Luận án Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính kháng viêm, kháng ung thư các hợp chất lai coxib – combretastatin

hoạt tính cảm ứng apoptosis qua trắc lưu tế bào Thí nghiệm được thực hiện theo Kit Anexin V/cell dead apoptosis của Invitrogen như sau: 1x106 tế bào được ủ với mẫu thử hoặc dung môi pha mẫu 24h được thu vào ống falcon. Sau khi ly tâm loại bỏ môi trường, tế bào được rửa lại bằng PBS. Cặn tế bào được hòa lại trong 100 µl dung dịch đệm liên kết và bổ sung thêm 5µl Anexin V và 1µl PI (100 µg/ml). Tiếp tục ủ tế bào trong 15 phút ở 370C sau đó thêm vào các ống tế bào 400µl dung dịch đệm liên kết. Tổng số 10.000 tế bào thuộc mỗi mẫu được phân tích bằng hệ thống flowcytometry Novocyte để xác định tỉ lệ tế bào biểu hiện apoptosis. 44 2.4.3.3. Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng apoptosis bằng caspase 3 Cụ thể như sau: Tế bào đã được cảm ứng với mẫu thử trong 24h, sẽ được ly giải với 50 μl dung dịch đệm ly giải trong 10 phút. Sau đó dịch tế bào được ly tâm và xác định hàm lượng protein trong dịch tế bào. Protein được pha loãng với nồng độ 50 μg trong 50μl dung dịch đệm ly giải, cho 50 μl dung dịch đệm phản ứng và 5 μl cơ chất DEVD-pNA (nồng độ 200 μM) và ủ 370C trong 1 h. Tiến hành đọc kết quả trên máy microplate reader ở bước sóng 405 nm 2.5. Nghiên cứu docking phân tử Docking là một phương pháp tính toán dựa trên các phần mềm dùng để nghiên cứu khả năng gắn kết của một hay nhiều phân tử (hay cấu tử, ligand) lên điểm tác động của cấu trúc không gian 3 chiều các đại phân tử như protein (receptor, enzym, ) ADNCác nghiên cứu docking phân tử được sử dụng để xác định sự tương tác giữa hai phân tử và tìm định hướng tốt nhất của phối tử có thể hình thành phức hợp với năng lượng tối thiểu. Các phân tử nhỏ được gọi là phối tử thường phù hợp trong hốc của protein được dự đoán bởi các thuật toán tìm kiếm. Các hốc protein này trở nên hoạt động khi tiếp xúc với bất kỳ các hợp chất bên ngoài và do đó được gọi là điểm tác động. Các kết quả được phân tích bằng một chức năng tính điểm thống kê chuyển năng lượng tương tác sang các giá trị số gọi là điểm docking và cũng là năng lượng tương tác được tính toán. Hình dạng 3D của các phối tử bị liên kết có thể được hình dung bằng cách sử dụng các công cụ khác nhau như Pymol, Rasmol có thể giúp suy luận sự phù hợp nhất của phối tử. Dự đoán chế độ tương tác protein-ligand có thể giả thiết vị trí hoạt động của phân tử protein và giúp chú thích protein tốt hơn [107]. Hơn nữa, việc gắn kết phân tử có ứng dụng chính trong việc phát minh và thiết kế dược phẩm. Docking phân tử. Phân tử docking có thể được chia thành hai phần riêng biệt. 45 a) Thuật toán tìm kiếm - Các thuật toán này xác định tất cả các cấu hình tối ưu có thể cho một phức hợp nhất định (protein-protein, protein-ligand) trong môi trường, tức là vị trí và hướng của cả hai phân tử tương ứng với nhau. Chúng cũng có thể tính toán năng lượng của phức hợp và của từng tương tác riêng lẻ [107-108]. Các loại thuật toán khác nhau có thể được sử dụng để phân tích docking được đưa ra dưới đây: - Động lực học phân tử, - Phương pháp Monte Carlo. - Thuật toán di truyền - Các phương pháp phân mảnh. - Các phương pháp bổ sung điểm. - Phương pháp hình học khoảng cách. - Tìm kiếm có hệ thống. b) Điểm số chức năng - Đây