Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Uvaria L. - Họ Na (Annonaceae)

c chế tốt và có tính chọn lọc trên 6 dòng tế bào ung thư thử 50 nghiệm với các giá trị IC50 từ 0,62–7,51 µg/mL. Đặc biệt đối với dòng MDA- MB-231 (ung thư vú) và MKN-7 (ung thư dạ dày), cao chiết MeOH có tác dụng ức chế rất mạnh thậm chí hơn cả chất đối chứng, ellipticine. Bên cạnh đó, ngoại trừ cao chiết nước không thể hiện hoạt tính, cả 4 cao chiết phân đoạn còn lại của loài này đều có tác dụng ở các mức độ khác nhau, trong đó phân đoạn CHCl3 (Ug−C) và n-hexane (Ug−H) thể hiện hoạt tính mạnh nhất với các giá trị IC50 rất thấp. Kết quả này được giải thích là do sự hiện diện của các nhóm chất có hoạt tính gây độc tế bào mạnh như acetogenin, dẫn xuất đa oxy hóa của cyclohexene trong các phân đoạn có độ phân cực yếu và trung bình [15]. Cao chiết MeOH (UcL−M) từ lá Bù dẻ lá lớn có hoạt tính trung bình với giá trị IC50 từ 15,63–18,51 µg/mL trong khi cao chiết MeOH (UcT−M) từ thân của loài này hầu như không thể hiện hoạt tính. Các nghiên cứu chi tiết hơn về hoạt tính gây độc tế bào in vitro của lá cây Bù dẻ lá lớn cho thấy, ngoại trừ phân đoạn nước (UcL−W), các phân đoạn còn lại thể hiện hoạt tính rất mạnh trên hai dòng tế bào LU-1 và MKN-7 với giá trị IC50 từ 0,13–1,09 µg/mL. Trong đó, phân đoạn EtOAc (UcL−E) thể hiện hoạt tính tốt nhất trên cả hai dòng tế bào này với IC50 lần lượt là 0,20 và 0,13 µg/mL. Các phân đoạn n-hexane (UcL−H) và CHCl3 (UcL−C) cũng thể hiện hoạt tính tốt, hơn cả ellipticine trong khi phân đoạn n-BuOH (UcL−B) thể hiện hoạt tính tương đương. Kết quả sàng lọc trên gợi ý rằng các thành phần có hoạt tính của lá cây Bù dẻ lá lớn có hàm lượng nhỏ và phân bố rải rác trong các phân đoạn n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH. Cao chiết MeOH (Uf−M) có hoạt tính ức chế trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 từ 21,54–69,04 µg/mL. Trong đó, cao chiết này cho hoạt tính tốt nhất với giá trị IC50 thấp nhất trên dòng LU-1 (IC50 = 21,54 µg/mL). Tuy nhiên, kết quả cũng cho thấy hoạt tính không mạnh của loài Bù dẻ râu bởi giá trị IC50 trên tất cả các dòng tế bào nghiên cứu đều khá lớn.  Nhận định: Kết quả sàng lọc sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào ung thư cho thấy nhìn chung loài Bù dẻ tía có tác dụng mạnh hơn loài Bù dẻ lá lớn và loài Bù dẻ râu. Do vậy, các nghiên cứu về thành phần hóa học tiếp theo ưu tiên tập trung vào loài Bù dẻ tía. Việc đánh giá sơ bộ thành phần hóa học của các cao chiết phân đoạn bằng TLC đã chỉ ra hầu hết thành phần hóa học của phân đoạn n- 51 hexane đều có mặt trong phân đoạn CHCl3 nên CHCl3 được sử dụng để chiết phân bố cao chiết MeOH mà không cần phải chiết qua n-hexane nhằm làm giàu các cấu tử cũng như thuận tiện hơn trong thao tác phân lập các hoạt chất. Thông thường, các cấu tử thuộc phân đoạn n-BuOH có thể được phân lập từ phân đoạn nước sau khi loại bỏ các hợp chất ion bằng cột sắc ký Dianion nên không cần thiết sử dụng n-BuOH trong quá trình chiết xuất các phân đoạn. Tương tự, kết quả sàng lọc hoạt tính và đánh giá thành phần hóa học của các phân đoạn bằng TLC cũng định hướng việc nghiên cứu hóa học tập trung vào phân đoạn CHCl3, EtOAc của lá cây Bù dẻ lá lớn và phần trên mặt đất của loài Bù dẻ râu. 