Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và đa dạng nguồn gen di truyền của một số loài lá kim ở Tây Nguyên, Việt Nam

/ ml. - Sau 3 ngày tế bào được ủ với chất thử, 20 l MTT (5mg / ml) được đưa vào mỗi giếng và ủ tiếp 4 giờ ở 37 oC. Sau khi loại bỏ môi trường nuôi cấy, màu formazal tạo ra được hòa tan trong 100 l DMSO và đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút. Xác định giá trị OD bằng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau: 56 OD (chất thử) x 100 % sống sót = OD (đối chứng âm) % ức chế = 100% - % sống sót - Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 g / ml; 2 g / ml; 0,4 g / ml; 0,08 g / ml. - DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Chất thử nào có IC50 < 20 g / ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50  4 g / ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt TBUT. Các mẫu thử nghiệm được thực hiện tại Phòng thử nghiệm sinh học – Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.5. Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền 2.5.1. Các cặp mồi ISSR và SSR Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu được tham khảo từ các tài liệu [68-86] và được tổng hợp bởi công ty IDT (Intergarated DNA Technology), Hoa Kỳ. Thông tin chi tiết (kí hiệu, trình tự nucleotide, nguồn tham khảo) của các cặp mồi được thể hiện trong Bảng 1.1 và Bảng 1.2. phần Phụ lục I. 2.5.2. Phương pháp nghiên cứu 2.5.2.1. Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số được tách chiết từ lá hoặc vỏ 3 loài Đỉnh tùng, Hoàng đàn giả, Kim giao núi đất bằng phương pháp của Porebski và cộng sự (1997) [87]. Kiểm tra độ sạch trên gel agarose 0,9 % và đo nồng độ DNA tổng số trên máy UVS 2700, Labomed, Hoa Kỳ. 2.5.2.2. Phương pháp nhân bản sản phẩm PCR_ISSR và PCR_SSR Phản ứng nhân bản gen được thực hiện trên máy PCR system 9700 (Hoa Kỳ) với tổng thể tích 25 µl gồm các thành phần: dung dịch đệm PCR 1X; MgCl2 2,5 mM; dNTPs 2 mM; mồi 100 nM; 50ng DNA khuôn và 0,5 đơn vị Taq polymerase. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: biến tính ở 94°C trong 4 phút, tiếp sau là 35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bước: biến tính 94°C trong 1 phút; gắn mồi 50 - 58°C trong 1 phút; 57 (đối với chỉ thị SSR), 46 – 52oC trong 1 phút (đối với chỉ thị ISSR); tổng hợp sản phẩm 72oC trong 1 phút và kết thúc phản ứng ở 72°C trong 10 phút; giữ sản phẩm ở 4°C. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel polyacrylamide 5 % cùng với thang DNA chuẩn 100 bp (của hãng Fermentas) và gel agarose 1,5 % với thang chuẩn 1kb (của hãng Fermentas), sau đó nhuộm ethidium bromide 15 phút và quan sát dưới tia UV. 2.5.2.3. Phân tích số liệu phân tử Các thông số đa dạng di truyền của mỗi loài như: số alen trung bình trên một locus (Na), số alen hiệu quả trên một locus (Ne), phần trăm phân đoạn đa hình (PPB), chỉ số đa dạng di truyền Shannon (I), hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He), hệ số giao phấn cận noãn (Fis) được xác định cho cả chỉ thị ISSR và SSR bằng phần mềm GenAlex 6.3 [88]. Lập biểu đồ hình cây theo phương pháp của Nei (1973) trong phần mềm NTSYS 2.0, version 2.0 [89], giá trị Bootstrap được hỗ trợ bởi phần mềm Win- Boot [90] với số lần lặp lại 1000 lần. Chỉ số đa dạng di truyền (h) theo Nei (1973) của mỗi loài với chỉ thị ISSR và SSR được tính theo công thức: h = ∑pi2 (trong đó pi là tần số của alen thứ i tại locus đó) [91]. 