Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính gây độc tế bào của loài pilea aff. martinii (h.lév.) hand.- Mazz., boehmeria holosericea blume, anacolosa poilanei gagnep

ỏ F10.7 (700 mg) đƣợc tiến hành sắc kí cột silica gel với hệ dung môi Bột lá cây Pilea aff. martinii (40kg) Cặn MeOH (5kg) Dịch EtOAc Dịch nước Cặn PM (35,1g) 1. MeOH,NH4OH 1%, 60L x4lần 2.Cất loại dung môi 1. Thêm nước (10L), thêm HCl 2N đến pH ~2 2. Chiết bằng EtOAc, 20Lx5 lần 1. Thêm NH4OH đến pH ~8- 9 2. Chiết bằng EtOAc, 20Lx5 lần 3. Cất loại dung môi 41 n-hexane/acetone (gradient) thu đƣợc phân đoạn F10.7.3 có khối lƣợng 18 mg. Tiếp tục tinh chế F10.7.3 bằng PTLC với hệ dung môi n-hexane/acetone (7/3, v/v) thu đƣợc 5 mg chất rắn màu vàng, kí hiệu là PM6. Phân đoạn F11 (2 gam) đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/EtOAc (gradient) thu đƣợc 3 phân đoạn nhỏ kí hiệu F11.1-F11.3. Tinh chế phân đoạn nhỏ F11.1 (20 mg) bằng PTLC với hệ dung môi n-hexane/acetone (6/4, v/v) thu đƣợc 4 mg chất rắn màu vàng, kí hiệu PM9. Tinh chế phân đoạn F13 (10 gam) bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/EtOAc (gradient) thu đƣợc thu đƣợc 12 phân đoạn nhỏ kí hiệu F13.1-F13.12). Tinh chế phân đoạn nhỏ F13.1 (26 mg) bằng PTLC với hệ dung môi n-hexane/EtOAc (6/4, v/v) thu đƣợc 6 mg chất rắn màu vàng, kí hiệu PM8. Quá trình phân tách cặn chiết PM đƣợc thể hiện ở sơ đồ Hình 3.2. 42 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các chất từ loài Pilea aff. martinii. F1 PM5 20 mg PM6 5 mg F10.1.2 30 mg PTLC H/A (7/3) PTLC H/A (7/3) CC, H/A (grad) F10.7.3 18 mg CC, H/A (grad) F10.7 100 mg F10.1 70 mg CC, H/E (grad) PM8 6 mg PM9 4 mg mg F13.1 26 mg CC, H/E (grad) CC, H/E (grad) F11.1 20 mg PTLC H/A (6/4) PTLC H/A (6/4) PM1 6 mg PM2 4 mg PM3 5 mg PM4 5 mg PM7 4 mg PTLC H/E (8/2) F14- F15 F2 354 mg F3 F4 320 mg F5-F9 F10 3 gam F11 2 gam F13 10 gam F2.2 20,0mg F4.2 7 mg F4.3 8 mg F4.4 12 mg CC, H/E (grad) CC, H/E (grad) PTLC H/E (8/2) PTLC H/E (8/2) PTLC H/E (7/3) PM 35,1 gam CC, H/E (grad) A: acetone; D: CH2Cl2 E: EtOAc; M: MeOH H: n-hexane; grad.: gradient 43 3.1.2 Hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ lá loài Pilea aff. martinii  Hợp chất PM1: Pileamartine A (chất mới) Chất rắn màu trắng; đnc. 184-186oC; độ quay cực -141,2 o (c 0,33; CHCl3); FT-IR νmax (cm -1 ): 2945, 2833, 1649, 1506, 1454, 1418, 1018; ESI-HRMS: m/z 380,2247 [M+H] + (tính toán theo lí thuyết cho công thức [C24H30NO3] + , 380,2226); CD (ACN): λmax (Δε) 221 (+0,89), 234 (-11,58), 244 (+5,13), 286 (-10,21); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz), 13 C NMR (CDCl3, 125 MHz): Xem Bảng 4.1 (trang 57).  Hợp chất PM2: Pileamartine B (chất mới) Chất rắn màu trắng; độ quay cực -124,8 o (c 0,077; CHCl3); ESI-HRMS: m/z 366,2089 [M+H] + (tính toán lí thuyết cho công thức [C23H28NO3] + , 366,2069); CD (ACN): λmax (Δε) 232 (-6,93), 250 (+0,38), 285 (-0,81); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz), 13 C NMR (CDCl3, 125 MHz): Xem Bảng 4.2 (trang 63).  