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất được phân lập từ loài Bù dẻ tía, Bù dẻ lá lớn và Bù dẻ râu Bằng cách kết hợp các phương pháp sắc ký, tổng cộng có 25 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc từ các loài Bù dẻ tía (10 hợp chất), Bù dẻ lá lớn (9 hợp chất) và Bù dẻ râu (6 hợp chất) bao gồm: - 6 Terpenoid (UGC9, UCC11, UCC12, UCE3BII, UCE4I, UFC1) - 5 Hợp chất đa oxy hóa của cyclohexene (UGC4, UGC5, UGC6, UGC8, UGLE1) - 3 Steroid (UCC10, UFC3B1, UFE4A) - 3 Alkaloid (UCE8, UCE9, UFE3A) - 3 Glycoside (UGLW1, UGLW3, UFE5B) - 2 Saponin triterpenoid (UGW1, UGW2) - 1 Flavonoid (UFE7A) - 2 Hợp chất thơm (UCC5, UCC6) Đặc biệt, bốn hợp chất UGLE1, UGLW3, UCC5 và UFE5B là chất mới cùng nhiều hợp chất được phân lập lần đầu tiên từ chi Uvaria (UGW1, UGW2, UGLW1, UCC6, UCC11, UCC12 và UFC3B1). Cấu trúc hóa học của chúng được chỉ ra ở Hình 4.1–Hình 4.3. 52 Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ phần trên mặt đất của loài Bù dẻ tía Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ lá cây Bù dẻ lá lớn 53 Hình 4.3. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ phần trên mặt đất của loài Bù dẻ râu 4.2.1. Các hợp chất được phân lập từ loài Bù dẻ tía 4.2.1.1. Hợp chất UGLE1 (chất mới): ()-3-O-Debenzoylzeylenone Hợp chất UGLE1 được tách ra dưới dạng tinh thể không màu, mp 123– 124 oC, 20[ ]D -13,8 (c 0,4, CHCl3). Phổ UV (MeOH) (Hình 4.6) đề nghị sự có mặt của nhân thơm (λmax 268 nm) và enone (λmax 235 nm). Píc ion giả phân tử tại m/z 301,0679 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C14H14O6Na là 301,0688) trên phổ HR-ESI-MS (Hình 4.7) cho phép xác định CTPT của hợp chất UGLE1 là C14H14O6. Phổ 1H-NMR (CDCl3) (Hình 4.8) của hợp chất này chỉ ra các tín hiệu đặc trưng của 5 proton thơm tại δH 7,41–7,95 (5H), 2 proton olefin [δH 6,14 (dd, J = 10,5, 2,0 Hz, H-5) và 6,91 (dd, J = 10,5, 3,5 Hz, H-4)], 2 proton của nhóm oxymethylene [δH 4,60 (d, J = 11,5 Hz, H-7a) và 4,78 (d, J = 11,5 Hz, H-7b) và 2 proton của 2 nhóm oxymethine [δH 3,98 (d, J = 5,5 Hz, H-2) và 4,69 (m, H-3)]. Phổ 13C-NMR (Hình 4.10), DEPT (Hình 4.11) và HSQC (Hình 4.12) chỉ ra 14 54 tín hiệu gồm 2 carbon carbonyl và carboxylic (δC 195,4, 166,9), 6 carbon thơm (δC 128,5, 129,1, 129,9, 133,6), 2 carbon olefin (δC 126,9, 148,2), 1 carbon của nhóm oxymethylene (δC 64,1), 2 carbon của 2 nhóm oxymethine (δC 68,1, 74,2) và 1 carbon bậc bốn gắn với oxy (δC 76,3). Tín hiệu của các proton thơm tại δH 7,41 (t, J = 8,0 Hz, H2-3′/5′), 7,56 (tt, J = 8,0, 1,0 Hz, H-4′) và 7,95 (dd, J = 8,0, 1,0 Hz, H2-2′/6′) cùng với tương tác HMBC (Hình 4.5) giữa H2-2′/6′ (δH 7,95) và C-7′ (δC 166,9) đề nghị sự hiện diện của hợp phần benzoyl. Mặt khác, tương tác COSY giữa H-3 (δH 4,69) và H-2 (δH 3,98)/H-4 (δH 6,91), giữa H-4 (δH 6,91) và H-5 (δH 6,14) cùng các tương tác HMBC giữa H-2 (δH 3,98) và C-3 (δC 68,1)/C-4 (δC 148,2)/C-6 (δC 