58 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 3.1.1. Hoạt tính sinh học của các dịch chiết 3.1.1.1. Hoạt tính chống oxi hóa Đối với chi Nageia đây là những nghiên cứu đầu tiên về hóa học và hoạt tính sinh học. Vì vậy chúng tôi chọn cả 3 dịch chiết từ lá của loài Kim giao núi đất là n- hexane, ethyl acetate và methanol để thử hoạt tính chống oxi hóa bằng việc đo khả năng triệt tiêu gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Kết quả thể hiện tại (bảng 3.1) cho thấy các dịch chiết này không thể hiện hoạt tính chống oxi hóa. Bảng 3.1. Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của các dịch chiết từ loài Kim giao núi đất. STT Kí hiệu mẫu Nồng độ chất thử trung hòa 50% gốc tự do (DPPH) IC50 (g / ml) 1 Cặn n-hexane >128 2 Cặn EtOAc >128 3 Cặn MeOH >128 Chất tham khảo Quercetin 9,2 3.1.1.2. Hoạt tính gây độc tế bào Trong 3 dịch chiết tổng thu được từ loài Hoàng đàn giả qua việc chấm bản mỏng chúng tôi nhận thấy dịch MeOH đa phần là các chất keo, dịch n-hexane chứa lượng chất ít vì vậy chúng tôi tập trung nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của dịch EtOAc. Tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào của 2 dịch chiết là dịch chiết hoàng đàn giả tổng (HĐT) và dịch chiết EtOAc (HĐE) trên 4 dòng tế bào ung thư là MCF7, LU-1, Hep-G2, KB. Kết quả cho thấy dịch chiết HĐE thể hiện hoạt tính khá với giá trị IC50 = 25,21 – 41,21µg / ml. Dịch chiết HĐT chưa thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư ở các nồng độ thử nghiệm. Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết HTE tổng và dịch chiết HĐE với 4 dòng tế bào ung thư STT Kí hiệu mẫu Hoạt tính gây độc tế bào in vitro IC50 (g/mL) KB Lu-1 HepG2 MCF7 1 Dịch chiết HĐT >100 >100 >100 >100 2 Dịch chiết HĐE 25,16 ± 2,13 29,27 ± 2,66 41,21 ± 4,6 25,21 ± 1,32 3 Ellipticine 0,41 ± 0,05 0,43 ± 0,01 0,46 ± 0,02 0,44 ± 0,06 59 3.1.2. Xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch tách được từ 3 loài lá kim 3.1.2.1. Đỉnh tùng (C. mannii) Từ 1,0 kg lá, cành và 0,5 kg vỏ cây Đỉnh tùng đã phân lập và xác định cấu trúc của 8 hợp chất alkaloid gồm: cephalotaxine (DT1), cephalotaxine-β-N-oxide (DT2), deoxyharringtonine (DT3), nordesoxyharringtonine (DT4), isoharringtonine (DT5.1), norisoharringtonine (DT5.2), 3-epischellhammericine (DT6) và manniicine (DT7) và 3 hợp chất khác là harringtonolide (DT8), epicatechin (DT9) và epigallocatechin (DT10)  Hợp chất DT1: Cephalotaxine. Trên phổ 1H-NMR cho thấy các tín hiệu đặc trưng cho kiểu khung Cephalotaxine gồm: hai tín hiệu cộng hưởng đơn của 2 proton thơm ở vị trí para tại H 6,67 (1H, s, H- 17) và 6,64 (1H, s, H-14), một tín hiệu của proton olefin tại 4,92 (1H, s, H-1), hai tín hiệu doublet có cùng hằng số tách J = 9,0 