Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài sưa (dalbergia tonkinensis prain) ở Việt Nam

ne/acetone Hệ DA: dichloromethane/acetone Hệ HE: n-hexane/ethyl acetate Hệ MW: methanol/nước SiO2,O.P C.C CM (9/1, v/v) SiO2, O.P C. HE (5/1, v/v) SiO2, O.P C.C HA (3/1, v/v) SiO2, OP.CC DA (40/1, 30/1, v/v ME (11,1 g) ME2 370 mg ME7-8 1000 mg ME9 650 mg ME9.1 420 mg ME1 850 mg DT.04 5,0 mg DT.05 8 mg ME10-11 350.5 mg ME9.2 120 mg ME4-6 4992 mg ME3 900 mg 52 2.3.1.3. Phân lập các chất từ cặn chiết nước cao nước đun sôi Cao nước đun sôi (4,2 g, W) được tách phân đoạn trên sắc ký cột HP-20 bằng chất hấp phụ silicagel pha đảo với hệ dung môi rửa giải nước/methanol (1/0-0/1), thu được 5 phân đoạn (W1-W5). Phân đoạn W2 (210,0 mg) chạy tách chất trên cột sắc ký với chất hấp phụ silicagel pha thường, triển khai theo chế độ gradient dung môi dichloromethane/methanol/nước (30/1/0,1, v/v/v), sau đó tiến hành sắc ký bản mỏng TLC thu được 2 phân đoạn (W2.1- W2.2). Tinh chế phân đoạn W2.2 (150 mg) trên sắc ký cột CC với silicagel pha thường, rửa giải với hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate/ acid formic (130/80/2, v/v/v) thu được chất sạch DT.06 (5,5 mg). Phân đoạn W4 (800 mg) được phân tách trên cột sắc ký silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol/nước (30/1/0,1, v/v/v), thu được 4 phân đoạn từ W4.1-W4.4. Tiến hành tách chất phân đoạn W4.1 (65 mg) trên cột sắc ký với chất hấp phụ silicagel pha thường, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate/ acid formic (80/80/2, v/v/v) thu được hợp chất sạch DT.07 (5,0 mg). 53 Sơ đồ 2. 4. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cao nước đun sôi W1.1 70 mg Chú thích: O.P C.C: sắc khí cột, pha thường. HP-20: diaion HP-20 SiO2: silicagel Hệ WM: nước/methanol Hệ DMW: dichloromethane/methanol/nước Hệ HEF: n-hexane/ethyl acetate/ acid formic SiO2, O.P C.C HEF (130/80/2, v/v/v) SiO2, O.P C.C HEF (80/80/2, v/v/v) SiO2, O.P C.C DMW (30/1/0,1, v/v/v) SiO2, O.P C.C DMW (3/1/0,1, v/v/v) SiO2, O.P C.C DMW (30/1/0,1, v/v/v) HP-20,WM (1/0-0/1) W (4,2 g) W2 210 mg W1 937,9 mg W4 800 mg W3 250 mg W5 300 mg W4.1 65 mg W4.2 106 mg W4.3 102 mg W4.4 150 mg W2.1 60 mg W2.2 150mg DT.07 (5,5 mg) W1.3 66,6 mg W1.4 120 mg W1.5-1.7 159 mg W1.8-1.9 292 mg W1.2 80 mg DT.06 (5,0 mg) 54 2.3.2. Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-612) Lõi gỗ cây Sưa (1,2 kg) đem phơi khô, nghiền nhỏ sau đó ngâm chiết với methanol ở nhiệt độ phòng (5 lần x 3 lít), lọc và cô cất trong chân không thu được phần cặn methanol (60,3 g, M). Phần cặn methanol này được hoà tan trong lượng nước vừa đủ và chiết phân bố lần lượt bằng các dung môi n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate và nước. Cho các cặn chiết tương ứng là các cặn n-hexane (1,6 g, HDT-1), dichloromethane (27,2 g, HDT-2), ethyl acetate (2,6 g, HDT-3) và nước (3,7 g, HDT- 4) ( Sơ đồ 2.5). Sơ đồ 2.5. Xử lý mẫu và chiết tách từ lõi gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (C-612) 2.3.2.1. Phân lập các chất từ cặn chiết dichloromethane Cặn dịch chiết dichloromethane (27,2 g, HDT-2) được tiến hành phân tách trên sắc ký cột CC, silicagel pha thường, rửa giải