195,4), giữa H-4 (δH 6,91) và C-2 (δC 74,2)/C-6 (δC 195,4), giữa H-5 (δH 6,14) và C-1 (δC 76,3)/C-3 (δC 68,1) chứng tỏ hợp chất UGLE1 sở hữu hợp phần trioxycyclohexenone với nối đôi tại C-4/C-5 và nhóm ketone tại C-6. Phân tích chi tiết phổ HSQC, HMBC (Hình 4.13) và COSY (Hình 4.14) cho thấy 2 proton của nhóm oxymethylene H-7a (δH 4,60) và H-7b (δH 4,78) tương tác với C-1 (δC 76,3)/C-2 (δC 74,2)/C-6 (δC 195,4)/C-7′ (δC 166,9). Dữ kiện này chứng tỏ C-1 và nhóm benzoyloxy cùng liên kết trực tiếp với C-7. Hình 4.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất UGLE1 và hợp chất tham khảo Hình 4.5. Tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất UGLE1 55 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất UGLE1 và hợp chất tham khảo C δC #, a δC a, b DEPT δH a, c (J, Hz) HMBC (H→C) 1 76,3 76,3 C  − 2 74,0 74,2 CH 3,98 d (5,5) 3, 4, 6 3 68,0 68,1 CH 4,69 m 2, 5 4 147,9 148,2 CH 6,91 dd (10,5, 3,5) 2, 6 5 129,0 126,9* CH 6,14 dd (10,5, 2,0) 1, 3 6 195,2 195,4 C  − 7 64,1 64,1 CH2 4,60 d (11,5) 1, 2, 6, 7′ 4,78 d (11,5) 1, 2, 6, 7′ 1′ 126,9 129,1* C  2′/6′ 129,9 129,9 CH 7,95 dd (8,0, 1,0) 3′/5′ 128,5 128,5 CH 7,41 t (8,0) 4′ 133,6 133,6 CH 7,56 tt (8,0, 1,0) 7′ 166,9 166,9 C  #C của ()-3-O-debenzoylzeylenone [157], *giá trị được gán lại bằng phổ 2D-NMR, ađo trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz. Hình 4.6. Phổ UV của hợp chất UGLE1 Hình 4.7. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất UGLE1 56 Hình 4.8. Phổ 1H-NMR của hợp chất UGLE1 Hình 4.9. Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất UGLE1 57 Hình 4.10. Phổ 13C-NMR của hợp chất UGLE1 Hình 4.11. Phổ DEPT của hợp chất UGLE1 58 Hình 4.12. Phổ HSQC của hợp chất UGLE1 Hình 4.13. Phổ HMBC của hợp chất UGLE1 59 Hình 4.14. Phổ COSY của hợp chất UGLE1 Hình 4.15. Phổ NOESY của hợp chất UGLE1 60 Cấu hình tương đối của hợp chất UGLE1 được xác định qua phân tích các hằng số tương tác và dữ kiện phổ NOESY (Hình 4.15). Cụ thể, hằng số tương tác giữa H-2 (δH 3,98) và H-3 (δH 4,69) (J2,3 = 5,5 Hz) đề nghị quan hệ axial/pseudo- axial giữa chúng cũng như quan hệ 2,3-anti-dihydroxy [126]. Trên phổ NOESY, tương tác mạnh giữa H-2 (δH 3,98) và H-7a (δH 4,60)/H-7b (δH 4,78) và sự thiếu vắng các tương tác giữa H-2 (δH 3,98) và H-3 (δH 4,69), giữa H-3 (δH 4,69) và H- 7a (δH 4,60)/H-7b (δH 4,78) khẳng định sự có mặt của nhóm 1,2-syn-dihydroxy. Các dữ kiện phổ (UV, MS, NMR) xác nhận hợp chất UGLE1 có cấu trúc phẳng và cấu hình tương đối hoàn toàn giống với hợp chất ()-3-O- debenzoylzeylenone, được tách ra từ loài U. purpurea [157]. Mặt khác, năng suất quay cực của hợp chất UGLE1 ( 2 0[ ]D -13,8 (c 0,4, CHCl3)) ngược dấu với hợp chất ()-3-O-debenzoylzeylenone ([ ]D +11,7 (c 0,36, CHCl3) [157], [ ]D +12,5 (c 0,4, CHCl3) [126]). Hơn nữa, phổ CD của hợp chất UGLE1 (Hình 4.16) chỉ ra hiệu ứng Cotton âm tại  233 nm ([] -10433) tương tự hợp chất ()- zeylenone [(1S,2S,3R)-1,2-dihydroxy-3-benzoyloxy-6-oxocyclohex-4-en-1- ylmethyl benzoate] [156], gợi ý hai hợp chất này có cấu hình tuyệt đối giống nhau. Do vậy, hợp chất UGLE1 được