Luận án Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua

đều được thiết kế gồm nhóm chứng và nhóm bất hoạt gen A20 để so sánh kết quả giữa 2 nhóm này. Để bất hoạt gen A20 trong tế bào tua, phân tử siRNA đặc hiệu gen đích A20 (siRNA được thiết kế, cung cấp bởi Applied Biosystems, Mỹ) được đưa vào TBT với nồng độ 2x105 tế bào/ml, sử dụng chất dẫn Lipofectamine RNAiMAX. Sau đó, tiến hành kiểm tra và so sánh mức độ biểu hiện của protein A20 trong tế bào nhóm bất hoạt và tế bào nhóm chứng bằng Western blot, kết quả thu được như Hình 3.1. A B Hình 3.1. Kết quả biểu hiện protein A20 sau khi đưa A20-siRNA vào tế bào tua 51 A. Hình ảnh Western blot của tế bào tua ở nhóm xử lý với chứng siRNA và nhóm xử lý với A20-siRNA. B. So sánh mức độ biểu hiện tương đối của protein A20 trong tế bào tua ở nhóm xử lý với chứng RNA và nhóm xử lý với A20-siRNA. Kết quả trên hình ảnh Western blot cho thấy sau khi đưa phân tử A20-siRNA vào TBT, biểu hiện protein A20 đã bị bất hoạt gần như hoàn toàn so với nhóm chứng siRNA. Hình 3.1.B cho thấy biểu hiện tương đối của protein A20 trong TBT bị bất hoạt gen A20 bằng A20-siRNA chỉ còn khoảng 24% so với đối chứng không bất hoạt. Các băng đối chứng (GAPDH) đều bắt màu đậm rõ nét, có kích thước tương đồng nhau ở các giếng. Kết quả này đã khẳng định rằng sau khi đưa A20- siRNA vào TBT, biểu hiện protein A20 đã bị bất hoạt. Do đó, tế bào tua bất hoạt A20 được sử dụng trong những thí nghiệm tiếp theo. 3.1.2. Vai trò của protein A20 điều hòa sự trưởng thành tế bào tua Các tế bào tua trưởng thành tăng cường biểu hiện các marker bề mặt như MHC II, CD86 và CD40. Các marker này chỉ xuất hiện ở các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp như TBT, tế bào B nhớ và đại thực bào. Trong thí nghiệm này, các TBT được phân lập và nuôi cấy từ tế bào tủy xương ở chuột BALB/c được nuôi cấy cùng với các hóc-môn sinh trưởng FLT3 biệt hóa trở thành 3 tập hợp con TBT là CD8+DC, CD11b+DC và pDC. Để xác định vai trò gen A20 đối với biểu hiện của các marker bề mặt trên từng tập hợp tế bào này, mỗi tập hợp được thiết kế thành 2 nhóm tế bào, gồm nhóm đối chứng và nhóm bị bất hoạt gen A20 bằng cách đưa A20-siRNA vào TBT. Sau đó khi được xử lý với TgPRF (5 µg/ml), các nhóm tế bào này được thu thập và nhuộm màu để phát hiện các marker bề mặt bao gồm MHC II, CD86 và CD40 và nhuộm với isotype IgG cho nhóm chứng. Kết quả được mô tả trong Bảng 3.1 đến 3.3 và Hình 3.2 đến 3.4 tương ứng với các nhóm tế bào tua CD8+DC, CD11b+DC và pDC. 52 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế bào CD8+DC khi phơi nhiễm profilin Chỉ thị phân tử Nhóm Nhóm Mật độ huỳnh quang trung bình Độ lệch chuẩn p Chứng âm Chứng siRNA 80,7 63,1 0,457 A20-siRNA 116,7 42,1 MHC II Nhóm chứng Chứng siRNA 3600,6 55,1 0,6 A20-siRNA 3276,4 1320,2 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 9526 4895,9 0,805 A20-siRNA 10205,4 5152,6 CD86 Nhóm chứng Chứng siRNA 1154,5 434,4 0,845 A20-siRNA 1202,2 328,2 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 2364,8 1424,5 0,929 A20-siRNA 2430,1 1232,5 CD40 Nhóm chứng Chứng siRNA 1026,2 284,7 0,642 A20-siRNA 935,5 397,1 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 2588,3 1536,6 0,645 A20-siRNA 2219,6 1209 53 Hình 3.2. Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế bào CD8+DC khi phơi nhiễm profilin Giá trị trung bình ± sai số chuẩn (n =5 căp chuột thí nghiệm, lặp lại thí nghiệm 3 lần) của mật độ huỳnh quang của nhóm chứng và nhóm tế bào CD8+DC biểu hiện MHC II, CD86 và CD40 xử lý bằng TgPRF (5 µg/ml), các nhóm này xử lý với chứng siRNA hoặc bằng A20-siRNA (phân tích kết quả bằng hàm ANOVA). con: nhóm chứng không xử lý với TgPRF. Kết quả cho thấy, ở nhóm tế bào CD8+DC không bất hoạt gen A20 (nhóm chứng), khi xử lý với TgPRF nồng độ 5 µg/ml, kết quả cho thấy tỷ lệ phần trăm tế bào biểu hiện MHC II, CD86 và CD40 đều tăng (cột trắng). Cụ thể là sau khi phơi nhiễm, biểu hiện MHC II tăng 2,6 lần với mật độ huỳnh quang trung bình từ 3600,6 (±55,1) lên 9526 (±4895,9); còn biểu hiện CD86 tăng hơn 2 lần với mật độ huỳnh quang trung bình từ 1154,5 (±434,4) lên 2364,8 (±1424,5); còn biểu hiện của CD40 tăng 2,5 lần với mật độ huỳnh quang trung bình từ 1026,2 (±284,7) lên 2588,3 (±1536,6). Tương tự như vậy, ở nhóm bất hoạt gen A20 bằng A20-siRNA, sau khi xử lý với TgPRF, tỉ lệ tế bào biểu hiện của MHC II, CD86 và CD40 cũng tăng (cột đen). Biểu hiện MHC II tăng hơn 3 lần với mật độ huỳnh quang trung bình từ 3276,4 (±1320,2) lên 10205,4 (±5152,6); còn biểu hiện CD86 tăng khoảng 2 lần với mật độ huỳnh quang trung bình từ 1202,2 (±328,2) lên 2430,1 (±1232,5); còn biểu hiện của 54 CD40 tăng 2,3 lần với mật độ huỳnh quang trung bình từ 935,5 (±397,1) lên thành 2219,6 (±1209). Tuy nhiên, so sánh giữa nhóm chứng và nhóm bất hoạt gen A20 thì đều không có sự sai khác ở tất cả các marker bề mặt này (cột trắng so với cột đen). Như vậy, gen A20 không ảnh hưởng đến sự trưởng thành của nhóm tế bào CD8+DC. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế bào CD11b+DC khi phơi nhiễm profilin Chỉ thị phân tử Nhóm Nhóm Mật độ huỳnh quang trung bình Độ lệch chuẩn p Chứng âm Chứng siRNA 137,6 39,6 0,057 A20-siRNA 242,5 94,2 MHC II Nhóm chứng Chứng siRNA 3551,6 1271,4 0,804 A20-siRNA 3260,7 1968,2 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 4771,6 2476,7 0,602 A20-siRNA 4026,2 1819,2 CD86 Nhóm chứng Chứng siRNA 3295,9 128,7 0,471 A20-siRNA 3477,3 456,2 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 3523,1 705 0,881 A20-siRNA 3456,1 922,3 CD40 Nhóm chứng Chứng siRNA 2210,5 628,5 0,012 A20-siRNA 3943,3 1236,8 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 3170,2 2411,2 0,703 A20-siRNA 3789,6 2548,4 55 Hình 3.3. Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của CD11b+DC khi phơi nhiễm profilin Giá trị trung bình ± sai số chuẩn (n =5 căp chuột thí nghiệm, lặp lại thí nghiệm 3 lần) của mật độ huỳnh quang của nhóm chứng hoặc nhóm CD11bDC biểu hiện MHC II, CD86 và CD40 xử lý bằng TgPRF (5 µg/ml), các nhóm này xử lý với chứng siRNA hoặc bằng A20-siRNA (phân tích kết quả bằng hàm ANOVA). con: nhóm chứng không xử lý với TgPRF. Như được thể hiện ở hình trên, khi xử lý nhóm tế bào CD11b+DC với TgPRF, biểu hiện của MHC II, CD86 và CD40 tăng không đáng kể (nhóm chứng siRNA- cột trắng). Cụ thể là sau khi phơi nhiễm, biểu hiện MHC II tăng với mật độ huỳnh quang trung bình từ 3551,6 (±1271,4) lên 4771,6 (±2476,7); tương tự biểu hiện CD86 tăng với mật độ huỳnh quang trung bình từ 3295,9 (±128,7) lên 3523,1 (±705); còn biểu hiện của CD40 tăng với mật độ huỳnh quang trung bình từ 2210,5 (±628,5) lên thành 3170,2 (±2411,2). Đối với nhóm tế bào CD11b+DC thiếu hụt gen A20, profilin gần như không làm thay đổi biểu hiện của các marker bề mặt này (cột đen). Cụ thể là sau khi phơi nhiễm, biểu hiện MHC II tăng 46% với mật độ huỳnh quang trung bình từ 3260,7 (±1968,2) lên 4026,20 (±1819,2); ngược lại, biểu hiện CD86 giảm nhẹ với mật độ huỳnh quang trung bình từ 3477,3 (±456,2) xuống thành 3456,1 (±922,3); còn biểu hiện của CD40 giảm với mật độ huỳnh quang trung bình từ 3943,3 (±1236,8) xuống còn 3789,6 (±2548,4). 56 Đồng thời, khi so với nhóm chứng CD11b+DC không bất hoạt gen A20 thì biểu hiện của MHC II, CD86 và CD40 trên nhóm CD11b+DC bất hoạt gen A20 không có sự khác biệt. Điều này có nghĩa là gen A20 không ảnh hưởng đến sự trưởng thành của nhóm tế bào CD11b+DC. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế bào pDC khi phơi nhiễm profilin Chỉ thị phân tử Nhóm Nhóm Mật độ huỳnh quang trung bình Độ lệch chuẩn p Chứng âm Chứng siRNA 230,7 131,1 0,868 A20-siRNA 258 217,8 MHC II Nhóm chứng Chứng siRNA 1304,2 473,6 0,159 A20-siRNA 1855,8 717,6 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 3528 366,4 0,033 A20-siRNA 6142,8 1372 CD86 Nhóm chứng Chứng siRNA 425,2 161,2 0,553 A20-siRNA 519,2 331,9 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 1016 693,9 0,926 A20-siRNA 983,9 575,2 CD40 Nhóm chứng Chứng siRNA 1061,7 284,2 0,365 A20-siRNA 1300 135,8 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 1689 218,8 0,001 A20-siRNA 2648 573,3 57 Hình 3.4. Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế bào pDC khi phơi nhiễm profilin A. Giá trị trung bình ± sai số chuẩn (n =5 căp chuột thí nghiệm, lặp lại thí nghiệm 3 lần) của mật độ huỳnh quang của nhóm chứng hoặc nhóm pDC biểu hiện MHC II, CD86 và CD40 xử lý bằng TgPRF (5 µg/ml), các nhóm này xử lý với chứng siRNA hoặc bằng A20-siRNA. *(p<0,05) và **(p<0,01) thể hiện khác biệt có ý nghĩa thống kê với nhóm chứng (phân tích kết quả bằng hàm ANOVA). con: nhóm chứng không xử lý với TgPRF. B. Biểu đồ FACS mô tả mật độ huỳnh quang của MHC II và CD40 thu được từ các pDC nhóm chứng và nhóm xử lý bằng TgPRF (5µg/ml), các nhóm này hoặc xử lý với chứng siRNA hoặc