với hệ dung môi n-hexane/acetone theo tỷ lệ (3/2-0/1) thu được 14 phân đoạn ký hiệu từ (C1-C14). Phân đoạn C1 (1560 mg) được tách trên cột sắc ký silicagel pha thường, triển khai theo chế độ gradient dung môi chloroform/methanol (12/1, v/v) , sau đó sử dụng phương pháp sắc kí bản mỏng TLC thu được 4 phân đoạn từ (C1.1-C1.4). Tinh chế phân đoạn C1.1 (95 mg) bằng sắc ký cột silicagel pha thường, giải hấp bởi hệ dung môi n-hexane/acetone (3/2, v/v) thu được chất sạch DT.08 (9 mg). Phân đoạn C1.2 (280 mg) được chiết tách Chú thích: H: Heartwood D: Dalbergia T: tonkinensis Ngâm MeOH (5 x 3,0L) Chiết phân bố ethyl acetate HDT-1 (1,6 g) HDT-2 (27,2 g) HDT-3 (2,6 g) HDT-4 (3,7 g) dichloromethane n-hexane Nước Cao methanol (M, 60,3 g) Lõi gỗ (1,2 kg) 55 trên cột silicagel bằng hệ dung môi chloroform/methanol theo tỷ lệ (10/1; 9/1, v/v) được hợp chất DT.10 (7 mg) và DT.11 (10 mg). Chạy tách chất phân đoạn C1.3 (314 mg) trên cột sắc ký và được rửa giải bởi hệ dung môi chloroform/methanol (10/1,5, v/v) tăng dần độ phân cực, thu được 3 phân đoạn được ký hiệu từ C1.3.1-C1.3.3. Từ phân đoạn C1.3.1 (95 mg) ta thu được chất sạch DT.09 (10 mg) bằng phương pháp chạy pha đảo với chất hấp phụ silicagel, được lọc rửa bằng hệ dung môi methanol/nước theo tỷ lệ (1,5/1, v/v). Phân đoạn C2 (4108 mg) tiếp tục tinh chế bằng sắc ký cột silicagel pha thường (230-400 mesh), rửa giải với hệ dung môi n-hexane/acetone (30/5-0/10) thu được 5 phân đoạn (C2.1-C2.5). Tinh chế phân đoạn C2.1 (173 mg) bằng phương pháp sắc khí cột silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải là chloroform/acetone (3/1, v/v) được chất sạch DT.12 (8 mg). Phân đoạn C2.7 (341 mg) sau khi cất loại bỏ dung môi, thu được tinh thể kết tinh màu trắng, sấy khô, trích mẫu thử hòa tan trong trong hệ chloroform/acetone theo tỷ lệ (3/1, v/v) thấy mẫu tan, tiếp tục sắc kí cột hệ chloroform/acetone (3/1, v/v) thu được hợp chất DT.13 (7 mg) (Sơ đồ 2.6). 56 Chú thích: O.PC.C: sắc khí cột, pha thường RP18: pha đảo SiO2: silicagel Hệ HA: n-hexane/acetone Hệ CM: chloroform/methanol Hệ CA: chloroform/acetone Hệ CE: chloroform/ethylacetate SiO2, O.P C.C CM (10/1, v/v) SiO2, O.P C.C CM (10/1,5, v/v) SiO2, O.P C.C HA (3/2, v/v) Rửa tinh thể CA (3/1, v/v) SiO2, O.P C.C CA (3/1, v/v) DT.11 10 mg SiO2, RP18 C.C MW (1,5/1, v/v) DT.12 8 mg C2.1 173 mg C2.6 196 mg C2.4-2.5 455 mg C2.2-2.3 506 mg C2.7 341 mg DT.10 7 mg DT.08 9 mg C2.8 564 mg DT.09 10 mg DT.13 7 mg SiO2, O.P C.C CM (12/1, v/v) SiO2, O.P C.C HA (3/2-0/1) SiO2, O.P C.C HA (30/5-0/10) C1.1 95 mg C1.2 280 mg C1.3 314mg C1.4-1.5 133 mg C2 4108 mg C6-C8 1247 mg C9-C11 1151 mg C12-C14 1235 mg C3 566 mg C4 670 mg C5 850 mg C1 1560 mg HDT-2 27,2 g C1.3.1 95 mg C1.3.3 33,6 mg C1.3.2 64 mg Sơ đồ 2.6. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết DHT-2 57 2.3.2.2. Phân lập các chất từ cặn chiết ethyl acetate Cao ethyl acetate (2,6 g, HDT-3) được tiến hành phân tách trên cột sắc ký silicagel pha thường (40-63 mesh) được rửa giải với hệ dung môi n-hexane/acetone theo tỷ lệ (99/1-0/1) tăng dần độ phân cực, thu được 12 phân đoạn ký hiệu từ (E1- E12). Phân đoạn E1 (0,5 g) tiếp tục được tách phân đoạn bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel pha thường và làm sạch bởi hệ dung môi chloroform/acetone (30/2-20/3) thu được 8 phân đoạn từ (E1.1-E1.8). Phân đoạn E1.1 (178.6 mg) được chạy tách chất trên cột sắc ký silicagel pha thường và giải hấp phụ bởi hệ dung môi n-hexane/acetone (3/2, 3/3, v/v) thu được chất sạch DT.14 (7 mg). Phân đoạn E1.2 (200 mg) được rửa giải với hệ dung môi chloroform/ethyl acetate theo tỷ lệ (11/3, 10/3, v/v), sau đó thực hiện sắc kí bản mỏng thu được hợp chất DT.15 (10,0 mg). Phân đoạn E2 (0,12 g) được phân tách trên cột silicagel pha thường, sau đó giải hấp bởi hệ dung môi n-hexane/acetone (3/1, v/v) thu được hợp chất DT.16 (6,0 mg). Phân đoạn E4 được tách phân đoạn trên cột sắc ký silicagel pha thường với hệ dung môi giải hấp chloroform/ethyl acetate (3/1, v/v) thu được 15 phân đoạn ký hiệu từ (E4.1-4.15). Tiếp tục tinh chế phân đoạn E4.14 (100 mg) bằng cột silicagel và làm sạch bởi hệ dung môi chloroform/ethyl acetate theo tỷ lệ (4/1, v/v) được chất sạch DT.17 (10 mg) (Sơ đồ 2.7). 58 Sơ đồ 2.7. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết DHT-3 Chú thích: O.P C.C: sắc khí cột, pha thường. RP18: pha đảo SiO2: silicagel TLC: sắc kí bản mỏng Hệ HA: n-hexane/acetone Hệ MW: methanol/nước Hệ CA: chloroform/acetone Hệ CE: chloroform/ethyl acetate Hệ MW: methanol/nước TLC CE (11/3, 10/3, v/v) HDT-3 (2,6 g) E1.2 200 mg 0 SiO2, O.P, CC CE (3/1, v/v) SiO2, O.P C.C HA (5/1, v/v) SiO2, O.P C.C CA (30/2-20/3) E1.1 178,6 mg 0 E1.3-E1.8 110 mg 0 SiO2, O.P C.C HA (3/2-3/3) SiO2, O.P C.C CE (4/1, v/v) E4.1-4.2 30 mg E4.3 70 mg E4.4-4.7 50 mg E4.8-4.11 63 mg E4.12-4.13 20,5 mg E4.14 100 mg E4.15 15 mg SiO2, O.P C.C HA (99/1-0/1) E4 0,42 g E8-10 0,6 g E11-12 0,3 g E5-7 0,45 g E3 0,15 g E1 0,5 g E2 0,12 g DT.17 10 mg DT.15 10 mg DT.14 7 mg DT.16 6 mg 59 2.3.2.3. Phân lập các chất từ cao nước Tiến hành tách phân đoạn cao nước (3,7 g, HDT-4) theo phương pháp sắc ký cột trên chất hấp phụ silicagel pha thường với hệ gradient dung môi rửa giải là chloroform/ethyl acetate tăng dần độ phân cực theo tỷ lệ (3/1-0/1), thu được 8 phân đoạn ký hiệu từ (W1-W8). Phân đoạn W2 (0,42 g) được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký silicagel pha thường với hệ dung môi chloroform/ethyl acetate (2/1-0/1) thu được 15 phân đoạn từ (W2.1-2.15). Chạy tách phân đoạn W3 (0,8 mg) trên cột silicagel pha thường và được giải hấp bởi hệ dung môi chloroform/acetone theo tỷ lệ (12/1, 11/1, v/v) thu được 6 phân đoạn từ (W3.1-W3.6). Tinh chế phân đoạn W3.3 (110 mg) trên cột CC silicagel pha thường và được làm sạch bằng hệ rửa giải chloroform/acetone (8/2, v/v) thu được chất sạch DT.18 (8,0 mg) ( Sơ đồ 2.8). 60 Sơ đồ 2.8. Quy trình chiết và phân lập các chất từ cặn dịch chiết HDT-4 SiO2, O.P C.C CE (3/1-0/1) HDT-4 (3,7 g) CE (5/2, v/v),kết tinh chậm, rửa acetone 3 lần SiO2, O.P C.C 230-400 mesh CE (2/1-0/1) SiO2, O.PC.C CA (8/2, v/v) SiO2, O.PC.C CA (12/1-0/1) W3 0,8 g W2 0,42 g W4-8 0,5 g DT.18 8 mg mg W1-2 0,35 g W3.4-3.6 250 mg W3.3 110 mg W3.1-3.2 300 mg W2.1-2.3 31,2 mg W2.4- 2.7 42 mg W2.8-2.11 101 mg W2.12- 2.13 93,5 mg W2.14 80 mg W2.15 15 mg MCNM-2 13 mg Chú thích: O.PC.C: sắc khí cột, pha