xác định là đối quang của ()-3-O- debenzoylzeylenone với danh pháp khoa học là (1S,2S,3R)-1,2,3-trihydroxy-6- oxocyclohex-4-en-1-ylmethyl benzoate. Sau cùng, cấu trúc hóa học của hợp chất UGLE1 được xác nhận lại một cách chắc chắn bằng phương pháp nhiễu xạ tia X (Hình 4.17) (Phụ lục 2). Hình 4.16. Phổ CD của hợp chất UGLE1 Hình 4.17. Cấu trúc nhiễu xạ tia X của hợp chất UGLE1 61 Quá trình nghiên cứu cấu trúc của hợp chất này cũng ghi nhận sự ảnh hưởng mạnh của dung môi đo mẫu với các dữ kiện phổ NMR của nó (Bảng 4.3). Cụ thể, tín hiệu của C-3, C-4 có xu hướng dịch chuyển mạnh về phía trường thấp khi thay CDCl3 bằng CD3OD (Phụ lục 2) trong khi tín hiệu của C-7 thay đổi theo chiều ngược lại. Sự dịch chuyển mạnh nhất được xác định tại C-4 (ΔδC = 4,8 ppm) của vòng cyclohexenone. Hiện tượng này cũng được quan sát trên hợp chất tương tự, ()-3-O-debenzoylzeylenone, trong nghiên cứu trước đây [δC-4 = 147,8 (CDCl3), 152,7 (acetone-d6)] [126]. Ngoài ra, hằng số tương tác giữa H-2 và H-3 cũng phụ thuộc đáng kể vào dung môi [J2,3 = 5,5 Hz (CDCl3), J2,3 = 7,5 Hz (CD3OD)]. Những đặc điểm vừa nêu có thể được giải thích là do hợp chất UGLE1 tồn tại ở các cấu dạng chính khác nhau trong các dung môi khác nhau mà mỗi cấu dạng lại sở hữu những đặc trưng riêng về mặt cấu trúc. Đây là điểm cần lưu ý khi nghiên cứu cấu trúc của hợp chất này cũng như các hợp chất tương tự. Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR (CDCl3, CD3OD) của hợp chất UGLE1 C CDCl3 CD3OD δC a δH b (J, Hz) δC a δH b (J, Hz) 1 76,3  77,2 2 74,2 3,98 d (5,5) 75,7 3,99 d (7,5) 3 68,1 4,69 m 70,2 4,62 dt (7,5, 2,5) 4 148,2 6,91 dd (10,5, 3,5) 153,0 7,00 dd (10,5, 2,5) 5 126,9 6,14 dd (10,5, 2,0) 127,6 6,07 dd (10,5, 2,5) 6 195,4  197,5  7 64,1 4,60 d (11,5) 63,3 4,50 d (10,5) 4,78 d (11,5) 4,69 d (10,5) 1′ 129,1  131,1  2′/6′ 129,9 7,95 dd (8,0, 1,0) 130,4 7,94 dd (8,0, 1,0) 3′/5′ 128,5 7,41 t (8,0) 129,5 7,46 t (8,0) 4′ 133,6 7,56 tt (8,0, 1,0) 134,3 7,60 tt (8,0, 1,0) 7′ 166,9  167,2  a125 MHz, b500 MHz. 4.2.1.2. Hợp chất UGC4: Pipoxide chlorohydrin Hợp chất UGC4 được tách ra dưới dạng bột màu trắng, mp 207–208 oC, 20[ ]D +91,5 (c 0,1, CHCl3). Phổ UV (MeOH) cho đỉnh hấp thụ cực đại tại λ 242 và 275 nm. Phổ 1H-NMR chỉ ra các tín hiệu sau: 10 proton aromatic tại δH 7,45– 8,07, 2 proton olefin tại δH 5,88 và 6,04, 1 nhóm oxymethylene tại δH 4,73, 3 nhóm methine tại δH 4,35, 4,82 và 5,80. Phổ 13C-NMR và DEPT chỉ ra sự có mặt 62 của 1 nhóm oxymethylene (δC 69,0), 2 nhóm benzoyloxy (δC 129,5–168,0), 1 liên kết đôi (δC 128,5 và 129,6), 2 nhóm oxymethine (δC 70,7 và 75,3), 1 nhóm chloromethine (δC 58,6) và 1 carbon bậc bốn gắn với oxy (δC 76,6). Các dữ kiện phổ trên đề nghị UGC4 là một hợp chất đa oxy hóa của cyclohexene. Các tương tác COSY giữa H-2 (δH 4,35)/H-3 (δH 5,80)/H-4 (δH 5,88)/H-5 (δH 6,04)/H-6 (δH 4,82) cho phép thiết lập trật tự liên kết C-2/C-3/C-4/C-5/C-6. Phổ HMBC chỉ ra các tương tác giữa H-2 (δH 4,35) và C-3 (δC 75,3), giữa H-3 (δH 5,80) và C-4 (δC 128,5), giữa H-4 (δH 5,88) và C-2 (δC 70,7)/C-5 (δC 129,6)/C-6 (δC 58,6) chứng