là phương pháp toán học được sử dụng để dự đoán cường độ của tương tác không cộng hóa trị được gọi là liên kết ràng buộc giữa hai phân tử sau khi chúng đã được docking. Điểm số chức năng cũng đã được phát triển để dự đoán cường độ của các kiểu tương tác liên phân tử khác, ví dụ giữa hai protein hoặc giữa protein và DNA hoặc protein và thuốc. Các cấu hình này được đánh giá bằng cách sử dụng điểm số chức năng để phân biệt các chế độ liên kết thử nghiệm từ tất cả các chế độ khác được khám phá thông qua thuật toán tìm kiếm. d) Các bước chính trong docking phân tử: Bước 1 – chuẩn bị protein: Trong bước này, cấu trúc 3D của thụ thể sẽ được tải xuống từ ngân hàng dữ liệu protein PDB (Protein data bank). Sau đó cấu trúc thu được nên được xử lý trước. Điều này phải chấp nhận loại bỏ phân tử nước, ion, ổn định điện tích,theo các thông số có sẵn. Bước 2 – dự đoán điểm tác động: Sau khi chuẩn bị protein, cần dự đoán điểm tác động của protein. Các thụ thể (receptor) có thể có nhiều điểm tác động nhưng cần lựa chọn 46 một trong những điểm ưa thích nhất. Hầu hết các phân tử nước và các dị tố cần được loại bỏ nếu có [105-106]. Bước 3 – chuẩn bị phối tử: Phối tử có thể được lấy từ nhiều cơ sở dữ liệu như ZINC, Pub chem hoặc có thể phác họa bằng công cụ Chem sketch. Bước 4 – Docking: Ligand được gắn với protein và các tương tác được phân tích. Điểm số chức năng là điểm dựa trên cơ sở phức ligand tốt nhất được chọn. 47 CHƢƠNG 3: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN Những ưu điểm của việc sử dụng một phân tử lai so với việc đồng thời kết hợp nhiều loại thuốc riêng lẻ có thể cải thiện các hạn chế về phản ứng phụ và sự kháng thuốc [107]. Tuy có hoạt tính nổi trội, nhưng combretastatin vẫn còn nhiều những tác dụng không mong muốn. Đây là lý do nhóm nghiên cứu đặt mục tiêu kết hợp combretastatin, một hợp chất kháng ung thư, và celecoxib, một chất kháng viêm theo cơ chế COX2, là các chất bắt nguồn cho các hợp chất lai mới với hy vọng tìm ra những chất mang các đặc điểm hoạt tính sinh học lý thú như kháng ung thư và kháng viêm của chất gốc đồng thời ít gây tác dụng phụ. 3.1. Thiết kế cấu trúc và hoạt tính sinh học của phân tử lai 3.1.1. Thiết kế cấu trúc phân tử lai Hình 3.1. Cấu trúc của celecoxib, Combretastatin A4 và hợp chất lai coxib - combretastatin 48 Nghiên cứu đã áp dụng chiến lược lai ghép để lai hóa các nhóm dược lý quan trọng của hai hợp chất gốc celecoxib và CA4 trong một phân tử duy nhất. Vòng pyrazole được thay thế bởi 1,2-diphenyl của khung celecoxib như một cấu trúc tương tự như cis-1,2-diphenylethylene trong CA4. Sự thay thế liên kết đôi bằng vòng 5 đã được khẳng định về mặt hoạt tính gây độc tế bào và ức chế tubulin [108]. Các hợp chất bị khóa dạng cấu hình cis này thể hiện một số lợi ích như ngăn chặn quá trình đồng phân hóa từ dạng cis thành trans, giúp tăng độ đặc hiệu của hoạt chất này với các mục tiêu tế bào và cải thiện tiềm năng điều trị của nó. Sự hiện diện của các nhóm trimethoxybenzene của CA4 cũng là cần thiết cho hoạt tính độc tế bào [76]. Chúng tôi đặc biệt quan tâm đến việc duy trì nhóm sulfonamid hoặc các đặc điểm liên quan đến celecoxib vì điều này dường như dẫn đến việc bảo tồn được tính chọn lọc COX-2 của chất lai thu được [109]. Tác dụng ức chế COX2 nếu có sẽ góp phần vào tổng thể hoạt động chống