thường SiO2: silicagel Hệ CA: chloroform/acetone Hệ CE: chloroform/ethylacetate 61 2.4. Thông số hóa lý và dữ kiện phổ các hợp chất phân lập Pinocembrin (DT.01): chất bột màu vàng, (C15H12O4, M = 256), 1H-NMR (500 MHz, DMSO): 7,44 (2H, t, 8,3 Hz, H-2', H-6'), 7,52 (2H, t, 8,4 Hz, H-3', H-5'), 7,39 (1H, t, 7,0 Hz, H-4'), 5,92 (1H, d, 2,0 Hz, H-6) 5,89 (1H, d, 2,0 Hz, H-8), 5,57 (1H, dd, 12,6, 3,1, H-2), 3,24 (1H, dd, 17,1, 12,6 Hz, Hb-3), 2,77 (1H, dd, 17,1, 2,7 Hz, Ha-3), (PL-1). 13C-NMR (125 MHz, DMSO): 195,8 (s, C-4), 167,0 (s, C-7), 163,5 (s, C-5), 138,7 (s, C-1'), 128,5 (d, C-3', C- 5'), 128,5 (d, C-4'), 162,7 (s, C-8a), 127,0 (d, C-2', C-6'), 101,7 (s, C-4a), 95,1 (d, C-6), 96,0 (d, C-8), 78,4 (d, C-2), 42,1 (t, C-3), (PL-1). Naringenin (DT.02): bột màu vàng, (C15H12O5, M = 272), 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 7,34 (2H, d, 8,5 Hz, H-2', H-6'), 6,83 (2H, d, 8,5 Hz, H-3', H-5'), 5,91 (2H, d, 2,0 Hz, H-6, H-8), 5,36 (1H, dd, 13,0, 3,0 Hz, H-2), 3,13 (1H, dd, 17,0, 13,0 Hz, Hb-3), 2,72 (1H, dd, 17,0, 3,0 Hz, Ha-3), (PL-2). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 197,8 (s, C-4), 168,4 (s, C-7), 165,5 (s, C-5), 164,9 (s, C-8a), 159,1 (s, C-4'), 131,8 (s, C-1'), 129,1 (d, C-2', C-6'), 116,4 (d, C-3', C- 5'), 103,4 (s, C-4a), 97,1 (d, C-6), 96,2 (d, C-8), 80,5 (d, C-2), 42,3 (t, C-3), (PL-2). 3'-hydroxy-2,4,5-trimethoxydalbergiquinol (DT.03): bột màu trắng (C18H20O4, M = 300), 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 7,14 (1H, t, 7,5 Hz, H-5'), 6,67 (1H, s, H-6), 6,54 (1H, s, H-3), 6,76 (1H, d, 7,5 Hz, H-6'), 6,64 (1H, s, H-2'), 6,65 (1H, s, H-4'), 6,24 (1H, ddd, 17,0, 10,5, 7,0 Hz, H-2''), 5,19 (1H, d,10,0 Hz, Ha-3), 5,04 (1H, d, 6,5 Hz, H-1''), 4,94 (1H, d, 17,0, Hz, Hb-3), 3,88 (3H, s, 4-OCH3), 3,73 (3H, s, 2-OCH3), 3,77 (3H, s, 5-OCH3), (PL-3). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 155,5 (s, C-3'), 151,5 (s, C-2), 148,3 (s, C-4), 145,4 (s, C-1'), 143,0 (s,C-5), 140,2 (d, C-2''), 129,3 (d, C-5'), 123,0 (s, C-1), 121,1 (d, C-6'), 112,9 (d, C-4'), 116,3 (t, C-3''), 113,7 (s, C-6), 116,2 (d, C-2'), 98,5 (d, C-3), 56,8 (q, 2-OCH3), 56,7 (q, 5-OCH3), 56, 2 (q, 4-OCH3), 47,0 (d, C-1''), (PL-3). Medicarpin (DT.04): dạng bột trắng, (C17H17O4, M = 285), 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), δ (ppm): 7,27 (1H, d, 8,5 Hz, H-1), 7,12 (1H, d, 8,0 Hz, H-7), 6,51 (1H, dd, 2,5, 8,0 Hz, H-2), 6,42 (1H, dd, 2,0, 8,0 Hz, H-8), 6,37 (1H, d, 2,5 Hz, H- 10), 6,33 (1H, d, 2,5 Hz, H-4), 5,41 (1H, t, 7,0 Hz, H-11a), 3,47 (1H, dd, 2,5, 10,5 62 Hz, H-6a), 3,71 (3H, s, 9-OCH3), 4,17 (1H, dd, 2,5, 10,5 Hz, H-6) 3,51 (1H, t, 10,5 H-6) (PL-4). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ (ppm): 162,5 (s, C-3), 161,9 (s, C-4a), 160,0 (s, C-9), 158,0 (s, C-10a), 133,2 (d, C-1), 125,9 (d, C-7), 120,8 (s, C-6b), 112,9 (s, C- 11b), 110,7 (d, C-2), 107,2 (d, C-8), 104,1 (d, C-4), 97,6 (d, C-10), 80,0 (d, C-11a), 67,5 (t, C-6), 55,9 (q, 9- OCH3), 40,8 (d, C-6a), (PL-4). Buteaspermanol (DT.05): bột màu trắng, (C16H12O5, M = 284), 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), δ (ppm): 7,56 (2H, t, J=7,0 Hz, H-2, H-6), 7,40-7,45 (3H, m, H-3, H-4, H-5), 7,31 (1H, s, H-5), 6,43 (1H, s, H-8), 5,09 (1H, d, J=12,0 Hz, H-2), 4,53 (1H, d, J=12,0 Hz, H-3), 3,88 (3H, s, 7-OCH3), (PL-5). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ (ppm): 194,3 (s, C-4), 159,7 (s, C-8a), 156,8 (s, C-7), 145,5 (s, C-1),138,8 (s, C-6), 129,8 (s, C-4), 129,3 (d, C-3, C-5), 128,9 (d, C- 2, C-6), 112,1 (s, C-4a), 108,2 (d, C-5), 104,5 (d, C-8), 85,9 (d, C-3), 74,6 (d, C-2), 56,6 (q, 7-OCH3), (PL-5). Daltonkin A (DT.06): Chất rắn vô định hình màu trắng, tan tốt trong dung môi metanol. Xác định định tính bằng sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng silica gel tráng sẵn 60 F254 (Merck), dung môi triển khai là n-hexan/etyl axetat/axit formic = 80/120/2; Rf = 0,40; (C18H16O6, M = 328), IR (film, cm-1): 3354, 2947, 2835, 1701, 1637, 1610, 1452, 1022, 975, 689; UV λmax (MeOH): 293 nm; CD (c 0,4, MeOH): ∆ε288 (nm)  10,43, ∆ε330 (nm) + 2,10; HR-ESI-MS: m/z 327,0868 [M  H] (tính toán C18H15O6 = 327,0868); 1H-NMR (500 MHz, methanol-d4) δH (ppm): 5,47 (1H, dd, J = 13,0, 3,0 Hz, H-2), 3,11 (1H, dd, J = 17,0, 13,0 Hz, H-3ax), 2,80 (1H, dd, J = 17,0 và 3,0 Hz, H-3eq), 6,02 (1H, s, H-6), 7,52 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-2′ và H-6′), 7,44 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-3′ và H-5′), 7,39 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-4′), 2,86 (2H, t, J = 8,0 Hz, H-9), 2,49 (2H, t, J = 8,0 Hz, H-10), (PL-6). 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) δC (ppm): 80,5 (C-2), 44,3 (C-3), 197,5 (C- 4), 103,3 (C-4a), 162,8 (C-5), 95,6 (C-6), 166,1 (C-7), 108,5 (C-8), 162,8 (C-8a), 18,7 (C-9), 34,1 (C-10), 177,7 (C-11), 140,5 (C-1′), 127,3 (C-2′ và C-6′), 129,6 (C-4′), 129,7 (C-3′ và C-5′), (PL-6). 63 Daltonkin B (DT.07): chất rắn vô định hình màu trắng, tan tốt trong dung môi metanol. Xác định định tính bằng sắc ký lớp mỏng trên bản mỏng silica gel tráng sẵn 60 F254 (Merck), dung môi triển khai là n-hexan/etyl axetat/axit formic = 80/80/2; Rf = 0,25; (C21H20O9, M = 415), IR (film, cm-1): 3369, 2987, 2864, 1751, 1676, 1575, 1411, 1022, 894, 754, 696; UV λmax (MeOH): 297 nm; CD (c 0,4, MeOH): ∆ε291 (nm)  8,29, ∆ε330 (nm) + 2,05; HR-ESI-MS m/z 415,1014 [M  H] (tính toán C21H19O9 415,1024); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1H-NMR (500 MHz, methanol-d4) δH (ppm): 5,39 (1H, dd, J = 13,0, 3,0 Hz, H-2), 3,13 (1H, dd, J = 17,0, 13,0 Hz, H-3ax), 2,79 (1H, dd, J = 17,0, 3,0 Hz, H-3eq), 7,36 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′ và H-6′), 6,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′ và H-5′), 2,85 (2H, m, H-9), 2,55 (2H, m, H-10), 2,81 (2H, m, H-9′), 2,51 (2H, m, H-10′), (PL-7). 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) δC (ppm): 80,3 (C-2), 44,0 (C-3), 198,6 (C- 4), 103,4 (C-4a), 159,8 (C-5), 109,0 (C-6), 163,9 (C-7), 108,3 (C-8), 161,1 (C-8a), 18,8 (C-9), 34,4 (C-10), 179,1 (C-11), 19,4 (C-9′), 34,8 (C-10′), 179,2 (C-11′), 131,4 (C-1′), 128,8 (C-2′ và C-6′), 158,9 (C-4′), 116,4 (C-3′ và C-5′), (trang PL-7). Dalbergin (DT.08): tinh thể màu vàng, (C16H12O4, M = 268), 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 7,57 (3H, m, H-3', H-4', H-5'), 7,51 (2H, m, H-2', H-6'), 7,06 (1H, s, H-8), 6,88 (1H, s, H-5), 6,21 (1H, s, H-3), 3,99 (3H, s, 7-OCH3), (PL-8). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 163,8 (s, C-2), 158,2 (s, C-4), 153,6 (s, C-7), 150,4 (s, C-4a), 145,2 (s, C-6), 137,1 (s, C-1'), 130,8 (d, C-4'), 129,9 (d, C-3', C-5'), 129,5 (d, C-2', C-6'), 112,3 (d, C-3), 111,9 (d, C-5), 113,1 (s, C-8a), 101,1 (d, C-8), 56,8 (q, 7-OCH3), (PL-8). Isoliquiritigenin (DT.09): chất bột màu trắng, vô định hình, (C15H12O4, M = 316). 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) H ppm: 7,74 (4H, s, H-α, H-β, H-2, H-6), 6,84 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-3, H-5), 6,27 (1H, d, J= 2,5 Hz, H-3'), 6,41 (1H, dd, J= 9,0, 2,5 Hz, H-5'), 8,14 (1H, d, J= 9,0 Hz, H-6'), (PL-9). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) C ppm: 191,5 (s, C-4), 144,3 (C- β), 117,5 (C-α), 131,2 (d, C-2, C-6), 115,9 (d, C-3, C-5), 125,8 (s, C-1), 165,0 (s, C-2'), 102,6 (C-3'), 165,8 (s, C-4'), 108,2 (C-5'), 132,8 (C-6'), 113,0 (s, C-1'), (PL-9). 64 7,3',5'-trihydroxyflavanone (DT.10): chất rắn không màu (C15H12O5, M = 272); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) H: 7,64 (1H, d, 9,0Hz, H-5), 6,88 (1H, s, H-4'), 6,74 (2H, s, H-2', H-6'), 6,49 (1H, dd, 2,5, 9,0 Hz, H-6), 6,32 (1H, d, 2,0 Hz, H-8), 5,37 (1H, dd, 30; 12,5 Hz, H-2), 3,03 (1H, dd, 12,5; 17,0 Hz, H-3ax), 2,62 (1H, dd, 3,0, 17,0 Hz, H-3eq), (PL-10). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) C: 190,0 (C-4), 164,6 (C-8a), 163,1 (C-7), 145,1 (C-3'), 145,6 (C-5'), 129,9 (C-1'); 128,3 (C-5); 117,8 (C-4'), 114,2 (C-2', C-6'), 113,5 (C-10), 110,4 (C-6), 102,5 (C-8), 78,9 (C-2), 43,2 (C-3), (PL-10). Vestitone (DT.11): chất bột màu trắng (C16H14O5, M = 286); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): 7,67 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), 6,84 (1H, d, 8,5 Hz, H-6'), 6,41 (1H, d, 2,0 Hz, H-8), 6.51 (1H, dd, 8,5, 2,0 Hz, H-6), 6.31 (1H, dd, 8,5, 2,0 Hz, H-5'), 6,29 (1H, d, 2,0 Hz, H-3'), 4,48 (1H, t, 11,0 Hz, Ha-2), 4,40 (1H, dd, 11,0, 5,5, Hb-2), 4,10 (1H, dd, 11,5, 5,5 Hz, H-3), 3,67 (3H, s, 4'-OCH3), (PL-11). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): 190,5 (s, C-4), 164,2 (s, C-7), 163,2 (s, C- 8a), 158,1 (s, C-4'), 158,0 (s, C-2'), 130,5 (d, C-5), 128,9 (d, C-6'), 114,2 (s, C-1'), 99,4 (d, C-3'), 106,9 (d, C-5'), 103,6 (d, C-6), 114,1 (s, C-4a), 102,3 (d, C-8), 70,4 (t, C-2), 56,0 (q, 4'-OCH3), 46,6 (d, C-3), (PL-11). Calycosin (DT.12): chất bột màu vàng, vô định hình (C16H12O5, M = 287); 1H- NMR (500 MHz, 500 MHz, DMSO-d6): 8,28 (1H, s, H-2), 7,97 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), 6,93 (dd, 9,0; 2,0 Hz, H-6), 6,92 (1H, d, 2,5 Hz, H-8), 7,05 (1H, s, H-2'), 6,94 ( 1H, d, 9,0 Hz, H-6'), 6,94 ( 1H, d, 9,0 Hz, H-5'), 3,79 (3H, s, 4'-OCH3), (PL-12). 13C-NMR (125 MHz, 500 MHz, DMSO-d6): 174,5 (s, C-4), 162,5 (s, C-7), 147,5 (s, C- C-4'), 157,3 (s, C-8a), 153,0 (d, C-2), 119,7 (d, C-6'), 127,3 (d, C-5), 123,3 (s, C-3), 124,7 (s, C-1'), 116,6 (s, C-4a), 116.4 (s, C-2'), 115,1 (d, C-6), 146,0 (d, C-3'), 112,0 (d, C-5'), 102,5 (d, C-8), 55,6 (q, 4'-OCH3), (PL-12). 