tỏ hợp chất UGC4 sở hữu khung trioxycyclohexene với nối đôi tại C-4/C-5. Ngoài ra, H-7 (δH 4,73) tương tác với C-1 (δC 76,6)/C-6 (δC 58,6)/C-7′ (δC 168,0); 1-OH (δH 4,59) tương tác với C-7 (δC 69,0) trên phổ HMBC đề nghị nhóm benzoyloxy và vòng cyclohexene cùng liên kết với C-7 (δC 69,0) (Hình 4.19a). Nhóm benzoyloxy còn lại được đề nghị tại C-3 dựa vào sự dịch chuyển mạnh về phía trường thấp của C-3 (δC 75,3) so với C-2 (δC 70,7) cũng như tham khảo các giá trị tương ứng ở tài liệu [153]. Cấu hình tương đối của hợp chất UGC4 được thiết lập dựa vào việc phân tích các hằng số tương tác (J). Cụ thể, hằng số tương tác giữa H-2 (δH 4,35) và H-3 (δH 5,80) (J2,3 = 7,5 Hz) (so với các giá trị tham khảo Jaa′ = 8,4 Hz [8]) gợi ý quan hệ trans-axial/pseudo- axial (trans-a/a) giữa chúng. Hơn nữa, hằng số tương tác giữa H-5 (δH 6,04) và H-6 (δH 4,82) (J5,6 = 5,0 Hz) (so với các giá trị tham khảo J5/6a = 1,9 Hz, J5/6e = 5,3 Hz [8]) đề nghị H-6 định hướng pseudo-equatorial (e′) [8, 68] với cấu dạng chính được chỉ ra ở Hình 4.19b [70]. Hình 4.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất UGC4 Hình 4.19. Tương tác HMBC, COSY (a) và cấu dạng (b) chính của hợp chất UGC4 63 Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất UGC4 và hợp chất tham khảo C δC # δC a, b DEPT δH a, c (J, Hz) HMBC (H→C) 1 74,8 76,6 C  − 2 68,6 70,7 CH 4,35 d (7,5) 3 3 73,8 75,3 CH 5,80 br.d (7,5) 2, 4 4 127,9 128,5 CH 5,88 dd (10,0, 2,5) 2, 5, 6 5 127,9 129,6 CH 6,04 ddd (10,0, 5,0, 2,0) 4 6 57,5 58,6 CH 4,82 br.d (5,0) 7 67,7 69,0 CH2 4,73 * 1, 6, 7′ 1′ 128,9 131,3 C  − 2′/6′ 129,6 130,6 CH (x2) 8,06 m 3′/5′ 128,9 129,5 CH (x2) 7,50 m 4′ 133,3 134,3 CH (x2) 7,61 m 7′ 165,7 167,9 C  − 1″ 128,9 131,3 C  − 2″/6″ 129,6 130,7 CH (x2) 8,06 m 3″/5″ 128,9 129,6 CH (x2) 7,50 m 4″ 133,3 134,3 CH (x2) 7,61 m 7″ 165,7 168,0 C − − 1-OH − − − 4,59 br.s 7 #C của pipoxide chlorohydrin đo trong DMSO-d6 [153], ađo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập. Kết hợp các dữ kiện phổ, hằng số vật lý và so sánh với chất tham khảo ở tài liệu [153] cho phép kết luận UGC4 là pipoxide chlorohydrin. Hợp chất này đã được phân lập từ một số loài thuộc chi Piper như P. hookeri, P. nigrum [69], P. attenuatum [153] và loài U. grandiflora [83]. 4.2.1.3. Hợp chất UGC5: ()-Zeylenone Hợp chất UGC5 được tách ra dưới dạng bột màu trắng, mp 156–159 oC, 20[ ]D -122,2 (c 0,24, CHCl3). Phổ UV (MeOH) cho các đỉnh hấp thụ cực đại tại λ 232 và 274 nm. Phổ ESI-MS cho píc cơ sở tại m/z 417,5 [M-H+2H2O] -. Kết hợp với phổ 13C-NMR cho phép dự đoán CTPT của hợp chất UGC5 là C21H18O7 (M = 382). Phổ 1H-NMR (DMSO-d6) của hợp chất này chỉ ra các tín hiệu đặc trưng của 10 proton thơm tại δH 7,51–7,92 (10H), 2 proton olefin [δH 6,17 (dd, J = 10,5, 2,5 Hz, H-5) và 7,07 (dd, J = 10,5, 2,0 Hz, H-4)], 2 proton của nhóm oxymethylene [δH 4,36 (d, J = 10,0 Hz, H-7a) và 4,57 (d, J = 10,0 Hz, H-7b)] và 2 proton của 2 nhóm oxymethine [δH 4,26 (dd, J = 8,5, 6,5 Hz, H-2) và 5,98 (ddd, J = 8,5, 2,5, 2,0 Hz, H-3)]. Phổ 13C-NMR, DEPT và HSQC chỉ ra 21 tín hiệu gồm 1 64 carbon carbonyl (δC 195,1), 2 carbon acyloxy (δC 165,0, 165,6), 12 carbon thơm [δC 128,7 (x4), 129,1 (x2), 129,4 (x2), 129,5 (x2), 133,4, 133,5], 2 carbon olefin (δC 127,9, 147,4), 1 carbon của nhóm oxymethylene (δC 61,4), 2 carbon của 2 nhóm oxymethine (δC 71,3, 72,3) và 1 carbon bậc bốn gắn với oxy (δC 76,1). Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất UGC5 và hợp chất tham khảo C δC # δC a, b DEPT δH a, c (J, Hz) HMBC (H→C) 1 77,2 76,1 C  − 2 71,7 71,3 CH 4,26 dd (8,5, 6,5) 3, 4, 7 3 69,4 72,3 CH 5,98 ddd (8,5, 2,5, 2,0) 2, 4, 5, 6, 7′′ 4 142,7 147,4 CH 7,07 dd (10,5, 2,0) 2, 6 5 128,6 127,9 CH 6,17 dd (10,5, 2,5) 1, 3 6 196,6 195,1 C  − 7 65,3 61,4 CH2 4,36 d (10,0) (H-7a) 1, 2, 6, 7′ 4,57 d (10,0) (H-7b) 1, 2, 6, 7′ 1′ 128,8 129,4 C  − 2′/6′ 129,7 129,1 CH x2 7,91 dd (8,5, 1,0) 3′/5′ 128,4 128,7 CH x2 7,54 m 4′ 133,4 133,4 CH 7,67 m 7′ 165,4 165,0 C  − 1″ 129,1 129,4 C  − 2″/6″ 129,9 129,5 CH x2 8,08 dd (8,5, 1,0) 3″/5″ 128,6 128,7 CH x2 7,54 m 4″ 133,7 133,5 CH 7,67 m 7″ 166,2 165,6 C  − 1-OH    6,33 s 1, 2, 6, 7 2-OH    6,03 d (6,5) 1, 2, 3 #C của zeylenone đo trong CDCl3 [82], ađo trong DMSO-d6, b125 MHz, c500 MHz. Hình 4.20. Cấu trúc hóa học của hợp chất UGC5 Hình 4.21. Tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất UGC5 65 Tín hiệu của các proton thơm tại δH 7,54 (m, H-3′/5′/3″/5″), 7,67 (m, H- 4′/4″), 7,91 (dd, J = 8,5, 1,0 Hz, H2-2′/6′) và 8,08 (dd, J = 8,5, 1,0 Hz, H2-2″/6″) gợi ý sự hiện diện của 2 nhân benzene thế mono. Hơn nữa, các tương tác HMBC giữa H2-2′/6′ (δH 7,91) và C-7′ (δC 165,0), giữa H2-2″/6″ (δH 8,08) và C-7″ (δC 165,6) đề nghị sự tồn tại của 2 nhóm benzoyl trong cấu trúc của hợp chất này. Ngoài ra, các tương tác COSY giữa H-2 (δH 4,26)/H-3 (δH 5,98)/H-4 (δH 7,07)/H- 5 (δH 6,17) và tương tác HMBC giữa H-2 (δH 4,26) và C-3 (δC 72,3)/C-4 (δC 147,4), giữa H-3 (δH 5,98) và C-2 (δC 71,3)/C-4 (δC 147,4)/C-5 (δC 127,9), giữa H-4 (δH 7,07) và C-2 (δC 71,3)/C-6 (δC 195,1), giữa H-5 (δH 6,17) và C-1 (δC 76,1)/C-3 (δC 72,3), giữa H-7 (δH 4,36, 4,57) và C-1 (δC 76,1)/C-2 (δC 71,3)/C-6 (δC 195,1) cho phép khẳng định cấu trúc trioxy-methylcylohexenone. Tiếp đó, vị trí liên kết của 2 nhóm benzoyl được xác định tại C-3 (δC 72,3) và C-7 (δC 61,4) dựa vào các tương tác HMBC H-3 (δH 5,98)/C-7″ (δC 165,6) và H-7 (δH 4,36, 4,57)/C-7′ (δC 165,0). Hóa lập thể của hợp chất UGC5 được thiết lập dựa vào việc phân tích các hằng số tương tác và phổ NOESY. Theo đó, hằng số tương tác giữa H-2 (δH 4,26) và H-3 (δH 5,98) (J2,3 = 8,5 Hz) đề nghị mối quan hệ trans-axial/pseudo- axial giữa chúng. Ngoài ra, các hằng số tương tác giữa H-3 (δH 5,98) và H-4 (δH 7,07) (J3,4 = 2,0 Hz), giữa H-3 (δH 5,98) và H-5 (δH 6,17) (J3,5 = 2,5 Hz) cũng góp phần xác nhận định hướng pseudo-axial của H-3 [8, 82]. Tương tác NOESY giữa H-2 (δH 4,26) và H-7a (δH 4,36), giữa 1-OH (δH 6,33) và 2-OH (δH 6,03) chứng minh mối quan hệ cis-vicinal của 2 nhóm hydroxy tại C-1, C-2 (Hình 4.21). Các phân tích trên cho thấy hợp chất UGC5 có cấu trúc tương tự hợp chất UGLE1 ngoại trừ sự xuất hiện thêm một nhóm benzoyloxy thay