Hợp chất PM3: 1,3,6,6-tetramethyl-5,6,7,8-tetrahydro-isoquinolin-8-one Chất rắn màu vàng; đnc. 33-36oC; FT-IR νmax (cm -1 ): 3393, 2957, 2870, 1680, 1587, 1555, 1431, 1369, 1248, 1028; 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm) 6,87 (1H, s, H-4); 2,76 (2H, s, H-5); 2,49 (2H, s, H-7); 2,51 (3H, s, CH3-9); 2,82 (3H, s, CH3-10); 1,05 (6H, s, CH3-11, CH3-12); 13 C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ (ppm) 160,9 (C-1); 160,4 (C-3); 121,7 (C-4); 152,6 (C-4a); 54,3 (C-5); 32,9 (C-6); 44,0 (C-7); 198,8 (C-8); 123,5 (C-8a); 24,6 (C-9); 26,0 (C-10); 28,0 (C-11, 12).  Hợp chất PM4: Julandine Chất rắn màu vàng; đnc. 132-134oC; độ quay cực +6 o (c 1,5; CHCl3); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz), 13 C NMR (CDCl3, 125 MHz): Xem Bảng 4.3 (trang 68).  Hợp chất PM5: Pileamartine C (chất mới) 44 Chất rắn màu vàng; đnc. 117-120oC; độ quay cực -31 o (c 0,34; acetone); FT-IR νmax (cm -1 ): 3331, 2943, 2832, 1663, 1450, 1416, 101; ESI-HRMS: m/z 378,2053 [M+H] + (tính toán lí thuyết cho công thức [C24H28NO3] + , 378,2069); CD (ACN): λmax (Δε) 232 (+24), 270 (-12); 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz), 13 C NMR (CDCl3, 125 MHz): Xem Bảng 4.4 (trang 70).  Hợp chất PM6: Pileamartine D (chất mới) Chất rắn màu vàng; đnc. 194-196oC; độ quay cực -18 o (c 0,05; CH3OH); FT-IR νmax (cm -1 ): 2926, 2853, 1969, 1611, 1512, 1468, 1420, 1261, 1202, 1171, 1040; ESI-HRMS: m/z 364,1928 [M+H] + (tính toán lí thuyết cho công thức [C23H26NO3] + , 364,1913); CD (ACN): λmax (Δε) 231 (+11), 270 (-2); 1 H NMR (CDCl3+CD3OD, 500 MHz), 13 C NMR (CDCl3+CD3OD, 125 MHz): Xem Bảng 4.5 (trang 76). Hợp chất PM7: Cryptopleurine Chất rắn màu vàng; đnc. 196-198oC; độ quay cực +96 o (c 0,38; CHCl3); FT-IR νmax (cm -1 ): 1649, 1554, 1539, 1519, 1508; 1 H NMR (CDCl3+CD3OD, 500 MHz), 13 C NMR (CDCl3+CD3OD, 125 MHz): Xem Bảng 4.6 (trang 82). Hợp chất PM8: Pileamartine E (chất mới) Chất dầu màu vàng; độ quay cực +145 o (c 0,3; CH3OH); FT-IR νmax (cm -1 ): 3375, 2937, 2860, 1732, 1663, 1514, 1452, 1387, 1269, 1165, 1126, 1032; ESI-HRMS: m/z 234,1493 [M+H] + (tính toán lí thuyết cho công thức [C14H20NO2] + , 234,1494); CD (ACN): λmax (Δε) 260 (+0,6), 285 (-0,7), 310 (+1,6); 1 H NMR (CD3OD, 500 MHz), 13 C NMR (CD3OD, 125 MHz): Xem bảng 4.7 (trang 85).  Hợp chất PM9: Quinine 45 Chất rắn màu trắng; 1 H NMR (CD3OD, 500 MHz): δ (ppm) 3,20 (1H, dd, J = 3,5; 10 Hz, H-2α); 2,76- 2,80 (1H, m, H-2); 2,40-2,47 (1H, m, H-3); 1,86 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-4); 1,63- 1,68 (1H, m, H-5α); 1,90-1,95 (1H, m, H-5); 2,78-2,84 (1H, m, H-6α); 3,72-3,80 (1H, m, H-6); 1,49-1,53 (1H, m, H-7α); 1,93-2,00 (1H, m, H-7); 3,18-3,23 (1H, m, H-8); 5,67 (1H, s, H-9); 5,79 (1H, ddd, J = 3,0; 7,0; 10,0 Hz; H-10); 5,03 (1H, dd, J = 1,5; 17,0 Hz; H-11α); 4,96 (1H, dd, J = 1,5; 10,0 Hz; H-11); 8,68 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-2’); 7,71 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-3’); 7,44 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5’); 7,46 (1H, dd, J = 2,5, 9,0 Hz; H-7’); 7,97 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-8’); 4,00 (1H, s, 6’- OCH3). 