khối u của các phân tử lai mới. 3.1.2. Thiết kế hoạt tính sinh học phân tử lai Tác dụng gây độc tế bào của những hợp chất này chống lại ba dòng thế bào ung thư ở người HT-29, Hep-G2, MCF-7 cũng như ức chế sản sinh NO bằng cách kích hoạt lipopolysaccharide (LPS) tế bào đại thực bào RAW 264.7. Vai trò của NO trong khối u rất phức tạp, nó có vai trò kích thích hoặc ức chế quá trình tế bào tùy thuộc vào điều kiện, vì vậy sự ức chế sản sinh NO không liên quan trực tiếp đến độc tính tế bào. Nhưng NO thể hiện một loạt các đặc tính dược lý có ích tương tự như prostaglandin trên hệ tim mạch bao gồm sự giãn mạch, sự ức chế kết tập tiểu cầu và sự điều hòa các mảng bám của bạch cầu vào thành mạch [110]. Hơn nữa, việc sử dụng celecoxib trong phòng chống ung thư vú và các khối u ác tính đã bị hạn chế bởi các tác dụng phụ của nó, đặc biệt là nguy cơ biến chứng của tim mạch liên quan chủ yếu đến khả năng giảm sản sinh prostacyclin PGI2 [111]. Nhờ đó có thể thấy sự duy trì sản sinh NO cùng với những đặc tính ức chế COX2 của celecoxib có thể giúp tránh nguy cơ biến chứng tim mạch, do vậy một chiến lược nhằm thiết kế một loạt phân tử đa đích bằng cách kết hợp ức chế chọn lọc COX2 với các hoạt động phụ thuộc nitric oxide (NO) đã được triển khai [112-114]. 49 Trong quá trình viêm nhiễm, các tế bào miễn dịch được kích hoạt như đại thực bào tiết ra một số chất trung gian gây viêm như cytokine tiền viêm, oxit nitric (NO) và prostaglandin E2 (PGE2). Hơn nữa, có một mối liên quan rõ ràng giữa mức độ prostaglandin trong các khối u vú ở người với sự phát triển của di căn và khả năng sống sót [115]. Prostaglandin E2 tồn tại với nồng độ cao trong các khối u vú và ở những thể trạng ung thư di căn, khi thiếu thụ thể estrogen và progesterone [116-117]. Do đó, khả năng ức chế sản xuất PGE2 có thể được coi là một chiến lược tốt trong việc thiết kế các chất chống ung thư. Tuy nhiên, các tế bào ung thư vú MCF7 sản sinh mức PGE2 rất thấp theo báo cáo khác [109]. Do đó, hiệu lực hoạt tính của các hợp chất lai đã được thử nghiệm đáp ứng viêm gây ra bởi LPS thay bằng ức chế PGE2 trên MCF7 [118]. Do vậy, các dòng tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF-7 và khả năng ức chế sản sinh NO được lựa chọn là các công cụ bước đầu sàng lọc hoạt tính kháng viêm của lớp chất nghiên cứu. Và để xác định được cơ chế kháng viêm và kháng ung thư của các chất lai, nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2, các phương pháp phân tích chu kỳ tế bào, các phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, nghiên cứu hoạt tính gây apotosis bằng chỉ thị caspase ‑ 3, nghiên cứu cảm ứng apoptosis bằng phương pháp trắc lưu tế bào nhuộm FITC-anexin V và PI. Sau cùng, các chất đã được chọn lọc và nghiên cứu cơ chế sinh học sẽ được thử nghiệm tương tác với các đích tác dụng tubulin và COX2 bằng phương pháp docking phân tử để khẳng định độ chính xác hoạt tính sinh học của mô hình in vitro. 