cho nhóm hydroxy tại C-3. Kết hợp so sánh với số liệu phổ của hợp chất tham khảo ở tài liệu [82], hợp chất UGC5 được khẳng định là ()-zeylenone với cấu hình tuyệt đối của các trung tâm lập thể là 1S, 2S, 3R. Hợp chất này được phân lập lần đầu tiên từ hạt U. tonkinensis dưới tên gọi ()-tonkinenin A [188]. Tuy nhiên, cấu hình tuyệt đối của ()-tonkinenin A được đề nghị thời điểm đó là 1R, 2S, 3S. Năm 1999, bằng phương pháp tổng hợp điều khiển đối quang (enantiocontrolled 66 synthesis), Hiroya và Ogasawara đã chỉ ra sai lầm trên đồng thời xác nhận ()- tonkinenin A chính là ()-zeylenone [45]. Tương tự hợp chất UGLE1, dữ kiện phổ NMR của hợp chất UGC5 cũng bị ảnh hưởng mạnh bởi dung môi (Phụ lục 4). Khi đo trong cùng dung môi (CDCl3), số liệu phổ của hợp chất này hoàn toàn trùng khớp với số liệu phổ của hợp chất tham khảo [82]. Điều này cho phép khẳng định lại chắc chắn cấu trúc đã thiết lập. Tuy nhiên, khi thay bằng các dung môi proton hóa hoặc có độ phân cực lớn hơn, tín hiệu của C-3, C-4 dịch chuyển mạnh về phía trường thấp trong khi tín hiệu của C-7 dịch chuyển theo chiều ngược lại (Bảng 4.6). Nhìn chung, sự thay đổi mạnh nhất của dữ kiện phổ 13C-NMR được quan sát khi thay CDCl3 bằng CD3OD. Ngoài ra, dung môi còn ảnh hưởng đáng kể đến dữ kiện phổ 1H- NMR đặc biệt là hằng số tương tác giữa H-2 và H-3 [J2,3 = 3,5 Hz (CDCl3), 5,5 Hz (CDCl3 & CD3OD), 7,5 Hz (CD3OD), 8,5 Hz (DMSO-d6)] (Bảng 4.7). Sự khác biệt này gắn liền với sự thay đổi cấu dạng của hợp chất UGC5 trong các dung môi khác nhau. Bảng 4.6. Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, CDCl3 & CD3OD, CD3OD, DMSO-d6) của hợp chất UGC5 C δC CDCl3 CDCl3 & CD3OD CD3OD DMSO-d6 1 77,2 76,6 77,7 76,1 2 71,7 71,7 73,0 71,3 3 69,3 70,6 73,5 72,3 4 142,7 144,1 147,7 147,4 5 128,6 128,5 129,4 127,9 6 196,2 195,8 196,9 195,1 7 65,4 63,8 63,4 61,4 1′ 128,8 129,1 131,0 129,4 2′/6′ 129,7 129,4 130,5 129,1 3′/5′ 128,4 128,2 129,6 128,7 4′ 133,4 133,1 134,3 133,4 7′ 165,3 165,8 167,2 165,0 1″ 129,2 128,8 131,0 129,4 2″/6″ 129,8 129,6 130,8 129,5 3″/5″ 128,6 128,4 129,6 128,7 4″ 133,8 133,4 134,5 133,5 7″ 166,2 166,1 167,5 165,6 67 Bảng 4.7. Số liệu phổ 1H-NMR (CDCl3, CDCl3 & CD3OD, CD3OD, DMSO-d6) của hợp chất UGC5 C δH (J, Hz) CDCl3 CDCl3 & CD3OD CD3OD DMSO-d6 1     2 4,37 brs 4,37 d (5,5) 4,42 d (7,5) 4,26 dd (8,5, 6,5) 3 5,96 ddd (4,0, 3,5, 0,5) 6,01 m 6,10 ddd (7,5, 2,5, 2,0) 5,98 ddd (8,5, 2,5, 2,0) 4 6,96 ddd (10,0, 4,0, 1,5) 6,93 dd (10,5, 3,5) 7,04 dd (10,5, 2,5) 7,07 dd (10,5, 2,0) 5 6,33 dd (10,0, 0,5) 6,26 dd (10,5, 1,5) 6,22 dd (10,5, 2,0) 6,17 dd (10,5, 2,5) 6     7 4,60 d (11,5) 4,66 d (11,0) 4,53 d (10,0) 4,36 d (10,0) 4,85 d (11,5) 4,73 d (11,0) 4,74 d (10,0) 4,57 d (10,0) 1′     2′/6′ 7,94 dd (8,0, 1,0) 7,92 dd (8,0, 1,0) 7,94 dd (8,0, 1,0) 7,91 dd (8,5, 1,0) 3′/5′ 7,41 m 7,39 m 7,48 m 7,54 m 4′ 7,55 m 7,54 m 7,61 m 7,67 m 7′     1″     2″/6″ 8,02 dd (8,0, 1,0) 8,03 dd (8,0, 1,0) 8,11 dd (8,0, 1,0) 8,08 dd (8,5, 1,0) 3″/5″ 7,41 m 7,39 m 7,48 m 7,54 m 4″ 7,55 m 7,54 m 7,61 m 7,67 m 7″     1-OH    6,33 s 2-OH    6,03 d (6,5) 4.2.1.4. Hợp