13 C NMR (CD3OD, 125 MHz): δ (ppm) 57,3 (C-2); 40,7 (C-3); 29,3 (C-4); 27,8 (C-5); 44,2 (C-6); 21,6 (C-7); 60,2 (C-8); 71,8 (C-9); 142,4 (C-10); 115,2 (C- 11); 148,2 (C-2’); 120,2 (C-3’); 150,2 (C-4’); 128,1 (C-4’a); 102,5 (C-5’); 159,8 (C- 6’); 123,3 (C-7’); 131,4 (C-8’); 144,8 (C-8’a); 56,5 (6’-OCH3). 3.1.3 Xử lý mẫu thực vật và phân lập các chất từ loài Boehmeria holosericea Bột quả cây B. holosericea (3,8 kg) đƣợc ngâm chiết với methanol ở nhiệt độ phòng (có bổ sung 1%NH4OH) trong 24 giờ (2 L x 5 lần). Các dịch chiết đƣợc gộp lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc 216 gam cặn MeOH. Hòa tan cặn MeOH vào nƣớc (1L), acid hóa bằng dung dịch HCl 2N đến pH=2 và chiết phân bố với EtOAc (1Lx3 lần) thu đƣợc phần dịch EtOAc và phần dịch nƣớc có alkaloid. Phần dịch nƣớc đƣợc bổ sung dung dịch NH4OH đến pH~9. Sau đó chiết phân bố với EtOAc (1Lx3 lần) thu đƣợc phần dịch chiết EtOAc. Tiến hành cô cạn dịch chiết EtOAc dƣới áp suất giảm thu đƣợc 20,2 gam cặn tổng alkaloid, kí hiệu là cặn BH. Quá trình chiết alkaloid tổng từ quả cây B. holosericea đƣợc trình bày trong sơ đồ Hình 3.3. Cặn BH đƣợc hòa tan bằng dichloromethane, tẩm với silica gel, trộn đều, cất loại dung môi, nghiền mịn, đƣa lên cột sắc kí silica gel với hệ dung môi rửa giải EtOAc/MeOH (gradient từ 0-100% MeOH). Thu đƣợc 9 phân đoạn kí hiệu từ F1- 46 F9. Quá trình sắc kí đƣợc theo dõi bằng TLC, hiện màu với thuốc thử Dragendofft và Ce(SO4)2. Phân đoạn F3 (2,54 gam) đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc (gradient) thu đƣợc 3 phân đoạn nhỏ, kí hiệu F3.1- F3.3. Phân đoạn nhỏ BH3.1 (200 mg) đƣợc tinh chế bằng cột Sephadex với dung môi MeOH thu đƣợc ba phân đoạn nhỏ kí hiệu F3.1.1 - F3.1.3. Tinh chế F3.1.1 (16 mg) bằng PTLC với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (8/2, v/v) thu đƣợc 5 mg chất rắn màu trắng BH2. Phân đoạn F5 (630g) đƣợc tinh chế bằng cột Sephadex với dung môi MeOH thu đƣợc ba phân đoạn nhỏ kí hiệu F5.1 - F5.3. F5.2 (380 mg) đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi EtOAc/MeOH (gradient) thu đƣợc 4 phân đoạn nhỏ, kí hiệu F5.2.1-F5.2.4. Phân đoạn nhỏ F5.2.1 (160 mg) tiếp tục đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi EtOAc/MeOH (gradient) thu đƣợc F5.2.1.1 (30 mg), tiếp tục phân tách bằng PTLC với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (8/2, v/v) thu đƣợc chất BH1 (5 mg). Phân đoạn F6 (590 mg) đƣợc tinh chế bằng sắc kí silica gel với dung môi EtOAc/MeOH (gradient) thu đƣợc 4 phân đoạn nhỏ, kí hiệu F6.1-F6.4. Phân đoạn nhỏ F6.2 (80 g) đƣợc tinh chế bằng cột Sephadex với dung môi MeOH thu đƣợc 3 chất BH3 (5 mg), BH4 (6 mg), BH5 (4 mg). Quá trình phân lập các chất từ cặn chiết BH đƣợc thể hiện ở sơ đồ Hình 3.4. Hình 3.3 Sơ đồ thu nhận alkaloid tổng từ quả cây B. holosericea. Dịch EtOAc Dịch nước Cặn BH (20,2 gam) 1. MeOH,NH4OH 1% (2L x5 lần) 2. Cất loại dung môi 1. Thêm nước (1L), thêm HCl 2N đến pH ~ 2 2. Chiết bằng EtOAc (1Lx3 lần) 1.Thêm NH4OH đến pH ~9 2. Chiết bằng EtOAc (1Lx3 lần) 3. Cất loại dung môi Bột quả B. holosericea (3,8kg) Cặn MeOH (216 gam) 47 Hình 3.4 Sơ đồ phân lập các chất từ loài Boehmeria holosericea. 