3.2. Tổng hợp các hợp chất lai coxib - combretastatin Phương pháp một bình phản ứng đã được áp dụng để điều chế các dẫn chất etyl 1,4,5-triaryl-1H pyrazol-3-cacboxylat từ ethyl oxalyl chlorid, 1,2-diarylethanon và ethyl oxalyl chloride arylhydrazin hydrochlorid (Hình 2.1, Hình 2.2, Hình 2.7, Hình 2.8) [119]. Phản ứng ngưng tụ Claisen giữa hai thành phần 1,2-diarylethanon và ethyl oxalyl chlorid với tác nhân kiềm sử dụng là tert-BuOLi, thu được sản phẩm trung gian muối lithium của ethyl 2,4-dioxo-3,4-diarylbutanoat, phản ứng được tiếp tục với arylhydrazin hydrochlorid thông qua phản ứng Knorr được xúc tác bởi axit clohydric 50 để tạo ra triarylpyrazol - 3 - cacboxylat (hợp chất lai 79 đến 98) và (hợp chất lai 103 đến 122). Một chu trình điều chế dạng dẫn chất của celecoxib cũng được áp dụng (Hình 2.4, Hình 2.5) 3,4,5-trimethoxyphenyl - 1,1,1-trifluoro-2,4-butanedion (65, 102) thu được từ sự ngưng tụ Claisen giữa các dẫn xuất acetophenon và etyl trifluoroacetat sau đó tiếp tục phản ứng với muối halogenua 4-sulfamidophenyl hydrazin để tạo thành 3,4,5-trimethoxyphenyl, một chất có cấu trúc tương tự celecoxib. Theo các quy trình phản ứng được mô tả trong Hình 2.1, Hình 2.2, 20 hợp chất lai coxib - combretastatin đã được tổng hợp thành công, phản ứng được thực hiện 3 lần độc lập để đưa ra hiệu suất trung bình. Sản phẩm thu được đạt hiệu suất từ 64 – 83% với các sản phẩm lai coxib – combretastatin dạng este (Bảng 3.1), 02 hợp chất chứa nhóm CF3 với hiệu suất lần lượt là 95%. 78% (bảng 3.2), 20 hợp chất dạng axit của chất lai coxib - combretastatin với hiệu suất từ 54 – 74 % ( bảng 3.3); Qua đó có thể thấy hiệu xuất các sản phẩm lai thu được qua 2 giai đoạn phản ứng là cao. Các chất được tiến hành xác định cấu trúc bằng các phương pháp tinh chế và phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 1D, 2D. Bảng 3.1. Kết quả tổng hợp các chất este từ chất 79 đến chất 98 TT Chất 76(khối lƣợng) 76 (ii) (mg) Chất 78 Sản phẩm (ký hiệu) Lƣợng (mg) Hiệu suất (%) 1 196 mg 136 174 mg 79 330 83% 2 196 mg 136 176 mg 80 331 76% 3 196 mg 136 169 mg 81 270 69% 4 196 mg 136 189 mg 82 268 73% 5 196 mg 136 223 mg 83 330 75% 6 256 mg 136 174 mg 84 380 83% 7 256 mg 136 176 mg 85 386 78% 51 8 256 mg 136 169 mg 86 316 70% 9 256 mg 136 189 mg 87 283 60% 10 256 mg 136 223 mg 88 395 78% 11 275 mg 136 174 mg 89 367 77% 12 275 mg 136 176 mg 90 355 69% 13 275 mg 136 169 mg 91 306 65% 14 275 mg 136 189 mg 92 329 67% 15 275 mg 136 223 mg 93 393 75% 16 215 mg 136 223 mg 94 338 73% 17 228 mg 136 223 mg 95 204 66% 18 214 mg 136 223 mg 96 312 67% 19 230 mg 136 223 mg 97 360 75% 20 256 mg 136 223 mg 98 324 64% Hình 2.3. Công thức cấu tạo các hợp chất 79-98 52 Ethyl 1-(4-methoxyphenyl)-4,5-diphenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate (79; 83% ) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.26 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.77 (s, 3H, OMe); 4.33 (q, J ＝7.1, 2H, CH2); 6.81 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 6.98 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.18－7.25 (m, 10H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.5; 55.5; 60.8; 113.9 (2C); 124.5; 127.0 (2C); 127.1; 127.6 (2C); 128.3 (2C); 128.4; 129.1; 130.4 (2C); 130.7 (2C); 131.9; 132.6; 141.2; 142.2; 159.2; 162.5. HRMS, m/z = 399.1710 ([M+H]+, C25H23N2O3 + ; calc. 399.1703). Ethyl 4,5-diphenyl-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (80; 76%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.26 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2); 7.01 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.20－7.27 (m, 8H, Ph); 7.45 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.58 (d, J ＝8.3, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.1; 125.4; 125.5 (2C); 126.1; 127.0 (2C); 127.3 (2C); 127.7 (2C); 128.6 (3C); 128.9; 130.3 (2C); 130.6 (2C); 131.4; 142.1; 142.3; 142.5; 162.2. HRMS, m/z = 437.1476 ([M+H]+, C25H20F3N2O2 + ; calc. 437.1471). Ethyl 1-(4-cyanophenyl)-4,5-diphenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate (81; 69%) 53 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.26 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2); 7.01 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.18－7.30 (m, 8H, Ph); 7.45 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.61 (d, J ＝8.3, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.2; 111.6; 117.9; 125.6 (2C); 125.7; 127.4; 127.7 (2C); 128.4;128.7 (2C); 129.1; 130.2 (2C); 130.5 (2C); 131.1; 132.8 (2C); 142.3; 142.7; 142.9; 162.1. HRMS, m/z = 394.1551 ([M+H]+, C25H20N3O2 +; calc. 394.1550). Ethyl 1-(4-nitrophenyl)-4,5-diphenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate (82; 65%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.26 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2), 7.01 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.19－7.33 (m, 8H, Ph); 7.50 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 8.18 (d, J ＝8.3, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.5; 61.2; 121.3 (2C); 125.5 (2C); 125.8; 127.4; 127.7 (2C); 128.4; 128.8 (2C); 129.2; 130.2 (2C); 130.5 (2C); 131.0; 142.5; 143.1; 144.2; 146.6; 162.0. HRMS, m/z = 414.1449 ([M+H]+, C24H20N3O +; calc. 414.1448). Ethyl 4,5-diphenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (83; 85%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2); 4.96 (s, 2H, NH2); 7.00 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.18－7.29 (m, 8H, Ph); 7.46 (d, J＝8.3, 54 2H, Ph); 7.85 (d, J＝8.3, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.2; 125.6 (2C); 127.3 (3C); 127.7 (3C); 128.4; 128.7 (2C); 129.0; 130.2 (2C); 130.5 (2C); 131.2; 141.1; 142.4; 142.6; 142.7; 162.3. HRMS, m/z = 448.1327 ([M+H]+, C24H22N3O4S + ; calc. 448.1326). Ethyl 1,4,5-tris(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (84; 83%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.27 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.73 (s, 3H, OMe); 3.79 (s, 6H, 2OMe); 4.31 (q, J＝7.2, 2H, CH2); 6.68 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 6.81- 6.83 (m, 4H, Ph); 6.87 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 7.13 (d, J＝8.8, 2H, Ph); 7.20 (d, J＝8.8, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.2; 55.1 (2C); 55.47; 60.78; 113.2; 113.7 (2C); 113.9 (2C); 121.3; 123.9 (2C); 124.3; 127.0 (2C); 131.6 (2C); 131.8 (2C); 132.8; 141.1; 142.0; 158.6; 159.1; 159.4; 162.6. HRMS, m/z = 459.1914 ([M+H] + , C27H27N2O5 + ; calc. 459.1914). Ethyl 4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1H-pyrazole-3- carboxylate (85; 78%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.27 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.76 (s, 3H, OMe); 3.79 (s, 3H, OMe); 4.32 (q, J＝7.2, 2H, CH2); 6.73 (d, J＝8, 2H, Ph); 6.82 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 55 6.90 (d, J＝8.9, 2H, Ph); 7.13 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 7.40 (d, J＝8.2, 2H, Ph); 7.57 (d, J ＝8.2, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.2; 55.1 (2C); 61.0;113.2 (2C); 114.1 (2C);120.8; 123.7 (2C); 124.8 (2C); 125.5 (2C); 126.0 (4C); 131.6; 131.7; 142.1; 142.3; 142.4; 158.8; 159.8; 162.4. HRMS, m/z = 497.1683 ([M+H] + , C27H24F3N2O4 + ; calc. 497.1683) Ethyl 1-(4-cyanophenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (86; 70%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1,29 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.77 (s, 3H, OMe); 3.79 (s, 3H, OMe); 4.33 (q, J＝7.2, 2H, CH2); 6.75 (d, J＝8.9, 2H, Ph); 6.81 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 6.90 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 7.11 (d, J＝8.4, 2H, Ph); 7.40 (d, J＝8.00, 2H, Ph); 7.60 (d, J＝9.0, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.2; 55.1; 55.2; 61.1; 111.4; 113.3 (2C); 114.2; 118.2 (2C); 120.6; 123.4 (2C); 125.1; 125.6 (2C); 131.5 (2C); 131.7 (2C); 132.8; 142.1; 142.8; 142.9; 158.8; 160.0; 162.2. HRMS, m/z = 454.1765 ([M+H] + , C27H24N3O4 + ; calc. 454.1761). Ethyl 4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-nitrophenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (87; 60%) 56 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.29 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.77 (s, 3H, OMe); 3.79 (s, 3H, OMe); 4.33 (q, J＝7.2, 2H, CH2); 6.76 (d, J＝8.9, 2H, Ph); 6,81 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 6.92 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 7.12 (d, J＝8.4, 2H, Ph); 7.49 (d, J＝8.00, 2H, Ph); 8.17 (d, J＝9.0, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.2; 55.1; 55.2; 61.1; 113.4 (2C); 114.3 (2C); 120.5; 123.3 (2C); 124.3 (2C); 125.3 (2C); 131.1 (2C); 131.6 (2C); 142.3; 143.0; 144.4; 146.5; 158.8; 160.0; 162.2. HRMS, m/z = 474.1659 ([M+H] + , C26H24N3O6 + ; calc. 474.1660). Ethyl 4,5-bis(4-methoxyphenyl)-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (88; 78%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.25 (t, J＝7.0, 3H, Me); 3.76 (s, 3H, OMe); 3.79 (s, 3H, OMe); 4.30 (q, J＝7.2, 2H, CH2); 6.73 (d, J＝8.9, 2H, Ph); 6.80 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 6.89 (d, J＝8.7, 2H, Ph); 7.11 (d, J＝8.4, 2H, Ph); 7.42 (d, J＝8.00, 2H, Ph); 7.82 (d, J＝9.0, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 55.1; 55.2; 61.1; 113.2 (2C); 114.3 (2C); 120.5; 123.5 (2C); 125.6 (2C); 127.2(2C); 131.6 (2C); 131.7 (2C); 141.1; 142.2; 142.6; 142.7; 158.8; 159.9; 162.3. HRMS, m/z = 508.1540 ([M+H] + , C26H26N3O6S + ; calc. 508.1537). 57 Ethyl 5-(4-bromophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-4-phenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate (89; 77%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 3.80 (s, 3H, OMe); 4.32 (q, J ＝7.1, 2H, CH2); 6.82- 6.85 (m, 4H, Ph); 7.19－7.21 (m, 4H, Ph); 7.25－7.30 (m, 5H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 55.6; 60.8; 113.9 (2C); 124.5; 127.0 (2C); 127.1; 127.6 (2C); 128.3 (2C); 128.4; 129.1; 130.4 (2C); 130.7 (2C); 131.9; 132.6; 141.2; 142.2; 159.2; 162.5. HRMS, m/z = 477.0813 ([M+H]+, C25H22BrN2O3 + ; calc. 477.0808). Ethyl 5-(4-bromophenyl)-4-phenyl-1-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1H-pyrazole-3- carboxylate (90; 69%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.26 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.32 (q, J＝7.1, 2H, CH2); 6.85 (m, 2H, Ph); 7.10－7.20 (m, 2H, Ph); 7.29－7.30 (m, 3H, Ph); 7.35－7.36 (m, 2H, Ph); 7.45 (d, J＝7.4, 2H, Ph); 7.3 (d, J＝7.6, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.0; 61.1; 125.5 (2C); 125.6; 126.2 (3C); 127.5 (3C); 127.9 (3C); 130.5 (2C); 131.0 (2C); 131.7 (2C); 132.0; 141.9; 142.0; 142.6; 162.0. HRMS, m/z = 515.0576 ([M+H] + , C25H19BrF3N2O2 + ; calc. 515.0577). 