chất UGC6: ()-Zeylenol Hợp chất UGC6 được tách ra dưới dạng bột màu trắng, mp 145–146 oC, 20[ ]D -117,1 (c 0,05, CHCl3). Phổ UV (MeOH) cho các đỉnh hấp thụ cực đại tại λ 232 và 273 nm gợi ý sự hiện diện của nhóm benzoyl. Phổ ESI-MS cho píc cơ sở tại m/z 419,4 [M-H+2H2O] -. Công thức phân tử của hợp chất UGC6 được đề nghị là C21H20O7 (M = 384) dựa vào các dữ kiện phổ ESI-MS, 13C-NMR và DEPT. Sự hiện diện của 2 nhóm benzoyl còn được thể hiện qua tín hiệu đặc trưng của 10 proton thơm tại δH 7,44 (4H, m, H-3′/5′/3″/5″), 7,58 (2H, m, H-4′/4), 8,02 68 (2H, dd, J = 8,0, 1,0 Hz, H2-2″/6″) và 8,05 (2H, dd, J = 8,0, 1,0 Hz, H2-2′/6′) trên phổ 1H-NMR cùng với các tương tác HMBC giữa H2-2′/6′ (δH 8,05) và C-7′ (δC 168,3), giữa H2-2″/6″ (δH 8,02) và C-7″ (δC 167,9). Phổ 1H-NMR của hợp chất này cũng chỉ ra các tín hiệu của 2 proton olefin [δH 5,84 (dd, J = 10,5, 2,5 Hz, H- 4) và 5,98 (ddd, J = 10,5, 4,5, 2,0 Hz, H-5)], 2 proton của nhóm oxymethylene [δH 4,63 (d, J = 11,5 Hz, H-7a) và 4,71 (d, J = 11,5 Hz, H-7b)] và 3 proton của 3 nhóm oxymethine [δH 4,26 (d, J = 6,5 Hz, H-2), 4,38 (d, J = 4,5 Hz, H-6) và 5,72 (br.d, J = 6,5 Hz, H-3]. Phổ 13C-NMR, DEPT và HSQC chỉ ra 21 tín hiệu carbon gồm 14 carbon của 2 nhóm benzoyl, 2 carbon olefin (δC 127,7, 131,4), 1 carbon của nhóm oxymethylene (δC 68,1), 3 carbon của 3 nhóm oxymethine (δC 70,0, 71,1, 75,5) và 1 carbon bậc bốn gắn với oxy (δC 76,5). Các tương tác COSY giữa H-2 (δH 4,26)/H-3 (δH 5,72)/H-4 (δH 5,84)/H-5 (δH 5,98)/H-6 (δH 4,38) cùng với tương tác HMBC giữa H-7 (δH 4,63, 4,71) và C- 1 (δC 76,5)/C-2 (δC 71,1)/C-6 (δC 70,0), giữa H-5 (δH 5,98)/H-6 (δH 4,38) và C-1 (δC 76,5) cho phép thiết lập khung methylcyclohexane. Vị trí của nối đôi tại C- 4/C-5 được khẳng định qua tương tác H-2 (δH 4,26)/C-4 (δC 127,7), H-6 (δH 4,38)/C-4 (δC 127,7), H-3 (δH 5,72)/C-5 (δC 131,4) trong khi vị trí liên kết của các nhóm benzoyl tại C-3 (δC 75,5) và C-7 (δC 68,1) được xác nhận dựa vào các tương tác H-3 (δH 5,72)/C-7″ (δC 167,9) và H-7 (δH 4,63, 4,71)/C-7′ (δC 168,3) trên phổ HMBC (Hình 4.23). Hình 4.22. Cấu trúc hóa học của hợp chất UGC6 Hình 4.23. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất UGC6 69 Hình 4.24. Cấu dạng chính của hợp chất UGC6 Phân tích hằng số tương tác giữa H-2 (δH 4,26) và H-3 (δH 5,72) (J2,3 = 6,5 Hz) cho phép khẳng định cấu hình 2,3-trans của hợp chất UGC6 [73]. Ngoài ra, việc so sánh giá trị hằng số tương tác vicinal giữa H-5 (δH 5,98) và H-6 (δH 4,38) (J5,6 = 4,5 Hz) với các giá trị tương ứng đã được Abraham [8] thiết lập cho đồng phân F của conduritol (3,4,5,6-tetrahydroxycyclohex-1-ene) (J5,6a = 1,9 Hz, J5,6e = 5,3 Hz) chứng tỏ H-6 chủ yếu định hướng pseudo-equatorial [68]. Hơn nữa, giá trị J2,3 (6,5 Hz) nằm giữa các giá trị giới hạn (J2e,3e′ = 2,4 Hz, J2a,3a′ = 8,4 Hz [8]) đề nghị hợp chất UGC6 tồn tại ở cả hai cấu dạng nửa ghế trong đó cấu dạng A chiếm ưu thế (Hình 4.24) [8, 70]. Bảng 4.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất UGC6 và hợp chất tham khảo C δC #, $ δC $, b δC a, b DEPT δH a, c (J, Hz) HMBC (H→C) 1 76,0 75,9