được gán cho 2 proton nhóm methine vicinal có tương tác tại δH 4,75 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-3) và 3,67 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-4) trong đó tín hiệu cộng hưởng của H-3 bị dịch chuyển về phía trường thấp hơn so với H-4 do C-3 liên kết trực tiếp với nhóm hydroxy (-OH) làm giảm sự chắn tại chỗ, mặt khác dựa vào hằng số tương tác giữa 2 proton H-3 và H-4 có thể khẳng định trong không gian 2 proton này ở vị trí cis với nhau. Tín hiệu cộng hưởng của các proton methylen xuất hiện trong khoảng δH: 1,75-3,35 ppm, riêng 2 proton methylendioxy (H-18a,b) bị chuyển dịch về phía trường thấp tại 5,90 ppm (2H, s, H-18a,b). Một tín hiệu singlet có cường độ mạnh của methoxy tại δH 3,72 (3H, s, H-19). Phổ 13C-NMR và DEPT cho các tín hiệu cộng hưởng phù hợp với phổ 1H-NMR, trên phổ xuất hiện các tín hiệu của 18 nguyên tử carbon gồm 6 nguyên tử carbon bậc 4 tại δC 70,6÷160,6 ppm trong đó có 4 nguyên tử carbon vòng thơm δC 134,2 (C-12), 128 (C-13), 146,9 (C-15), 146,1 (C-16), một carbon olefin tại 160,6 (C-2); 5 nhóm methine cho tín hiệu cộng hưởng tại δC 57,2÷112,6 ppm trong đó có 2 nguyên tử carbon vòng thơm tại δC 112,6 (C14) và 110,3 (C-17), 1 nguyên tử carbon olefin tại δC 97,6 (C-1), hai tín hiệu còn lại được gán cho δC 73,3 (C-3), 57,2 (C-4). Các tín hiệu cộng hưởng của 6 nhóm methylen xuất hiện trong khoảng δC 20,3÷53,8, riêng tín hiệu cộng hưởng của C-18 bị chuyển dịch về phía trường yếu tại 60 100,9 ppm, 1 tín hiệu của carbon nhóm methoxy tại δC 57,2 (C-19). Phổ khối ESI-MS ion dương cho pic giả phân tử tại m / z 316 [M + H]+, kết hợp với dữ liệu trên phổ NMR có thể khẳng định CTPT của DT1 là C18H21NO4. So sánh dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR với dữ liệu đã công bố của chất cephalotaxine [92, 93], cấu trúc của chất DT1 được khẳng định là cephalotaxine. Hợp chất DT1 là thành phần chính (%) của các hợp chất alkaloid thu được từ một số loài của chi Cephalotaxus như C. harringtonia var. drupacea, C. fortunei [12] và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1963 từ loài C. harringtonia var.drupacea [12]. Kết quả nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào cho thấy chất này thể hiện hoạt tính trung bình đối với một số dòng tế bào ung thư ở người như gan (Hep-G2), ung thư biểu mô (KB) và ung thư bạch cầu ở chuột [20]. Bảng 3.3. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất DT1 và Cephalotaxine Nguyên tử C DT1 Cephalotaxine [92-93] δHa,b δCa,c δH*[93] δC*[92] 1 4,92 s 97,6 4,93 s 97,6 2 - 160,5 - 160,5 3 4,75 ( d, J = 9,0 ) 73,3 4,76 (d, J = 9,3 ) 73,2 4 3,67 ( d, J = 9,0 ) 57,2 3,68 (d, J = 9 ,3 ) 57,1 5 - 70,6 - 70,5 6 2,00 (m, H-6a) 43,5 1,95-2,08 (m) 43,6 1,86 (m, H-6b) 7 1,75 (m) 20,3 - 20,3 8 3,06 (m) 53,8 3,08 (ddd, J = 9,3; 7,7; 4,9) 53,8 10 2,92 ( td, J =11,0; 7,0) 48,5 2,93 (ddd, J = 12,1; 11,0; 7,1) 48,5 11 2,35 (dd, J =14,5; 6,5, H-11a) 31,6 2,36 (dd, J = 14,3; 6,6) 31,7 3,35m (H-11b) 3,35 (ddd, J = 14,3; 12,1; 7,7) 12 - 134,2 - 134,3 13 - 128,0 - 128,0 14 6,64 (s) 112,6 6,65 (s) 112,6 15 - 146,9 - 146,8 16 - 146,1 - 146,0 17 6,67 (s) 110,3 6,68 (s) 110,2 18 5,90 (s) 110,9 5,90 (s) 110,8 19 3,72 (s) 57,2 3,73 (s) 58,1 a Đo trong dung môi CDCl3, b 500MHz, c125 MHz, * Đo trong dung môi CDCl3 61 Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT1 Hình 3.2. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất DT1  Hợp chất DT2: Cephalotaxine-β-N-oxide 62 Phổ IR của DT2 có các đỉnh hấp thụ tại υ* (cm-1): 3399 (-OH); 2919 (alkyl); 1649 (C=C alken) và 1568 (C=C thơm). Các tín hiệu cộng hưởng trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất DT2 tương tự phổ NMR của hợp chất cephalotaxine DT1 gồm: hai tín hiệu singlet của 2 proton thơm para tại H 6,58 (1H, s, H-17) và 6,58 (1H, s, H-14), một tín hiệu của proton olefin tại 4,79 (1H, s, H-1), tín hiệu cộng hưởng của 2 proton methylenedioxy H- 18a,b tại δH 5,90 (1H, s, H-18a) và 5,94 (1H, s, H-18b), một tín hiệu singlet của methoxy liên kết với nguyên tử carbon bậc 4 tại δH 3,76 (3H, s, H-19). Phổ 13C-NMR cho các tín hiệu gồm 4 nguyên tử carbon vòng thơm tại δC 134,07 (C-12), 126,99 (C-13), 146,43(C- 15), 146,99 (C-16), một carbon olefin tại 160,83 (C-2). Năm nhóm methine trong đó có 2 nhóm (-CH-) vòng thơm tại δC 112,88 (C-14) và 110,18 (C-17), 1 nguyên tử carbon olefin tại 97,94 (C-1). Sáu nguyên tử carbon methylene. Một tín hiệu của carbon methoxy tại δC 57,14 (C-19). Sự khác biệt trên phổ NMR của DT2 so với DT1 thể hiện ở hằng số tương tác của 2 proton vicinal H-3 và H-4 ở DT1 (J = 9,0) giảm đến DT2 (J = 4,3) điều này được giải thích là do sự tăng góc nhị diện của 2 mặt phẳng chứa liên kết H-C3-C4-H từ 8o lên 43o do sự xuất hiện của liên kết β-N-oxide gây ra sự vặn xoắn hệ thống vòng [17]. Trên phổ 13C NMR sự khác biệt thể hiện rõ nét ở tín hiệu cộng hưởng của C-5 (δC 89,39), C-8 (δC 69,05) và C-10 (δC 63,2) ở DT2 chuyển dịch mạnh về phía trường thấp hơn so với phổ DT1 tại C-5 (δC 70,6), C-8 (δC 53,8) và C-10 (δC 48,5) ở DT1 cho phép khẳng định sự xuất hiện của (NO). Phổ khối phân giải cao ion dương HR-ESI-MS cho thấy một pic ion giả phân tử tại m / z 354,1303 [M + Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C18H21O5NNa là 354,1312) và m / z 332,1487 [M + H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C18H22O5N là 332,1489). Như vậy có thể kết luận CTPT của DT2 là C18H21O5N. Từ các dữ liệu trên phổ khối và phổ NMR của DT2 cho thấy phù hợp với các dữ liệu phổ tương ứng đã được công bố của hợp chất cephalotaxine--N- oxide [17]. Có thể khẳng định DT2 là Cephalotaxine--N-oxide. Hợp chất này lần đầu tiên được tách từ chi Cephalotaxus của dịch chiết EtOAc loài C. fortune năm 2002. Hợp chất này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức độ trung bình đến yếu đối với một số dòng tế bào ung thư thử nghiệm như tế bào ung thư biểu mô (KB), ung thư phổi A549 và SK-BR-3, ung thư gan (Hep-G2), ung thư biểu mô ruột [17] [18]. 63 Bảng 3.4. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của DT2 và Cephalotaxine--N-oxide Nguyên tử C Cephalotaxine--N-oxide [17] DT2 δH* δC* δCac δHab 1 4,70 (s) 97,8 97,94 4,79 (s) 2 - 169,1 169,83 - 3 4,00 (d, J = 4,3) 77,3 77,63 4,15 (d, J = 4,3) 4 3,32 (d, J = 4,3) 57,7 58,30 3,40 (d, J = 4,3) 5 - 89,1 89,39 - 6 2,11 (m, H-6a) 29,4 30,05 2,01 (m, H-6a) 2,11 (m, H-6b) 2,01 (m, H-6b) 7 1,91 (m, H-7a) 16,9 17,52 2,18 (m, H-7a) 2,14 (m, H-7b) 2,30 (m, H-7b) 8 3,28 (m, H-8a) 68,8 69,05 3,35 (m, H-8a) 3,58 (m, H-8b) 3,40 (m, H-8b) 10 3,54 (m, H-10a) 62,8 63,20 3,42 (m, H-10a) 3,29 (m, H-10b) 3,51 (m, H-10b) 11 2,38 (m, H-11a) 29,3 29,85 2,26 (m, H-11a) 4,03 (m, H-11b) 3,84 (m, H-11b) 12 - 133,5 134,07 - 13 - 126,5 126,99 - 14 6,48 (s) 112,5 112,88 6,58 (s) 15 - 146,1 146,43 - 16 - 146,6 146,99 - 17 6,48 (s) 109,8 110,18 6,58 (s) 18 5,78 (d, J = 1,4, H-18a) 100,9 101,16 5,90 (s, H-18a) 5,82 (d, J = 1,4, H-18b) 5,94 (s, H-18b) 19 3,66 (s) 56,7 57,14 3,76 (s) aĐo trong CDCl3, b 500MHz, c125 MHz; * Đo trong (90%CDCl3-CD3OD) 64 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT2 Hình 3.4. Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất DT2  Hợp chất DT3: Deoxyharringtonine Trên phổ IR, hợp chất DT3 cho các vân phổ hấp thụ tại υ* (cm-1) 3396 (OH), 2919 (alkyl), 1742 (C=O ester), 1650 (C=C alken), 1467 (C=C thơm). Phổ 1H-NMR cho thấy các tín hiệu cộng hưởng gợi ý bộ khung carbon là dẫn xuất của harringtonine bao gồm các tín hiệu tương tự của DT1như hai tín hiệu cộng hưởng singlet của 2 65 proton thơm ở vị trí para tại H 6,63 (s, H-17); 6,53 (s, H-14); 1 tín hiệu của proton olefinic (dạng CXY=CHZ) tại δH 5,04 (d, J = 0,5); 2 tín hiệu cộng hưởng của cặp proton vicinal ở vị trí cis tại δH: 6,00 (dd, J = 0,5, 9,5, H-3) và 3,77 ppm (d, J = 9,5, H- 4), hai tín hiệu doublet được gán cho 2 proton nhóm methylenedioxy H-18a,18b tại δH 5,85 (d, J = 1,5, H-18a) và 5,87 (d, J = 1,5, H-18b); 2 tín hiệu singlet có cường độ lớn đặc trưng cho các nhóm methyl có độ chuyển dịch hóa học lớn hơn do liên kết với các nguyên tử hoặc nhóm nguyên tử hút điện tử như nhóm methoxyt tại δH: 3,68 (3H, s, H- 19), methyl ester tại 3,57 (3H, s, H-5); So với phổ 1H NMR của DT1 phổ của DT3 xuất hiện các tín hiệu của mạch nhánh tại C-3 cụ thể là tín hiệu đặc trưng của gốc isopropyl tại δH1,41 (1H, m, H-3”) và δH 0,83 (3H, d, J = 6,7, H-4”), 0,84 (3H, d, J = 6,7, H-5”); 2 tín hiệu doublet có cùng hằng số J = 16,5 được gán cho 2 proton methylen hệ XY tại δH 1,87 (d, J = 16,5, H-3’α) và 2,27 (d, J = 16,5, H-3’β); các tín hiệu multiplet tại δH 1,41(m, H-1”); 0,97 (m, H-2”α) và 1,28 (m, H-2”β). Phổ 13C- NMR một lần nữa khẳng định những kết luận trên phổ 1H-NMR đó là các tín hiệu tại δC 174,07 (C-1’) và 170,47 (C-4’) (carbonyl ester), 7 nguyên tử carbon bậc 4 có độ dịch chuyển trong khoảng δC 70,6÷146,6 ppm. Sáu nguyên tử carbon methine có độ dịch chuyển hóa học δC 28,06÷112,61 ppm, trong đó một tín hiệu của carbon olefin tại 100,08 (C-1); 2 tín hiệu của carbon vòng thơm tại 112,68 (C-14) và 109,71 (C-17). Chín tín hiệu cộng hưởng của nhóm methylen có độ chuyển dịch trong khoảng δC: 20,3-53,9, riêng nhóm methylenedioxy C-18 có độ chuyển dịch mạnh về phía trường thấp tại 100,83 ppm. Bốn tín hiệu cộng hưởng của carbon nhóm methyl trong đó có một carbon methoxy tại 57,91 ppm (C-19). Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử tại m / z 516 [M + H]+ và 298 [M – C10H17O5, mạch nhánh]+, kết hợp với dữ liệu phổ NMR kết luận CTPT của DT3 là C28H37NO8. So sánh dữ liệu phổ NMR của DT3 với dữ liệu phổ đã được công bố của deoxyharringtonine [21], hợp chất DT3 được khẳng định là deoxyharringtonine. Năm 1972 hợp chất này lần đầu tiên đươc phân lập và xác định cấu trúc từ loài Cephalotaxus harringtonia (Forbes) K. Koch var. harringtonia cv. Fastigiata. Hợp chất DT3 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào từ mạnh đến trung bình đối với nhiều dòng tế bào ung thư như ung thư phổi A549, SK-BR-3, ung thư ruột kết HCT116, ung thư gan Hep-G2, tế bào u bạch cầu P388 và L1210 ở chuột [18] [94]. 66 Bảng 3.5. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của DT3 và Deoxyharringtonine. Nguyên tử C DT3 Deoxyharringtonine [21] δHa,b δCa,c δH* δC* 1 5,04 (d, J = 0,5) 100,08 5,06 (s) 99,9 2 - 157,83 - 157,9 3 6,00 (dd, J = 0,5; 9,5) 74,61 5,99 (d, J = 9,5) 74,5 4 3,77 (d, J = 9,5) 55,91 3,78 (d, J = 9.5) 55,8 5 - 70,63 - 70,7 6 - 43,40 2,05 (m, H-6α) 1,95 (m, H-6β) 43,3 - 7 - 20,32 1,79 (m, H-7α) 20,2 - 1,79 (m, H-7β) 8 - 53,94 3,15 (m, H-8α) 53,9 - 2,64 (m, H-8β) 10 - 48,63 2,98 (td, J = 11,0; 7,0, H-10α) 48,5 - 2,64 (m, H-10β ) 11 2,38 (dd, J = 14,0; 6,5) 31,37 2.40 (dd, J = 14,0; 6,8) 31,2 3,10 (m) 3.15(m) 12 - 133,33 - 133,1 13 - 128,48 - 128,3 14 6,53 (s) 112,67 6,55 (s) 112,6 15 - 146,67 - 146,6 16 - 145,83 - 145,8 17 6,63 (s) 109,71 6,63 (s) 109,6 18 5,83 (d, J = 1,5, H-18a) 100,80 5,86 (d, J = 1,5, H-18a) 100,8 5,86 (d, J = 1,5, H-18b) 5,88 (d, J = 1,5, H-18b) 19 3,68 (s) 57,12 3,69 (s) 57,1 1’ - 174,07 - 174,0 2’ - 74,74 - 74,7 3’ 1,87 (d, J = 16,5, H-3’α) 42,77 1,90 (d, J = 16,5, H-3’α) 42,7 2,27 (d, J = 16,5, H-3’β) 2,28 (d, J = 16,5, H-3’β) 4’ - 170,47 - 170,4 5’ 3,57 (s) 51,49 3,57 (s) 51,4 1” 1,41 (m) 36,74 1,41 (m, H-1”α) 36,7 1,41 (m) 1,41 (m, H-1”β) 2” 0,97 (m, H-2”α) 31,60 0,97 (m, H-2”α) 31,5 1,28 (m, H-2”β) 1,28 (m, H-2”β) 3” 1,41 (m) 28,01 1,41 (m) 27,9 - - 4” 0,83 (3H, d, J = 6,7; H-4”a) 22,26 0,83 (3H, d, J = 7,5; H-4”a) 22,2 5” 0,84 (3H, d, J = 6,7, H-5”a) 22,68 0,84 (3H, d, J = 7,5, H-5”a) 22,6 a Đo trong dung môi CDCl3, b 500MHz, c125 MHz; * Đo trong CDCl3 67 Hình 3.5. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất DT3 Hình 3.6. Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất DT3  Hợp chất DT4: Nordeoxyharringtonine Trên phổ IR có các đỉnh hấp thụ tại υ* (KBr, cm-1): 3494 (-OH); 2960 và 2796 (alkyl); 1750 (C=O ester); 1660 (C=C olefin), 1495 (C=C thơm) Phổ 1H-NMR của DT4 cho các tín hiệu cộng hưởng của 4 nhóm methyl tại δH (ppm): 0,83 (3H, d, J = 6,7, H-3”), 0,89 (3H, d, J = 6,7, H-4”), 3,55 (3H, s, H-5’) và 68 3,65 (3H, s, H-19); tín hiệu của 7 nhóm methylen δH 1,79 ÷ 5,86 ppm trong đó có 1 nhóm methylenedioxy cho tín hiệu đặc trưng tại δH 5,86 (d, J = 1,5, H-18a) và 5,83 (d, J = 1,5, H-18b);1 tín hiệu đơn của proton olefin hệ CXY=CHZ tại δH 5,03 (s); 2 tín hiệu proton thơm δH 6,52 (s, H-14) và 6,61 (s, H-17); Hai tín hiệu doublet có cùng hằng số tách của cặp proton vicinal ở vị trí cis cũng được quan sát thấy tại δH 3,76 (d, J = 10, H-4) và δH 5,95 ( d, J = 10, H-3). Tín hiệu cộng hưởng trên phổ 13C NMR được qui kết tại (bảng 3.6). So sánh phổ IR, 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất DT4 nhận thấy chúng tương tự với phổ của hợp chất DT3 ngoại trừ tín hiệu của một nhóm methylen tại C 31,60 (CH2) và H 0,97 (m), 1,28 (m) trên phổ của chất DT3 không tìm thấy trên phổ của DT4. Trên phổ khối HR-ESI-MS của DT4 xuất hiện pic ion giả phân tử tại m / z 502,24405 [M + H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C27H36NO8 là 502,24355) cho phép kết luận CTPT của DT4 là C27H35NO8. So sánh dữ liệu phổ của DT4 với dữ liệu đã được công bố của nordeoxyharringtonine [21], hợp chất DT4 được xác định là nordeoxyharringtonine. Năm 1996, hợp chất DT4 đã được phân lập từ loài C. harringtonia var. Drupacea (Sieb. & Zucc.) Koidzumi ở Nhật Bản trong một nghiên cứu nhằm tìm ra thuốc có tác dụng chống ung thư màng dịch từ thực vật. Chất này thể hiện hoạt tính ức chế tốt tế bào bạch cầu P388 ở chuột [21]. Bảng 3.6. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của DT4 và Nordeoxyharringtonine Nguyên tử C DT4 Nordeoxyharringtonine [21] δHa b δCa c δH* δC* 1 5,03 (s) 100,0 5,04 (s) 100,0 2 - 157,7 - 157,8 3 5,95 (d, J = 10) 75,1 5,97 (d, J = 9.8) 74,8 4 3,76 (d, J = 10) 55,8 3,78 (d, J = 9.8) 55,9 5 - 70,5 - 70,6 6 - 43,3 - 43,4 7 - 20,2 - 20,3 8 - 53,8 - 54,0 10 - 48,5 - 48,7 11 - 31,2 - 31,3 12 - 133,2 - 133,4 13 - 128,3 - 128,4 69 14 6,52 (s) 112,6 6,53 (s) 112,7 15 - 146,6 - 146,7 16 - 145,7 - 145,8 17 6,61 (s) 109,6 6,62 (s) 109,7 18 5,86 (d, J = 1,5, H-18a) 100,7 5,85 (d, J = 1,6, H-18a) 100,8 5,83 (d, J = 1,5, H-18b) 5,88 (d, J = 1,6, H-18b) 19 3,65 (s) 57,0 3,67(s) 57,1 1’ - 174,3 - 174,4 2’ - 74,7 - 75,2 3’ - 43,3 - 43,4 4’ - 170,4 - 170,5 5’ 3,55 (s) 51,3 3,57 (s) 51,5 1” - 46,6 - 46,7 2” - 24,0 - 23,9 3” 0,83 (d, J = 6,5, H-3”) 23,8 0,82 (d, J = 6,7; H-3”) 24,1 4” 0,89 (d, J = 6,5, H-4”) 23,9 0,91 (d, J = 6,7; H-4”) 24,1 a Đo trong dung môi CDCl3, b 500MHz, c125 MHz, * Đo trong dung môi CDCl3 Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của hợp chất DT4 70 Hình 3.8. Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất DT4  Hỗn hợp DT5: Isoharringtonine (DT5.1) ≈ 60% và Norisoharringtonine (DT5.2) ≈ 40% (chất mới)  Hợp chất isoharringtonine (DT5.1)  Hợp chất norisoharring tonine (DT5.2) (chất mới) Hai hợp chất DT5.1 và DT5.2 được phân lập cùng nhau trong hỗn hợp với tỉ lệ 6:4, tỉ lệ này được xác định dựa trên cường độ tín hiệu cộng hưởng trên phổ 1H-NMR. Phổ IR xuất hiện các dải hấp thụ tại υ*(cm-1): 3518 (-OH), 2969, 2850 (alkyl), 1741 (C=O ester), 1653 (C=C alken). Phổ 1H và 13C-NMR của DT5.1 chứa các tín hiệu điển hình của khung alkaloid haringtonia.Trên phổ 1H-NMR cho một tín hiệu cộng hưởng đơn của một proton olefin kiểu CXY=CHZ tại δH 5,08 (1H, s, H-1), hai tín hiệu doublet có cùng hằng số tương tác J = 9,8 Hz gợi ý cho hai proton của 2 vicinal ở