3.1.4 Hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ quả loài Boehmeria holosericea  Hợp chất BH1: Ruspolinone Chất rắn màu vàng; đnc. 112-114oC; ESI-MS : m/z 250 [M+H] + ; 1 H NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 3,10-3,14 (1H, m, H-2); 1,48-1,50 (2H, m, Ha-4, Ha-3); 1,80-1,85 (1H, m, Hb-3); 1,63-1,67 (1H, m, Hb-4); 1,29-1,31 (1H, m, Ha-5); 1,71-1,76 (1H, m, Hb-5); 2,69-2,73 (1H, m, Ha-6); 3,05-3,09 (1H, m, Hb-6); 7,56 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-9); 7,06 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-12); 7,71 (1H, dd, J = 2,5; 8,5 Hz, H-13); 3,90 (3H, s, 10-OCH3); 3,93 (3H, s, 11-OCH3). Se, MeOH PTLC, D/M (8/2) PTLC, D/M (8/2) CC, E/M ( grad) BH 20,2 gam F3.1 200 mg BH2 5 mg F3.1.1 16 mg F1-F2 F3 2,54 gam F4 F5 630 mg BH1 5 mg F5.2 380 mg F6.2 80 mg F5.2.1 160 mg F5.2.1.1 30 mg F6 590 mg BH3 5 mg F7-F9 BH4 6 mg BH5 4 mg CC, D/E ( grad) CC, E/M (grad) CC, EtOAc/MeOH( grad) D: CH2Cl2 E: EtOAc M: MeOH grad: gradient Se: sephadex Se, MeOH Se, MeOH Se, MeOH 48 13 C NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 54,3 (C-2); 25,3 (C-3); 26,2 (C-4); 32,7 (C-5); 47,3 (C-6); 199,8 (C-7); 131,3 (C-8); 111,5 (C-9); 150,4 (C-10); 155,2 (C-11); 111,8 (C-12); 124,6 (C-13); 56,6 (10-OCH3); 56,5 (11-OCH3).  Hợp chất BH2: Benzyl -D-glucoside Chất rắn màu trắng; đnc. 116-118oC; độ quay cực -50,3 o (c 0,5; MeOH); ESI-MS: m/z 271 [M+H] + ; 1 H NMR (CD3OD, 500 MHz), 13 C NMR (CD3OD, 125 MHz): Xem Bảng 4.8 (trang 91).  Hợp chất BH3: Adenine Chất rắn màu trắng; ESI-MS: m/z 136 [M+H] + ; 1 H NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 8,13 (1H, s, H-2); 8,20 (1H, s, H-8).  Hợp chất BH4: Adenosine Chất rắn màu trắng; đnc. 230-233oC; ESI-MS: m/z 268 [M+H] + ; 1 H NMR (CD3OD, 500 MHz), 13 C NMR (CD3OD, 125 MHz): Xem Bảng 4.9 (trang 93).  Hợp chất BH5: Uridine Chất rắn màu trắng; . 163-165oC; ESI-MS: m/z 245 [M+H] + ; 1 H NMR (CD3OD, 500 MHz), 13 C NMR (CD3OD, 125 MHz): Xem Bảng 4.10 (trang 94). 3.2 PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ LOÀI ANACOLOSA POILANEI, HỌ OLACACEAE 3.2.1 Xử lý mẫu thực vật và phân lập các chất Một lƣợng nhỏ mẫu lá, quả, vỏ cây các loài A. poilanei đã đƣợc chiết ethyl acetate và thử sàng lọc hoạt tính với dòng tế bào ung thƣ biểu mô (KB). Kết quả cho thấy các cặn chiết thu đƣợc từ bộ phận vỏ cây thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cao 49 hơn các bộ phận còn lại. Kết quả này giúp cho quá trình nghiên cứu tiếp theo tập trung vào cặn ethyl acetate vỏ cây A. poilanei. Mẫu vỏ cây A. poilanei (1,18 kg) đƣợc ngâm chiết với ethyl acetate ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ (2,5 lít x 3 lần). Các dịch chiết đƣợc gộp lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc 55,3g cặn chiết ethyl acetate (kí hiệu AP). Quá trình ngâm chiết mẫu thực vật đƣợc trình bày trong Hình 3.5. Từ 55,3 gam cặn AP, tiến hành phân tách bắng sắc kí cột silicagel với hệ dung môi n-hexane/EtOAc (gradient từ 0-100% EtOAc) thu