58 Ethyl 5-(4-bromophenyl)-1-(4-cyanophenyl)-4-phenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate (91; 65%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.23 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2); 6.87 (d, J＝6.86, 2H, Ph); 7.17－7.18 (m, 2H, Ph); 7.26-7.29 (m, 3H, Ph); 7.38 (d, J＝ 7.3, 2H, Ph) ); 7.45 (d, J＝7.4, 2H, Ph); 7.65 (d, J＝7.6, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.2; 111.9; 117.8; 123.7; 125.7 (2C); 125.9; 127.3; 127.6; 127.9 (2C); 130.4 (2C); 130.8; 131.6 (2C); 132.1 (2C); 133.0 (2C); 141.1; 142.4; 143.0; 161.9. HRMS, m/z = 472.0661 ([M+H] + , C25H19BrN3O2 + ; calc. 472.0655). Ethyl 5-(4-bromophenyl)-1-(4-nitrophenyl)-4-phenyl-1H-pyrazole-3-carboxylate (92; 67%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.34 (q, J＝7.1, 2H, CH2), 6.88 (d, J＝8.2, 2H, Ph); 7.17－7.19 (m, 2H, Ph); 7.29－7.30 (m, 3H, Ph); 7.39 (d, J ＝8.2, 2H, Ph); 7.5 (d, J＝8.6, 2H, Ph); 8.2 (d, J＝9.3, 2H, Ph); 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.2; 61.2; 111.8; 117.8; 123.7; 125.6 (2C); 125.9; 127.5; 127.6; 127.9 (2C); 130.9 (2C); 130.8; 131.1 (2C); 132.4 (2C); 133.0 (2C); 141.2; 142.2; 143.1; 161.9. HRMS, m/z = 492.0555 ([M+H] + , C24H19BrN3O2 + ; calc. 492.0553). 59 Ethyl 5-(4-bromophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (93; 75%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.33 (q, J＝7.1, 2H, CH2); 4.91 (s, 2H, NH2); 6.87 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.17－7.29 (m, 2H, Ph); 7.28－7.30 (m, 3H, Ph); 7.36 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.47 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7,91 (d, J＝9.1, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.4; 123.7; 125.6 (2C); 125.8; 127.3 ; 127.5(2C); 127.6 (2C); 127.9; 130.4 (2C); 130.9; 131.7 (2C); 132.1 (2C); 141.4; 142.4; 142.6; 142.8; 162.0. HRMS, m/z = 526.0429 ([M+H] + , C24H21BrN3O4S + ; calc. 526.0431). Ethyl 5-(4-hydroxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (94; 73%) 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.14 (t, J＝7.0, 3H, Me); 4.22 (q, J＝7.0, 2H, CH2); 6.64 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 6.93 (d, J＝8.4, 2H, Ph); 7.20 (m, 2H, Ph); 7,27 (m, 3H, Ph); 7,45 (s, 2H, NH2); 7.49 (d, J＝8.5, 2H, Ph); 7.83 (d, J＝8.6, 2H, Ph); 9.72 (s, 1H, OH); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 14.3; 60.8; 111.9; 115.9 (2C); 124.5 (2C); 126.0 (2C); 127.4 ; 128.0 (2C); 130.8 (2C); 132.0 (2C); 132.2 (2C); 141.9; 142.0; 143.1; 143.8; 158.3; 162.2. HRMS, m/z = 464.1276 ([M+H] + , C24H22N3O5S + ; calc. 464.1275). 60 Ethyl 5-(2,4-dihydroxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3- carboxylate (95; 66%) 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.22 (t, J＝7.0, 3H, Me); 4.08 (q, J＝7.0, 2H, CH2); 6.93 (d, J＝8.3, 2H); 6,98-7.11 (dd, J＝8.4, 2H, Ph); 7.23 – 7.25 (m, 4H, Ph); 7.40 – 7.41 (m, 6H, Ph, NH2); 7.95 (d, J＝7.0, 2H, Ph). 