi chế độ canh tác Chế độ canh tác Năng suất tươi (kg/ha/năm) Khối lượng củ khô (kg) thu được từ 10 kg củ tươi Hệ số khối lượng khô/khối lượng tươi (%) N0 21038 ± 5013 2,137 ± 0,155 21,37 N150 27003 ± 4703 2,540 ± 0,166 25,40 N350 30902 ± 1642 2,402 ± 0,268 24,02 N500 20578 ± 2306 2,239 ± 0,387 22,39 Từ kết quả đạt được có thể nhận thấy, khối lượng củ nghệ thu được (kg/ha) ở lô thí nghiệm với chế độ N0 (0 kg N, 400 kg P, 200 kg K) và chế độ N500 (500 kg N, 400 kg P, 200 kg K) là thấp nhất. Điều này cho thấy rằng, chế độ bón phân N ở mức quá thấp hoặc quá cao đều ảnh hưởng không tốt đến năng suất của củ nghệ sau thu hoạch. Chế độ canh tác với mức độ bón phân đạm từ 150 đến 350 kg/ha cho năng suất củ nghệ tươi sau thu hoạch cao hơn đáng kể so với chế độ N0 (không bón phân N). 3.1.4 Xác định năng suất curcumin theo chế độ bón phân N Phân tích định lượng các chất curcuminoid trong mẫu dịch chiết củ nghệ bằng phương pháp sắc ký HPLC cho thấy, trên sắc ký đồ của các mẫu dịch chiết đều có sự hiện diện của các peak tương ứng với 3 chất curcumin, DMC và BDMC với các thời gian lưu (retention time) lần lượt là 19,3; 17,9 và 16,7 phút. Từ kết quả xác định hệ số khối lượng khô/khối lượng tươi của các mẫu nghệ thu hoạch được, kết hợp với hàm lượng curcuminoid đã biết trong củ nghệ khô của các mẫu 52 trên, chúng tôi đã xác định được hàm lượng các chất curcuminoid trong nguyên liệu mẫu khô theo khối lượng, cũng như hàm lượng này trong nguyên liệu củ nghệ tươi, kết quả được nêu trong Bảng 3.4. Bảng 3. 4. Hàm lượng các chất curcuminoid trong nguyên liệu mẫu khô (%) và trong nguyên liệu mẫu tươi (%). Chế độ canh tác Hàm lượng chất trong nguyên liệu mẫu khô (%) Hàm lượng chất trong nguyên liệu mẫu tươi (%) Curcuminoid tổng Curcumin DMC BDMC Curcuminoid Curcumin N0 2,557 ± 0,382 2,090 ± 0,312 0,112 ± 0,025 0,355 ±0,045 0,546 ± 0,031 0,447 ± 0,062 N150 3,263 ± 0,273 2,602 ± 0,214 0,147 ± 0,021 0,513 ± 0,038 0,829 ± 0,025 0,661 ± 0,038 N350 3,182 ± 0,366 2,561 ± 0,256 0,138 ± 0,015 0,482 ± 0,095 0,764 ± 0,083 0,615 ± 0,082 N500 2,623 ± 0,085 2,105 ± 0,038 0,131 ± 0,015 0,387 ± 0,032 0,587 ± 0,074 0,471 ± 0,025 Bảng 3. 5. Năng suất curcumin của các chế độ canh tác nghệ. Chế độ canh tác Năng suất tươi (kg/ha) Lượng chất trong 1ha trồng nghệ (kg/ha) Curcuminoid Curcumin N0 21038 ± 5013 114,426 ± 6,515 93,527 ± 3,571 N150 27003 ± 4703 193,945 ± 4,066 154,705 ± 5,164 N350 30902 ± 1642 236,346 ± 7,865 190,235 ± 3,757 N500 20578 ± 2306 120,702 ± 6,462 96,864 ± 2,114 Năng suất curcumin của mỗi chế độ canh tác đã được xác định. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.5. Kết quả cho thấy, năng suất curcumin cao nhất thu được tại lô thí nghiệm có áp dụng chế độ canh tác N350 (350 kg N/ha/năm). Có thể thấy, với lượng phân đạm dao động từ 0 đến 350 kg/ha thì năng suất curcumin của cây nghệ canh tác cũng tăng dần, tuy nhiên, khi lượng phân đạm bón cho cây nghệ vượt quá 350 kg/ha thì năng suất curcumin bị giảm xuống (Chế độ N500). Hình 3.2 tổng hợp các kết quả liên quan đến năng suất củ nghệ tươi và hàm lượng curcumin đạt được của mỗi chế độ bón phân đạm. Với lượng phân đạm từ 150 đến 350 kg/ha/năm thì năng suất củ nghệ và hàm 53 lượng curcuminoid đều ở mức cao hơn so với khi không bón (0 kg/ha/năm) và bón quá nhiều phân đạm (500 kg/ha/năm). Hình 3. 