đƣợc 13 phân đoạn kí hiệu F1-F13. Phân đoạn F6 (1,2 gam) đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/CH2Cl2 (gradient) thu đƣợc 15 mg chất AP2. Phân đoạn F8 (1,3 gam) đƣợc tinh chế bằng cột Sephadex với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (1/9, v/v) thu đƣợc 3 phân đoạn nhỏ kí hiệu F8.1-F8.3. Phân đoạn nhỏ F8.2 (640 mg) đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2/MeOH (gradient) thu đƣợc các phân đoạn nhỏ F8.2.1 (25 mg) và F8.2.2 (40 mg). Kết tinh lại F8.2.1 trong EtOAc thu đƣợc 16 mg chất sạch, kí hiệu AP3. Phân đoạn nhỏ F8.2.2 đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột silica gel, hệ dung môi n-hexane/EtOAc (gradient) thu đƣợc 16,1 mg chất sạch, kí hiệu là AP1. Phân đoạn F9 (2,02 gam), đem rửa nhiều lần bằng dung môi CH2Cl2 và kết tinh lại trong EtOH thu đƣợc 15 mg chất rắn ở dạng bột, màu trắng, kí hiệu là AP6. Phân đoạn F10 (5 gam) đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n- hexane/EtOAc/MeOH (gradient) thu đƣợc 7 phân đoạn nhỏ kí hiệu F10.1-F10.7. Phân đoạn F10.5 (350 mg) tiếp tục đƣa lên cột sắc ký Sephadex với dung môi MeOH, sau đó phân đoạn F10.5.2 (60 mg) chứa vệt chất chính đƣợc tinh chế lại trên cột silicagel nhỏ, hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc (9/1, v/v) thu đƣợc 15 mg chất sạch ở dạng bột, màu vàng, kí hiệu là AP4. Phân đoạn nhỏ F10.2 đƣợc tinh chế bằng cột Sephadex với dung môi MeOH thu đƣợc 5 phân đoạn nhỏ, kí hiệu F10.2.1-F10.2.5. Phân đoạn nhỏ F10.2.2 đƣợc rửa với hệ dung môi n-hexane/CH2Cl2 thu đƣợc 14,5 mg chất sạch ở dạng bột, màu vàng, kí hiệu là AP5. Phân đoạn F12 đƣợc tinh chế bằng sắc kí cột silica gel, hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (gradient), thu đƣợc 15 mg chất 50 sạch ở dạng bột, màu vàng, kí hiệu là AP7. Quá trình phân lập các chất từ cặn AP đƣợc mô tả trong Hình 3.6. Hình 3.5 Sơ đồ ngâm chiết vỏ cây Anacolosa poilanei. Hình 3.6 Sơ đồ phân lập các chất từ loài A. poilanei. AP6 15 mg F8.2 640 mg F9 2,02gam F10 5 gam F7 CC, D/M, grad CC,Se, M/D ( 9/1) Rửa CH2Cl2 KT, EtOAc CC, Se, MeOH CC, D/M (grad) KT, EtOAc CC H/E/M (grad) F8 1,3 gam F8.2.1 25 mg F8.2.2 40 mg F10.2.2 28 mg AP4 15 mg AP5 14,5 mg F10.2 150 mg F10.5 350 mg AP7 15 mg F10.5.2 60 mg AP2 15 mg F1-F4 F6 1,2 gam CC, H/E (grad) F11 F12 4 gam F13 AP3 16, mg AP1 16,1 mg CC, D/M (grad) AP 55,3 gam CC, H/D (grad) D: CH2Cl2, E: EtOAc H: n-hexane, M: MeOH Grad: gradient, KT: kết tinh Se: Sephadex CC, H/E (grad) CC, Se, MeOH CC, D/E, grad Bột vỏ cây A. poilanei (1,18 kg) Dịch chiết EtOAc Bã Ngâmchiết với EtOAc 2,5 Lx3 lần Cặn AP (55,37 gam) Cât loại dung môi 51 3.2.2 Hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất đƣợc phân lập từ vỏ cây Anacolosa poilanei  Hợp chất AP1: Acid 3α-p-coumaroyl-D:A-friedo-oleanane-27-oic (chất mới) Chất bột màu trắng; đnc. 189-191oC; độ quay cực +21 o (c 0,21; CH3Cl); FT-IR νmax (cm -1 ): 3325, 1695, 1649, 1557, 1508, 1454, 1020; ESI-HRMS: m/z 605,4165 [M+H] + (tính toán theo lí thuyết cho công thức [C39H57O5] + , 605,4206); 1 H NMR (CDCl3, 500MHz), 13 C NMR (CDCl3, 125MHz): Xem Bảng 4.11 (trang 98).  