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 14.5; 62.5; 102.6; 116.3; 116.4; 125.5; 127.8 (2C); 128.2 (3C); 128.3 (2C); 128.8; 129.9; 130.2 (3C); 132.1; 150.3; 157.3; 161.4; 164.1; 175.7; HRMS, m/z = 480.1200 ([M+H] + , C24H22N3O6S + ; calc. 480.1224). Ethyl 5-(4-fluorophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (96; 67%) 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.13 (t, J＝7.0, 3H, Me); 4.18 (q, J＝7.0, 2H, CH2); 6.93 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.11- 7.17 (dd, J＝8.4, 3H, Ph); 7.48 – 7.51 (m, 2H, Ph); 7.52 – 7.53 (m, 2H, Ph); 7.84 (d, J＝7.0, 2H, Ph).13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 14.1; 61.4; 102.6; 116.3; 116.4; 125.5; 127.8 (2C); 128.2 (3C); 128.3 (2C); 128.8; 129.9; 130.2 (3C); 132.1; 141.3; 142.3; 162.0; HRMS, m/z = 466.1230 ([M+H] + , C24H21FN3O4S + ; calc. 466.1231). 61 Ethyl 5-(4-chlorophenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3-carboxylate (97; 75%) 1 H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 1.25 (t, J＝7.2, 3H, Me); 4.27 (q, J＝7.1, 2H, CH2); 5.2 (s, 2H, NH2); 6.9 (d, J＝7.0, 2H, Ph); 7.19－7.20 (m, 2H, Ph); 7.26－7.29 (m, 3H, Ph); 7.41 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.43 (d, J＝8.3, 2H, Ph); 7.85 (d, J＝9.1, 2H, Ph). 13C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 14.1; 61.2; 126.6; 125.6 (2C); 125.8; 127.3 ; 127.5(2C); 127.6 (2C); 127.9; 130.4 (2C); 130.9; 131.7 (2C); 132.1 (2C); 141.4; 142.4; 141.6; 142.7; 162.0. HRMS, m/z = 482.0935 ([M+H] + , C24H21ClN3O4S + ; calc. 482.0936). Ethyl 5-(2,4-dimethoxyphenyl)-4-phenyl-1-(4-sulfamoylphenyl)-1H-pyrazole-3- carboxylate (98; 64%) 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1.25 (m, 3H, Me); 3.84 (s, 3H, OMe); 3.88 (s, 3H, OMe); 4.27 (s, 2H, CH2); 6.44 (d, J＝3.1, 1H, Ph); 6,50 (dd, J＝8.3, 1H, Ph); 7.20 – 7.22 (m, 4H, Ph); 7.25 – 7.28 (m, 5H, Ph); 7.78 (d, J = 8.0, 1H, Ph). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 14.4;55.6 (C); 61.2 (2C); 102.6; 116.3; 116.4; 125.5; 127.8 (2C); 128.2 (3C); 128.3 (2C); 128.8; 129.9; 130.2 (3C); 132.1; 150.3; 157.3; 161.4; 164.1; 175.7; HRMS, m/z = 508.1570 ([M+H] + , C26H26N3O6S + ; calc. 508.1537). 62 Bảng 3.2. Kết quả tổng hợp các chất 65, 102 TT 100 Chất 101 Chất 78e (mg) Sản phẩm (ký hiệu) Lƣợng thu (mg) Hiệu suất (%) 1 134 mg 170 208 65 360 95 2 210 mg 170 208 102 355 78 4-(3-(trifluoromethyl)-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-1H-pyrazol-1-yl)benzenesulfonamide (102; 78%) 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.69 (s, 6H, 2OMe, Ph); 3.87 (s, 3H, OMe, Ph); 4.99 (s, 2H, NH2); 6.44 (s, 2H, Ph); 6,76 (s, 1H, Ph); 7.50 (d, J = 8.0, 2H, Ph); 7.92 (d, J = 8.0, 2H, Ph). 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ 56.2 (2C); 61.3; 102.4 (3C); 123.8; 125.5 (3C); 127.4 (3C); 141.5; 145.0; 153.5 (3C). HRMS, m/z = 458.0962 ([M+H] + , C19H18F3N3O5S + ; calc. 458.0992). Bảng 3.3. Kết quả tổng hợp các dẫn chất axit từ chất 103 đến chất 122 TT Chất M chất đầu (mg) NaH (mg) Sản phẩm (ký hiệu) Lƣợng thu (mg) Hiệu suất (%) 1 79 165 24 103 114 74% 2 80 165 22 104 105 68% 63 3 81 135 20 105 82 65% 4 82 134 18 106 81 65% 5 83 165 22 107 111 67% 6 84 190 24 108 132 74% 7 85 193 22 109 127 70% 8 86 158 20