2. Năng suất và hàm lượng curcuminoid tổng trong củ nghệ của các chế độ canh tác nghệ. Trong các thập kỷ gần đây, những nghiên cứu liên quan đến ảnh hưởng của N, P và K tới năng suất nghệ và hàm lượng curcumin đã được khá nhiều tác giả thực hiện, tuy nhiên các kết quả nghiên cứu vẫn chưa đồng nhất và còn tồn tại những quan điểm trái ngược. Xét về tác động tới năng suất curcumin, trong điều kiện bón kết hợp với phân hữu cơ thì N, P và K đều được đánh giá là những tác nhân tích cực (Reddy & Rao 1978). Theo Akamine & cs. (2007), khi chỉ bón phân N thì hàm lượng curcumin trong củ sẽ không tăng, trong khi P và K làm tăng cao hàm lượng curcumin: tác dụng làm tăng curcumin của phân K thể hiện rõ ràng nhất, ở mức cao hơn hẳn so với P [67]. Kết quả một nghiên cứu khác năm 2013 lại chỉ ra rằng, N và K là những yếu tố chính tác động, trong khi P có thể không đóng vai trò đến hiệu quả tổng hợp curcumin trong củ nghệ vàng [184]. Ngoài ra, khi bón kết hợp 3 loại N, P, K ở tỉ lệ không phù hợp cũng tác dụng làm giảm tổng hợp curcumin, bởi P và K có thể ức chế lẫn nhau hoặc tạo ra các ion độc gây hại thực vật [66]. Kết quả đạt được trong khảo sát này có ý nghĩa bổ sung và khẳng định cho luận điểm về tác dụng của phân bón N đến năng suất và hàm lượng curcumin trong củ nghệ vàng C. longa mà các nghiên cứu trên thế giới đã đề cập tới. Mặt khác, kết quả nghiên cứu đã đưa ra những số liệu đánh giá đầu tiên về tác dụng của phân bón hóa học đến năng suất của nghệ vàng ở Việt Nam. 54 3.2 Khảo sát một số nhóm vi sinh vật hữu hiệu trong vùng rễ cây nghệ Dựa trên các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến khu hệ VSVVR cộng sinh với cây nghệ vàng C. longa, chúng tôi đã thực hiện khảo sát sự có mặt của các VSV thuộc hai nhóm chủ yếu là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng (PGPR) và nấm rễ cộng sinh (AM) trong vùng rễ cây nghệ vàng tại vùng chuyên canh nghệ, qua đó định hướng tuyển chọn một số đối tượng tiềm năng để đề xuất chế phẩm sinh học làm tăng năng suất cây trồng. 3.2.1 Khảo sát vi khuẩn rễ kích thích sinh trưởng (PGPR) trong vùng rễ cây nghệ 3.2.1.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn PGPR Các PGPR đã được chứng minh là có tác động tích cực lên sự phát triển và sự tạo thành các hợp chất thứ cấp cũng như đến chất lượng của một số cây thuốc nói chung và cây nghệ vàng C. longa nói riêng. Vì vậy, chúng tôi đã thực hiện phân lập các chủng vi khuẩn PGPR từ đất trồng cây nghệ vàng, nhằm khảo sát và xây dựng bộ chủng VSV hữu hiệu có tiềm năng giúp tăng năng suất và chất lượng của cây. Dựa trên các đặc tính cơ bản của PGPR bao gồm: (i) Khả năng tạo các chất kích thích sinh trưởng thực vật (phytohormones) như IAA, gibberelic acid, cytokinins và ethylenes; (ii) Khả năng cố định đạm; (iii) Khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh; (iv) Khả năng hòa tan phosphate và các chất dinh dưỡng khó tan [79, 185, 186], nghiên cứu đã được tiến hành nhằm phân lập các chủng vi khuẩn từ vùng rễ cây nghệ theo trình tự các tiêu chí lần lượt gồm: Phân giải phosphate vô cơ (Pvc), tạo chất kích thích sinh trưởng IAA, cố định đạm và khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh. Từ các mẫu đất vùng rễ, đã phân lập được 9 chủng vi khuẩn biểu hiện khả năng hòa tan Pvc trên đĩa thạch. Khả năng hoà tan Pvc được đánh giá bằng cách đo đường kính (ĐK) phân giải cơ chất bằng công thức: ĐK (mm) = D-d; trong đó D = đường kính vòng phân giải cơ chất và d = đường kính khuẩn lạc vi khuẩn. Đường kính vòng phân giải của các chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường có cơ chất tri-calcium phosphate [Ca3(PO4)2] từ các mẫu đất vùng rễ cây nghệ vàng được thể hiện ở Bảng 3.6. 55 Bảng 3. 