Hợp chất AP2: Acid trichadenic A Chất bột màu trắng; đnc. 302-304oC; độ quay cực + 30 o (c 0,14; CHCl3); FT-IR νmax (cm -1 ): 3670, 2949, 1715, 1557, 1506, 1454, 1020; ESI-MS : m/z 457 [M-H] - ; 1 H NMR (CDCl3+CD3OD, 500 MHz): δ (ppm) 3,26 (1H, dt, J = 5,0 Hz; 11,0Hz, H-3); 0,83 (3H, d, J = 9,0 Hz, CH3-23 ); 0,72 (3H, s, CH3-24); 0,81 (3H, s, CH3-25); 0,90 (3H, s, CH3-26); 1,12 (3H, s, CH3-28); 1,10 (3H, s, CH3- 29); 0,94 (3H, s, CH3-30). 13 C NMR (CDCl3+CD3OD, 125 MHz): δ (ppm) 19,5 (C-1); 35,6 (C-2); 72,0 (C-3); 52,8 (C-4); 37,1 (C-5); 41,1 (C-6); 18,0 (C-7); 52,8 (C-8); 37,7 (C- 9); 59,9 (C-10); 37,8 (C-11); 27,8 (C-12); 54,5 (C-13); 39,1 (C-14); 32,9 (C- 15); 35,8 (C-16); 30,5 (C-17); 43,1 (C-18); 36,3 (C-19); 28,3 (C-20); 32,5 (C- 21); 38,0 (C-22); 9,7 (C-23); 14,0 (C-24); 18,0 (C-25); 19,5 (C-26); 179,7 (C- 27); 31,0 (C-28); 30,6 (C-29); 35,1 (C-30).  Hợp chất AP3: Acid trichadonic Chất bột màu trắng; đnc. 249-252oC; độ quay cực +5,3 o (c 1,5; CHCl3); FT-IR νmax (cm -1 ): 3746, 3671, 3645, 2949, 1715, 1649, 1555, 1506, 1456, 1394; ESI-MS : m/z 455 [M-H] - ; 52 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz), 13 C NMR (CDCl3, 125 MHz): Xem Bảng 4.12 (trang 102).  Hợp chất AP4: Acid 3α-(3,4-dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo- oleanan-27-oic (chất mới) Chất bột màu vàng nhạt; đnc. 245-247oC; độ quay cực +20,5 o (c 0,3; CH3OH); FT-IR νmax (cm -1 ): 3360, 2974, 2943, 1683, 1649, 1555, 1508, 1454, 1024; ESI-HRMS: m/z 619,4042 [M-H] - (tính toán theo lí thuyết cho công thức [C39H55O6] - , 619,3999); 1 H NMR (CDCl3, 500MHz), 13 C NMR (CDCl3, 125MHz): Xem Bảng 4.13 (trang 104).  Hợp chất AP5: 3α-(3,4-dihydroxycinnamoyl)-D:A-friedo-oleanan- 27,15-α-lactone (chất mới) Chất bột màu vàng; đnc. 291-293oC; độ quay cực +33 o (c 0,12; CH3OH); FT-IR νmax (cm -1 ): 3321, 2974, 2832, 1649, 1539, 1506, 1452, 1022; ESI-HRMS: m/z 619,4004 [M+H] + (tính toán theo lí thuyết cho công thức [C39H55O6] + , 619,3999); 1 H NMR (CDCl3+ CD3OD, 500 MHz), 13 C NMR (CDCl3+ CD3OD, 125 MHz): Xem Bảng 4.14 (trang 111).  Hợp chất AP6: β-sitosterol Chất bột màu trắng; đnc. 140-142oC; 1 H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm) 3,48-3,52 (1H, m, H-3); 5,35 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-6); 0,68 (3H, s, CH3-18); 1,01 (3H, s, CH3-19); 0,92 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-21); 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-26); 0,83 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-27); 0,85 (3H, t, J = 7,0 Hz, CH3-29). 13 C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ (ppm) 37,3 (C-1); 31,7 (C-2); 71,8 (C-3); 42,3 (C-4); 140,8 (C-5); 121,7 (C-6); 31,9 (C-7); 31,9 (C-8); 50,2 (C-9); 36,5 (C-10); 21,1 (C-11); 39,8 (C-12), 42,4 (C-13); 56,8 (C-14); 24,3 (C-15); 28,3 (C-16); 56,1 (C-17); 12,0 (C-18); 19,8 (C-19); 36,2 (C-20); 18,8 (C-21); 34,0 (C-22); 26,1 (C-23); 45,9 (C-24); 29,2 (C-25); 19,1 (C-26); 19,4 (C-27); 23,1 (C-28); 12,0 (C-29). 