4',7-dihydroxy-3-methoxyflavone (DT.13): dạng bột màu trắng, (C16H12O4, M = 268), 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): 7,97 (1H, d, J=8,8 Hz, H-5), 6,94 (1H dd, J=8,8, 2,1 Hz, H-6), 6,86 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8), 7,50, (2H, d, J=8,7 Hz, H-2', H-6'), 6,86 (2H, d, J=8,7 Hz, H-3', H-5'), 3,78(3H, s, 3-OCH3), (PL-13). 65 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): 175,1 (s, C-4), 163,0 (s, C-7), 157,9 (s, C-4'), 159,4 (s, C-8a), 153,6 (s, C-2), 130,5 (d, C-2', C-6'), 124,7 (d, C-5), 127,8 (s, C-3), 123,6 (s, C-1'), 117,7 (s, C-4a), 115,7 (d, C-6), 114,1 (d, C-3', C-5'), 102,6 (d, C-8), 55,6 (q, 3- OCH3), (PL-13). Liquiritigenin (DT.14): chất bột màu vàng, (C15H12O4, M = 256), 1H-NMR (500 MHz, methanol-d4): 7,65 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), 7,32 (2H, d, 8,5 Hz, H-2', H-6'), 6,80 (2H, d, 8,5 Hz, H-3', H-5'), 6,51 (1H, dd, 2,5, 8,5 Hz, H-6), 6,33 (1H, d, 2,5 Hz, H-8), 5,42 (1H, dd, 3,0, 13,0 Hz, H-2), 3,06 (1H, dd, 13,0, 17,0 Hz, Ha-3), 2,64 (1H, dd, 3,0, 17,0, Hb-3), (PL-14) 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4): 190,1 (s, C-4), 164,7 (s, C-8a), 163,6 (s, C-7), 157,6 (s, C-4'), 131,4 (s, C-1'), 129,3 (s, C-5), 128,4 (d, C-2', C-6'), 115,2 (d, C-3', C- 5'), 110,5 (s, C-4a), 114,8 (d, C-6), 102,8 (d, C-8), 79,0 (d, C-2), 43,2 (t, C-3), (PL-14) Sativanone (DT.15): chất bột màu trắng: (C17H16O5, M = 300); 1H-NMR (500 MHz, Acetone-d6) H: 9,40 (1H, br s, 7-OH), 7,77 (1H, d, 9,0 Hz, H-5), 7,01 (1H, d, 8,5 Hz, H-6'), 6,59 (1H, d, 2,5 Hz, H-8), 6,58 (1H, dd, 9,0, 2,5 Hz, H-6), 6,48 (1H, dd, 8,5, 2,5 Hz, H-5'), 6,40 (1H, d, 2,5 Hz, H-3'), 4,56 (1H, t, 11,0 Hz, H-2ax), 4,45 (1H, dd, 11,0, 5,5 Hz, H-2eq), 4,18 (1H, dd, 11,0, 5,5 Hz, H-3), 3,79 (3H, s, 2'-OCH3), 3,78 (3H, s, 4'-OCH3), (PL-15). 13C-NMR (125 MHz, Acetone-d6) C: 190,7 (C-4), 164,5 (C-7), 164,3 (C-8a), 161,1 (C-4'), 159,1 (C-2'), 131,2 (C-5), 129,7 (C-6'), 117,0 (C-1'), 115,6 (C-4a), 110,8 (C-6), 105,3 (C-5'), 103,1 (C-3'), 99,2 (C-8), 71,4 (C-2), 55,6 (4'-OCH3), 55,2 (2'- OCH3), 47,6 (C-3), (PL-15). 3'-O-methylviolanone (DT.16): chất bột màu trắng, (C18H18O6, M = 330), 1H- NMR (500 MHz, CD3OD): 6,54 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), 6,86 (1H, d, 8,5 Hz, H-6'), 6,36 (1H, d, 2,5 Hz, H-8), 6,54 (1H, dd, 8,5, 2,5 Hz, H-6), 6,75 (1H, d, 8,5 Hz, H-5'), 4,55 (1H, t, 11,5 Hz, Ha-2), 4,15 (1H, dd, 11,5, 5,5 Hz, Hb-2), 4,44 (1H, dd, 11,5, 5,5 Hz, H-3), 3,82 (3H, s, 4'-OCH3), 3,83 (3H, s, 2'-OCH3), 3,85 (3H, s, 4'-OCH3), (PL-16). 66 13C-NMR (125MHz, CD3OD): 194,2 (s, C-4), 166,5 (s, C-7), 165,8 (s, C-8a), 155,1 (s, C-4'), 153,2 (s, C-2'), 130,4 (d, C-5), 126,0 (d, C-6'), 123,1 (s, C-1'), 143,6 (s, C-3'), 108,8 (d, C-5'), 111,8 (d, C-6), 115,6 (s, C-4a), 103,7 (d, C-8), 72,3 (t, C-2), 61,2 (q, 3'-OCH3), 61,0 (q, 2'-OCH3), 56,0 (q, 4'-OCH3), 49,5 (d, C-3), (PL-16). Sulfuretin (DT.17): Chất bột màu vàng; (C15H10O5, M = 270); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) H: 7,60 (1H, d, 8,5 Hz, H-5), 7,44 (1H, d, 2,0 Hz, H-8), 7,23 (1H, d, 2,0, 8,5 Hz, H-6), 6,83 (1H, d, 8,5 Hz, H-5'), 6,74 (1H, d, 2,0 Hz, H-2'), 6,69 (1H, dd, 2,0, 8,5 Hz, H-6'), 6,62 (1H, s, H-2), (PL-17). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) C: 181,2 (C-4), 167,5 (C-7), 166,3 (C- 8a), 148,2 (C-4'), 145,7 (C-3), 145,6 (C-3'), 125,7 (C-5), 124,5 (C-1'), 123,4 (C- 6'), 117,9 (C-2'), 116,0 (C- 5'), 113,1 (C-4a), 112,9 (C-6), 111,9 (C-2), 98,4 (C-8), (PL-17). Formononetin (DT.18): chất bột màu vàng, vô định hình, (C16H14O4, M = 270), 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 8,18 (1H, s, H-2), 8,06 (1H, d, J=8,5 Hz, H-5), 6,99 (1H dd, J=8,5, 2,5 Hz, H-6), 6,90 (1H, d, J=2,5 Hz, H-8), 7,56, (2H, d, J=8,5 Hz, H-2', H-6'), 6,98 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3', H-5'), 3,83(3H, s, 4'-OCH3), (PL-18). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 178,1 (s, C-4), 164,9 (s, C-7), 161,1 (s, C-4'), 159,8 (s, C-8a), 154,8 (d, C-2), 131,4 (d, C-2', C-6'), 128,5 (d, C-5), 125,7 (s, C-3), 125,6 (s, C-1'), 118,1 (s, C-4a), 116,6 (d, C-6), 114,9 (d, C-3', C-5'), 103,3 (d, C-8), 55,7 (q, 4'- OCH3), (PL-18). 67 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ VI PHẪU VÀ DNA CỦA CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) Cho đến thời điểm này, chỉ có một công trình nghiên cứu cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) về mặt thực vật sinh học phân tích ADN trong nước [14] và ba công trình ngoài nước [80-82]. Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào đầy đủ và kỹ lưỡng về mặt thực vật (đặc biệt là đặc điểm vi học chưa có một công bố nào). Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu các đặc điểm vi học của thân, lá và vi học bột thân của cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) và sử dụng DNA Markers để hỗ trợ cho phân loại hình thái cũng như bổ sung cơ sở dữ liệu di truyền cho loài này. 3.1.1. Kết quả nghiên cứu vi phẫu cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 3.1.1.1. Vi phẫu lá Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) Mặt cắt ngang qua lá cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) gồm 2 phần: phiến lá và gân lá. Phần gân lá lồi lên rõ ràng ở mặt dưới của phiến lá. Biểu bì trên (2) là một lớp tế bào có kích thước tương đối đồng đều nhau mang lông che chở (1); Mô dày trên (3) gặp ở phần gân chính của phiến lá, gồm các tế bào đỏ đậm, có vách dày, xếp thành hình trụ; Mô cứng gồm 3-5 lớp tế bào có vách dày, màu xanh, xếp thành hình cung bao lấy phía trên (4) và phía dưới (7) của bó libe gỗ; Gỗ (5) gồm các bó mạch gỗ có kích thước lớn ở phía dưới và nỏ ở phía trên, xếp xen kẽ với các cụm mô mềm gỗ; Libe (6) gồm các nhóm tế bào có kích thước nhỏ, xếp thành cung phía trong vòng mô cứng; Mô dày dưới (8) có khoảng 3-5 lớp tế bào vách dày, màu đỏ đậm; Mô mềm (9) gồm các tế bào màu đỏ, vách mỏng, kích thước và hình thái thay đổi; Biểu bì dưới (10) cấu tạo bởi một lớp tế bào có kích thước tương đối đều nhau, mỗi tế báo có kích thước nhỏ hơn mỗi tế bào của biểu bì trên và không mang lông che chở. Cấu tạo phiến lá; Biểu bì trên và dưới tiếp nối từng phần gân lá (11), (12); Mô giậu (13) gồm 1-2 hàng tế bào dài và hẹp xếp sít nhau. Hạ bì trên (12) gồm vài tế bào có kích thước lớn, mỏng bắt màu hồng nhạt, sắp xếp không theo qui luật. 68 H