6. Khả năng hòa tan phosphate, phát triển trên môi trường không chứa đạm và sinh tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn. TT Ký hiệu chủng Khả năng hòa tan Pvc (D-d, mm)* Khả năng phát triển trên môi trường không đạm Khả năng sinh tổng hợp IAA (ppm) 1 PGP-V2 3 + 24,80±2,21 2 PGP-V4 5 - 9,66±1,72 3 PGP-V5 3 + 67,51±2,11 4 PGP-V15 5 + 35,47±3,05 5 PGP-V18 3 + 26,82±1,46 6 PGP-V20 4 + 77,87±2,78 7 PGP-V21 6 + 63,11±2,09 8 PGP-V22 4 + 11,61±1,85 9 PGP-V24 4 - 45,81±2,89 *Ghi chú: D: đường kính vòng phân giải cơ chất xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn; d: đường kính khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa thạch. Trong đất trồng luôn có một lượng lớn lân nhưng chúng phần lớn tồn tại ở dạng không tan và khó hấp thu, vì vậy hoạt động của các vi khuẩn giúp chuyển hóa lượng lân vô cơ thành dạng tan có ý nghĩa rất lớn đối với dinh dưỡng cho cây trồng. Có thể nói, sự hòa tan các hợp chất P không chỉ phụ thuộc vào nguồn hợp chất P khó tan trong đất mà còn phụ thuộc vào điều kiện pH và hoạt động chuyển hóa của mỗi nhóm VSV trong đất. Trong khi các nguồn P hữu cơ được VSV chuyển hóa thông qua cơ chế sinh enzyme (phosphatase, phytase, C-P lyase, v.v.), các nguồn Pvc khó tan trong đất lại chủ yếu được VSV hòa tan thông qua cơ chế tiết ra một số axit hữu cơ và vô cơ, exopolysaccharide hay siderophore [24, 26]. Trong nghiên cứu này, nguồn Pvc được sử dụng để sàng lọc hoạt tính, nhằm hướng chọn lọc các chủng vi khuẩn có tiềm năng trong tạo chế phẩm sinh học có khả năng kết hợp và nâng cao hiệu suất sử dụng phân bón hóa học chứa thành phần Pvc cho cây trồng. Đạm và lân được coi là nguồn dinh dưỡng quan trọng nhất cho thực vật. Qua sàng lọc, 9 chủng vi khuẩn hòa tan lân đã được phân lập từ các mẫu đất vùng rễ cây nghệ thu tại vùng chuyên canh, trong đó có 7 chủng có khả năng phát triển trên môi trường Burk’s 56 (môi trường không chứa đạm). Như vậy, đây có thể là các chủng vi khuẩn tiềm năng với khả năng cố định đạm và hòa tan lân (Bảng 3.6). Các chủng vi khuẩn chọn lọc được ở bước sàng lọc khả năng hoà tan Pvc tiếp tục được khảo sát và đánh giá khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA. Kết quả sàng lọc (Bảng 3.6) cho thấy, tất cả 9 chủng thí nghiệm đều biểu hiện hoạt tính sinh IAA với mức độ khác nhau, đặc trưng cho các vi khuẩn PGPR. Bảng 3. 7. Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm bệnh thực vật của các chủng vi khuẩn dựa trên đường kính vòng vô khuẩn (D-d, mm). STT Ký hiệu chủng Đường kính vòng phân giải với vi sinh vật kiểm định (D-d, mm) A. niger F. oxysporum 1 PGP-V2 0 0 2 PGP-V4 0 0 3 PGP-V5 2 1,5 4 PGP-V15 0 0 5 PGP-V18 2 0 6 PGP-V20 0 0 7 PGP-V21 9 3 8 PGP-V22 0 0 9 PGP-V24 0 0 Các PGPR giúp thực vật sinh trưởng trực tiếp bằng cách hỗ trợ hấp thu dưỡng chất như đạm, lân và các khoáng chất thiết yếu, hoặc làm tăng các phytohormones, hoặc gián tiếp bằng cách ức chế các tác nhân gây bệnh. Để tìm hiểu thêm về tác động kích thích gián tiếp của các chủng vi khuẩn PGPR lựa chọn, chúng tôi thực hiện xác định khả năng kháng nấm bệnh thực vật in vitro dựa trên sự ức chế sự hình thành sợi nấm A. niger và F. oxysporum trên đĩa thạch. Kết quả thử nghiệm cho thấy, trong số các chủng thử nghiệm, Bacillus sp. PGP-V21 là chủng vi khuẩn duy nhất biểu hiện hoạt tính kháng cả hai chủng nấm kiểm định (thuộc A. niger và F. oxysporum) với đường kính vòng phân giải lần lượt là 9 và 3 mm. Chủng PGP-V5 và PGP-V18 cũng biểu hiện hoạt tính kháng 57 nấm A. niger, tuy nhiên đường kính vòng kháng khuẩn tương đối nhỏ và không đáng kể (Bảng 3.7)