53  Hợp chất AP7: Amentoflavone Chất bột màu vàng; đnc. 260-261oC; ESI-MS : m/z 539 [M+H] + ; FT-IR νmax (cm -1 ): 3340, 2974, 2831, 1649, 1557, 1454, 1418, 1024; 1 H NMR (CD3OD, 500 MHz), 13 C NMR (CD3OD, 125 MHz): Xem Bảng 4.15 (trang 116). 3.3 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC Hoạt tính gây độc tế bào của các cặn chiết EtOAc lá cây Pilea aff. martinii, quả cây Boehmeria holosericea, vỏ cây Anacolosa poilanei và một số hợp chất phân lập từ các loài thực vật trên 4 dòng tế bào ung thƣ thử nghiệm (KB, Hep-G2, LU-1, MCF-7) đƣợc thử nghiệm tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các dòng tế bào ung thử thử nghiệm bao gồm: KB-ung thƣ biểu mô (CCL-17 TM ); Hep G2- ung thƣ gan (HB-8065TM); LU-1-tế bào ung thƣ phổi (HTB- 57 TM ) và MCF-7-tế bào ung thƣ vú (HTB-22TM). Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào đƣợc trình bày cụ thể trong Bảng 4.16 (trang 118), Bảng 4.17 (trang 119). 54 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC LOÀI PILEA AFF. MARTINII Từ cặn tổng alkaloid PM lá loài P. aff. martinii thu đƣợc từ sơ đồ quy trình chiết trong Hình 3.1, bằng các phƣơng pháp sắc ký cột silica gel, cột Sephadex, sắc ký lớp mỏng điều chế, chúng tôi phân lập đƣợc 9 alkaloid (PM1-PM9), cấu trúc của các chất đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phổ 1D-NMR, 2D-NMR, ESI-HRMS, ESI-MS, CD, đồng thời so sánh với các tài liệu đã công bố trƣớc đây đối với các hợp chất đã biết. Việc xác định cấu trúc của các hợp chất đƣợc trình bày dƣới đây. 4.1.1 Hợp chất pileamartine A (PM1) (chất mới) .Hình 4.1 Cấu trúc hóa học và một số tương tác trên phổ COSY, HMBC của PM1. Hợp chất PM1 đƣợc tách ra dƣới dạng chất rắn màu trắng, đnc. 184-186oC, -141,2 o (c 0,33; CHCl3). Hiện màu vệt chất trên TLC với thuốc thử Dragendorff cho màu da cam đậm. Trên phổ hồng ngoại của hợp chất PM1 có dải hấp thụ đặc trƣng của liên kết C-H 2945-2833 cm-1 và nhóm C=C của vòng thơm trong vùng νmax 1649-1418 cm -1 . Phổ ESI-HRMS của PM1 (Hình 4.2) xuất hiện pic ion giả phân tử [M+H]+ tại m/z 380,2247 (tính toán theo lí thuyết cho công thức C24H30NO3, 380,2226). Cùng với dữ liệu phổ 13 C NMR, cho phép xác định công thức phân tử của PM1 là C24H29NO3. Trên phổ 1H NMR của PM1, ở vùng trƣờng thấp có tín hiệu của 2 proton thơm dƣới dạng singlet ở δH 6,63 (1H, s); 6,76 (1H, s) và 4 proton dƣới dạng doublet ở δH 7,38 (2H, d, J = 8,5 Hz); 6,82 (2H, d, J = 8,5 Hz). Ngoài ra, còn quan sát thấy tín hiệu cộng hƣởng của các proton vùng aliphatic nằm trong khoảng δH 55 1,19-3,50 và 3 nhóm methoxy ở δH 3,78 (3H, s, OCH3); 3,84 (3H, s, OCH3); 3,89 (3H, s, OCH3) (Bảng 4.1). Hình 4.2 Phổ ESI-HRMS của PM1. Hình 4.3 Phổ 1H NMR giãn rộng của PM1. Phân tích phổ 13C NMR và DEPT (Hình 4.4, 4.5), kết hợp với phổ HSQC (PL-4) cho phép xác nhận sự có mặt của 24 nguyên tử carbon, trong đó có 3 nhóm methoxy ở δC 55,9 (2C) và 55,2; 6 nhóm methine sp 2 ở δC 126,5 (2C); 113,4 (2C); 107,5 và 106,8; 6 nhóm methylene sp 3 ở δC 46,5; 40,0; 37,8; 32,4; 25,9 và 24,4; 2 nhóm methine sp 3 ở δC 59,6; 59,1 và 7 carbon không liên kết với hydro ở δC 157,9; [M+H] + m/z 380,2247 56 148,8; 148,5; 141,1; 137,3; 134,7 