vị trí cis tại δH 6,03 (1H, d, J = 9,8, H-3) và 3,79 (1H, d, J = 9,8, H-4) trong đó tín hiệu của H-3 có độ chuyển dịch hóa học lớn hơn do liên kết trực tiếp với nhóm hút điện tử (ester). Hai tín hiệu singlet của 2 proton thơm para tại δH 6,54 (1H, s, H-14) và 6,65 (1H, s, H-17). Hai tín có độ chuyển dịch rất gần nhau tại δH là 5,8 (s) và 5,86 (br, s) được gán cho 2 proton nhóm methylenedioxy (H-18a,18b). Ngoài ra còn có các tín hiệu đơn có cường độ lớn của các proton nhóm methoxy liên kết với carbon bậc 3 tại 71 δH 3,69 (3H, s, H-19) và carbon carbonyl tại δH 3,61 (3H, s, H-5’); một tín hiệu đơn khác có cường độ nhỏ hơn tại δH 3,35 (1H, s, H-3’). Hai tín hiệu cộng hưởng doublet được gán cho 2 nhóm methyl trong gốc isopropyl tại δH 0,85 (3H, d, J = 6,7) và 0,87 (3H, d, J = 6,7). Phổ 13C-NMR cho các tín hiệu phù hợp với các tín hiệu trên phổ 1H- NMR: hai tín hiệu cộng hưởng của carbon carbonyl (ester) tại δC 173 (C-1’) và 171,65 (C-4’), 7 tín hiệu của carbon bậc 4 trong đó có 4 nguyên tử carbon thơm tại δC 128,28 (C-12); 133,35 (C-13); 146,69 (C-15) và 145,65 (C-16) và một tín hiệu của carbon olefin tại 157,52 (C-2). Bảy tín hiệu cộng hưởng của carbon methine có độ dịch chuyển hóa học δC 28,06÷112,61 ppm, trong đó một tín hiệu của carbon olefin tại δC 100,44 ppm (C-1); 2 tín hiệu của carbon vòng thơm tại δC 112,61 (C-14) và 109,88 (C- 17). Tám tín hiệu cộng hưởng của carbon methylen có độ chuyển dịch trong khoảng δC: 20,25-53,84 ppm riêng nhóm methylendioxy C-18 có độ chuyển dịch mạnh về phía trường thấp tại δC 100,81. Bốn tín hiệu cộng hưởng của carbon nhóm methyl trong đó có một nhóm methoxy tại δC 57,10 (C-19); một carbon (methyl ester) tại 52,28 (C-5’) và 2 nhóm methyl thuộc isopropyl ở 22,71(C-4”) và 22,22 (C-5”). Đáng chú ý là tất cả các tín hiệu 1H và 13C của chuỗi bên ester xuất hiện theo cặp với tỷ lệ cường độ xấp xỉ 60:40. So sánh phổ 1H- và 13C -NMR của DT5.1 với những dữ liệu phổ đã được công bố của hợp chất isoharringtonine [92, 95] cho thấy có sự phù hợp. Vì vậy cấu trúc của DT5.1 được xác định là isoharringtonine. Từ những năm 70 hợp chất này đã được phân lập từ loài C. harringtonia var. drupacea [15]. Sau này hợp chất DT5.1 còn được tìm thấy trong nhiều loài khác trong chi Cephalotaxus như C. hainanensis Li, C. lanceolata, C. harringtonia var.nana [18] [20]. Chất này cho thấy khả năng gây độc tế bào mạnh và đa dạng với nhiều dòng tế bào ung thư thử nghiệm như tế bào ung thư bạch cầu P388 ở chuột, tế bào u tủy ở người, tế bào ung thư máu HL-60, ung thư biểu mô KB [41] [43] [20]. Sự khác biệt duy nhất giữa hai hợp chất DT5.1 và DT5.2 là trong phân tử hợp chất DT5.2 có ít hơn một nhóm methylen ở mạch nhánh so với hợp chất DT5.1. Điều này được khẳng định trong phổ khối HR-ESI-MS ion dương của hỗn hợp hai chất DT5.1 và DT5.2 với hai pic ion giả phân tử tại m / z 532,25485 [M + H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C28H38NO9]+ là 532,25411) và m / z tại 518,23903 [M + H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C27H36NO9]+ là 518,23846). Các dữ liệu phổ NMR 72 của 2 c