và 76,8. Các dữ liệu phổ trên gợi ý sự có mặt hai vòng benzene thế ở vị trí 1,4 và vị trí 1,2,4,5 trong cấu trúc của PM1. Độ chuyển dịch hoá học của các nguyên tử carbon C-4′ (δC 148,8); C-5′ (δC 148,5) và C-4″ (δC 157,9) cho phép giả thiết chúng liên kết với oxy, trong khi các nguyên tử cacbon C-2 (δC 46,5); C-6 (δC 59,6) và C-9 (δC 76,8) đƣợc dự đoán liên kết liên kết của chúng với nguyên tử nitơ, dữ liệu phổ khối lƣợng cũng gợi ý trong PM1 có số lẻ nguyên tử nitơ trong phân tử. Hình 4.4 Phổ 13C NMR của PM1. Hình 4.5 Phổ DEPT của PM1. 57 Bảng 4.1 Số liệu phổ NMR của PM1 C C a,b H a,c , mult. (J, Hz) C C a,b H a,c , mult. (J, Hz) 2 46,5 2,19 ddd (3,3; 11,0; 11,0) 2,77 br.d (11,0) 4’ 148,8 3 25,9 1,60-1,67 m 5’ 148,5 4 24,4 1,19-1,21 m 1,77-1,80 m 6’ 106,8 6,76 s 5 32,4 1,23-1,29 m 1,80-1,83 m 1” 141,1 6 59,6 2,37-2,42 m 2” 126,5 7,38 d (8,5) 7 40,0 1,78-1,82 m 3” 113,4 6,82 d (8,5) 8 59,1 3,27 dd (2,5; 8,0) 4” 157,9 9 76,8 5” 113,4 6,82 d (8,5) 10 37,8 2,94 d (17,0) 3,50 d (17,4) 6” 126,5 7,38 d (8,5) 1’ 134,7 4’-OCH3 55,9 3,84 s 2’ 137,3 5’-OCH3 55,9 3,89 s 3’ 107,5 6,63 s 4”-OCH3 55,2 3,78; s a đo trong CDCl3, b 125 MHz, c 500 MHz. Các mảnh cấu trúc phân tử (liên kết đậm trên Hình 4.1) đƣợc thiết lập nhờ phân tích phổ COSY. Phổ COSY cho phép xác định 2 chuỗi tƣơng tác spin-spin giữa H-2’’, H-6’’/H-3’’, H-5’’và H-8/CH2-7/H-6/CH2-5/CH2-4/CH2-3/CH2-2 (Hình 4.6). 58 Hình 4.6 Phổ COSY của PM1. Các mảnh cấu trúc này sau đó đƣợc kết nối bằng phân tích dữ liệu phổ HMBC (Hình 4.7, 4.8). Sự có mặt của vòng A đƣợc xác định nhờ tƣơng tác của H- 3’ với C-1’, C-5’ và C-8 cũng nhƣ H-6’ với C-2’, C-4’ và C-10 trên phổ HMBC. Ngoài ra, các nhóm methoxy tại δH 3,84 và 3,89 cho tƣơng tác tƣơng ứng với C-4’ và C-5’, cho thấy C-4’ và C-5’ liên kết với nhóm methoxy. Tƣơng tự, vòng benzene thế 1,4 (vòng E) với nhóm methoxy tại C-4’’ cũng đã đƣợc nhận diện nhờ các tƣơng tác HMBC. Các tƣơng tác HMBC của H-3’và H-6’ tƣơng ứng với C-8 và C-10; CH2-10 với C-8 và C-9 chỉ ra sự có mặt của hệ vòng tiếp giáp A/B. Mặt khác, tƣơng tác của C-9 với proton H-2’’ và H6’’ cho thấy vòng E liên kết với C-9 tại vị trí C- 1’’ của vòng E. Cuối cùng, hệ dị vòng indolizidine C/D đƣợc thiết lập nhờ tƣơng tác HMBC của C-9 với CH2-7; C-6 với CH2-2. Từ các phân tích trên, khung cấu trúc của hợp chất PM1 đã đƣợc xác định. H-4β H-8 H-2β H-6 H-2 H-5β H-7 H-5 H-3 H-10β H-10 H-4 59 Hình 4.7 Phổ HMBC của PM1. Hình 4.8 Phổ HMBC của PM1 (tiếp). H-6’ H-3’ C-8 C-10 C-9 H-2”,6” H-10β H-10 C-9 C-6 C-8 H-7 C-5 H-2β H-2 60 Cấu hình tƣơng đối của hợp chất PM1 đƣợc xác định nhờ phân tích phổ ROESY (Hình 4.9). Trên phổ ROESY của PM1 cho thấy tƣơng tác giữa H-2ax (δH 2,19) với H-6 (δH 2,37-2,42) và H-10 (δH 3,50) (Hình 4.9), cho phép xác định H-6 chiếm giữ vị trí axial đối với vòng D. Tƣơng tác giữa proton thơm H-2″, H-6″ (δH 7,38) với H-8 (δH 3,27) và Heq-2 (δH 2,77) cho phép xác định H-8 và vòng E ở cùng phía. Từ đó, cho thấy vòng B/C tiếp giáp nhau theo dạng cis. Hình 4.9 Phổ ROESY của PM1. Hình 4.10 Một số tương tác ROESY chính của PM1. H-10 H-8 H-2eqH-6 H-2ax H-2”,6”