A20-siRNA. Control siRNA: Chứng siRNA. Kết quả trên cho thấy xử lý tế bào pDC nhóm chứng siRNA với TgPRF làm tăng tỷ lệ phần trăm của tế bào biểu hiện MHC II, CD86 và CD40 (cột trắng). Cụ thể là sau khi phơi nhiễm, biểu hiện MHC II tăng 2,5 lần với mật độ huỳnh quang trung bình từ 1304,2 (±473,6) lên thành 3528 (±366,4); tương tự như vậy biểu hiện 58 CD86 tăng 2,4 lần với mật độ huỳnh quang trung bình từ 425,2 (±161,2) lên tới 1016 (±693,9); còn biểu hiện của CD40 tăng khoảng 50% với mật độ huỳnh quang trung bình từ 1061,67 (±284,2) lên thành 1689 (±218,8). Khi thiếu hụt protein A20, biểu hiện của MHC II và CD40 trên các tế bào pDC trưởng thành được xử lý với TgPRF tăng mạnh hơn nữa, nhưng biểu hiện của CD86 thì chỉ nhẹ tăng (cột đen). Biểu hiện MHC II tăng hơn 3 lần với mật độ huỳnh quang trung bình từ 1855,8 (±717,6) lên 6142,8 (±1372); còn biểu hiện CD40 tăng gấp đôi với mật độ huỳnh quang trung bình từ 1300 (±135,8) lên 2648 (±573,3); còn biểu hiện của CD86 chỉ tăng nhẹ với mật độ huỳnh quang trung bình từ 519,20 (±331,9) lên 983,9 (±575,2). Đáng chú ý là, so với nhóm chứng không bất hoạt A20 thì nhóm bất hoạt A20 có biểu hiện MHC II và CD40 tăng cường đáng kể (lần lượt p<0,05 và p<0,01); còn CD86 không tăng. Biểu đồ FACS mô tả mật độ huỳnh quang của MHC II và CD40 trên các TBT dòng lympho pDC cho thấy, so sánh nhóm bất hoạt gen A20 (A20- siRNA) với nhóm chứng siRNA, có thể thấy rõ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong tỷ lệ phần trăm của tế bào pDC biểu hiện MHC II và CD40 sau khi xử lý bởi profilin, biểu hiện của MHC II, CD86 và CD40 trên cả CD8+DC và CD11b+DC đều không thay đổi, từ đó chỉ ra rằng gen A20 có vai trò chống lại biểu hiện của marker bề mặt MHC II và CD40 trên tế bào pDC. Các kết quả ở Bảng 3.1 đến 3.3 và Hình 3.2 đến 3.4 đã chỉ ra rằng gen A20 ức chế một phần sự trưởng thành của nhóm tế bào tua pDC (thông qua ức chế biểu hiện của marker bề mặt MHC II và CD40), nhưng không ức chế sự trưởng thành của nhóm tế bào CD8+DC và CD11b+DC (không ảnh hưởng đến các marker MHC II, CD40 và CD86 ở 2 nhóm tế bào này). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trước đây của nhóm tác giả Pepper và cộng sự chỉ ra rằng pDC là một tập hợp TBT nổi bật liên quan đến giai đoạn đầu của nhiễm trùng T. gondii, khả năng trình diện các kháng nguyên ký sinh trùng và sản xuất các cytokine đóng vai trò rất quan trọng để kiểm soát nhiễm trùng [82]. 59 3.1.3. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua 3.1.3.1. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua khi biệt hóa tế bào tua bằng FLT3 Trong thí nghiệm tiếp theo, các sản phẩm cytokine được tiết ra bởi tế bào CD8+DC, CD11b+DC và pDC sau khi các nhóm TBT được tiếp xúc với TgPRF đã được kiểm tra, so sánh nhóm bất hoạt A20 bằng A20-siRNA với nhóm chứng để phân tích vai trò gen A20 đối với sự tiết cytokine của các nhóm TBT. Kết quả được minh họa trong Bảng 3.4 đến 3.7 và Hình 3.5 đến 3.8 tương ứng với các nhóm tế bào CD8+DC, CD11b+DC và pDC. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào CD8+DC sau khi phơi nhiễm profilin Cytokine Nhóm Nhóm Nồng độ (pg/ml) Độ lệch chuẩn p IL-6 Nhóm chứng Chứng siRNA 0 0 A20-siRNA 0 0 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 135,5 113 0,855 A20-siRNA 118,7 97,6 IL-12p40 Nhóm chứng Chứng siRNA 1147,7 288,3 A20-siRNA 732,8 577,3 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 39697 13653 0,826 A20-siRNA 37559 12654 TNF-α Nhóm chứng Chứng siRNA 0 0 A20-siRNA 0 0 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 63,3 59,2 0,873 A20-siRNA 56,9 27,4 IFN-γ Nhóm chứng Chứng siRNA 5,8 2,2 A20-siRNA 0,8 1,1 60 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 22,3 30,6 0,797 A20-siRNA 16,9 15,4 Hình 3.5. Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào CD8+DC khi phơi nhiễm profilin Giá trị trung bình ± sai số chuẩn SEM (n = 5 căp chuột thí nghiệm, lặp lại thí nghiệm 3 lần) của mức độ sản xuất IL-6, IL-10, IL-12p40, TNF-α và IFN-γ từ nhóm chứng hoặc tế bào CD8+DC được xử lý với TgPRF (5µg/ml), các nhóm tế bào này xử lý với chứng siRNA hoặc bằng A20-siRNA (phân tích kết quả bằng hàm ANOVA). con: nhóm chứng không xử lý với TgPRF. Như được minh họa trong Bảng 3.4 và Hình 3.5, sau khi xử lý các nhóm TBT với TgPRF, nhóm tế bào CD8+DC tăng cường sản xuất các cytokine IL-6, IL- 10, IL-12p40, TNF-α và IFN-γ (cột trắng). Nồng độ IL-6 tăng từ 0 lên 135,5 (±113) (pg/ml); nồng độ IL-12p40 tăng từ 1147,7 (±288,3) lên 39697 (±13653) (pg/ml); nồng độ TNF-α tăng từ 0 lên 63,3 (±59,2) (pg/ml); và nồng độ IFN-γ tăng từ 5,8 (±2,2) lên 22,3 (±30,6) (pg/ml). Đồng thời, ở nhóm bất hoạt gen A20, sự tiết các cytokine này cũng tăng so với nhóm không xử lý với profilin (cột đen). Nồng độ IL-6 tăng từ 0 lên 118,8 (±97,6) (pg/ml); nồng độ IL-12p40 tăng từ 732,8 (±577,3) lên 37559 (±12654) 61 (pg/ml); nồng độ TNF-α tăng từ 0 lên 56,9 (±27,4) (pg/ml); và nồng độ IFN-γ tăng từ 0,8 (±1,1) lên 16,9 (±15,4) (pg/ml). Tuy nhiên, so với nhóm chứng không bất hoạt gen A20, thì các TBT được xử lý với A20-siRNA không khác biệt đáng kể về khả năng giải phóng các cytokine trên. Như vậy, sự biểu hiện hay bất hoạt của gen A20 không ảnh hưởng đến sự sản xuất các cytokine của nhóm tế bào CD8+DC. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào CD11b+DC sau khi phơi nhiễm profilin Cytokine Nhóm Nhóm Nồng độ (pg/ml) Độ lệch chuẩn p IL-6 Nhóm chứng Chứng siRNA 0 0 A20-siRNA 86,9 0 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 161,5 106,6 0,0002 A20-siRNA 2687,6 328,5 TNF-α Nhóm chứng Chứng siRNA 3,2 0,5 A20-siRNA 2,7 3,8 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 26,9 7,7 0,02 A20-siRNA 537,4 151,7 Hình 3.6. Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào CD11b+DC khi phơi nhiễm profilin 62 Giá trị trung bình ± sai số chuẩn SEM (n = 5 căp chuột thí nghiệm, lặp lại thí nghiệm 3 lần) của mức độ sản xuất IL-6 và TNF-α từ nhóm chứng hoặc các tế bào CD11b+DC xử lý với TgPRF (5µg/ml), các nhóm này xử lý với chứng siRNA hoặc bằng A20-siRNA. *(p<0,05) và *** (p<0,001) thể hiện khác biệt có ý nghĩa thống kê với nhóm chứng là các tế bào xử lý bằng siRNA (phân tích kết quả bằng hàm ANOVA). con: nhóm chứng không xử lý với TgPRF. Như được minh họa trong Bảng 3.5 và Hình 3.6, sau khi xử lý với TgPRF, kết quả thu được cho thấy nhóm tế bào CD11b+DC tăng cường tiết các cytokine IL-6 và TNF-α (cột trắng). Nồng độ IL-6 tăng từ 0 lên 161,5 (±106,6) (pg/ml); nồng độ TNF- α tăng từ 3,2 (±0,5) lên 26,9 (±7,7) (pg/ml). Ở nhóm tế bào CD11b+DC thiếu hụt gen A20, quan sát thấy sự tiết IL-6 và TNF-α càng tăng mạnh hơn đáng kể (cột đen). Nồng độ IL-6 tăng từ 86,9 lên 2687,6 (±328,5) (pg/ml); nồng độ TNF-α tăng từ 2,7 (±3,8) lên 537,4 (±151,7) (pg/ml). Ngoài ra, các cytokine khác bao gồm IL-10, IL-12p40 và IFN-γ không được tiết ra bởi tế bào CD11b+DC khi phơi nhiễm với TgPRF. Nồng độ IL-10, IL-12p40 và IFN- γ đo được khi phơi nhiễm profilin hay không phơi nhiễm đều là 0 pg/ml. Đặc biệt, khi so với nhóm chứng không xử lý với A20-siRNA, thì nhóm bất hoạt gen A20 thể hiện sự khác biệt rõ ràng, cụ thể là nồng độ IL-6 do các tế bào nhóm chứng tiết ra là 161,5 (±106,6) so với 2687,6 (±328,5) (pg/ml) ở nhóm bất hoạt A20 (p<0,001). Tương tự, nồng độ TNF-α tiết ra từ nhóm chứng và nhóm bất hoạt A20 lần lượt là 26,9 (±7,7) và 537,4 (±151,7) (pg/ml) (p<0,05). Từ đó có thể kết luận là gen A20 có vai trò ức chế sự sản xuất cytokine IL-6 và TNF-α của nhóm tế bào CD11b+DC. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào pDC sau khi phơi nhiễm profilin Cytokine Nhóm Nhóm Nồng độ (pg/ml) Độ lệch chuẩn p IL-6 Nhóm chứng Chứng siRNA 3,6 1,5 A20-siRNA 9,6 6,7 Nhóm xử lý Chứng siRNA 29,8 16,2 0,0001 63 với profilin A20-siRNA 170,4 149,2 IL-10 Nhóm chứng Chứng siRNA 11,4 4,7 A20-siRNA 12,9 18,7 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 11,9 2,9 0,261 A20-siRNA 19,2 11,4 IL-12p40 Nhóm chứng Chứng siRNA 37,4 34,3 A20-siRNA 48,4 12,8 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 1854,4 1356,1 0,001 A20-siRNA 4127,3 415,4 TNF-α Nhóm chứng Chứng siRNA 7,2 2,7 A20-siRNA 19,9 9,7 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 137,3 134,4 0,035 A20-siRNA 637 418,8 IFN-γ Nhóm chứng Chứng siRNA 2,9 1,5 A20-siRNA 4,9 5,1 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 6,2 6,4 0,048 A20-siRNA 80,4 103,9 64 Hình 3.7. Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào pDC khi phơi nhiễm profilin Giá trị trung bình ± sai số chuẩn SEM (n = 5 căp chuột thí nghiệm, lặp lại thí nghiệm 3 lần) của mức độ sản xuất IL-6, IL-10, IL-12p40, TNF-α và IFN-γ từ nhóm chứng hoặc các tế bào pDC, xử lý với TgPRF (5µg/ml), các nhóm này xử lý với chứng siRNA hoặc bằng A20-siRNA. *(p<0,05) và ** (p<0,01) và *** (p<0,001) thể hiện khác biệt có ý nghĩa thống kê với nhóm chứng là các tế bào xử lý bằng A20-siRNA (phân tích kết quả bằng hàm ANOVA).con nhóm chứng không xử lý với TgPRF. Kết quả Hình 3.7 cho thấy, các tế bào pDC sau khi xử lý với TgPRF, khả năng sản xuất ra các cytokine IL-12p40 và TNF-α được tăng cường, còn sự tiết IL- 6, IL-10 và IFN-γ thì không thay đổi hoặc giảm nhẹ (cột trắng). Nồng độ IL-12p40 tăng mạnh khoảng 50 lần từ 37,4 (±34,3) lên 1854,4 (±1356,1) (pg/ml); nồng độ TNF-α tăng 19 lần từ 7,2 (±2,7) lên 137,3 (±134,4) (pg/ml); nồng độ IL-6 tăng 8 lần từ 3,6 (±1,5) lên 29,8 (±16,2) (pg/ml); và nồng độ IFN-γ tăng hơn 2 lần từ 2,9 (±1,5) lên 6,2 (±6,4) (pg/ml), còn nồng độ IL-10 tăng nhẹ từ 11,4 (±4,7) đến 11,9 (±2,9) (pg/ml). Tuy nhiên, khi xử lý với A20-siRNA, kết quả cho thấy việc xử lý các tế bào bất hoạt gen A20 này với TgPRF dẫn đến sự tăng cường giải phóng các cytokine IL- 65 6, IL-10, IL-12p40, TNF-α và IFN-γ (cột đen) so với không xử lý với TgPRF. Nồng độ IL-6 tăng lên 13 lần từ 9,6 (±6,7) lên 170,4 (±149,2) (pg/ml); nồng độ IL-10 tăng thêm 50% từ 12,9 (±18,7) lên 19,2 (±11,4) (pg/ml); nồng độ IL-12p40 tăng mạnh lên 86 lần từ 48,4 (±12,8) lên 4127,3 (±415,4) (pg/ml); TNF-α tăng thêm 32 lần từ 19,9 (±9,7) lên 637 (±418,8) (pg/ml); và nồng độ IFN-γ tăng gần 20 lần từ 4,9 (±5,1) lên 80,4 (±103,9) (pg/ml). Đáng chú ý là sau khi xử lý với profilin, so với nhóm chứng không bất hoạt thì nhóm tế bào pDC bất hoạt gen A20 thể hiện sự khác biệt đáng kể trong sự tiết các cytokine IL-6 (p<0,001), IL-12p40 (p<0,0001), TNF-α (p<0,05) và IFN-γ (p<0,05). Bằng chứng này đã chỉ ra rằng protein A20 ức chế phản ứng viêm ở pDC. Như vậy, khi đánh giá vai trò gen A20 đối với sự tiết cytokine của 3 nhóm TBT phơi nhiễm bởi profilin, kết quả cho thấy nhóm tế bào pDC tăng cường sản xuất ra các cytokine IL-6, IL-10, IL-12p40, TNF-α và IFN-γ (Hình 3.7), nhưng nhóm CD11b+DC thì chỉ tăng tiết IL-6, và TNF-α (Hình 3.6), và bất hoạt A20 không ảnh hưởng đáng kể đến sự tiết cytokine ở nhóm tế bào CD8+DC (Hình 3.5). Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu gần đây đã công bố rằng cytokine IL-12p40 và IFN-γ không được sản xuất bởi CD11b+DC trong khi nhiễm T. gondii. Nhóm của Cohen và cộng sự đã chỉ ra quần thể tế bào tua CD8+DC mới là nguồn sản xuất chính của IL-12p40 in vivo [91]. 3.1.3.2. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua khi biệt hóa tế bào tua bằng GM-CSF Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết các cytokine TNF-α, IL-6 và IL-10 của tế bào CD11b+DC được nghiên cứu thông qua so sánh sự tiết cytokine của nhóm bất hoạt gen A20 bằng A20-siRNA và nhóm chứng xử lý với chứng siRNA, khi cùng được phơi nhiễm với LPS và thu được kết quả như Bảng 3.7 và Hình 3.8. Bảng 3.7. Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào CD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS Cytokine Nhóm Nhóm Nồng độ (ng/ml) Độ lệch chuẩn p 66 TNF-α Nhóm chứng Chứng siRNA 0,01 0,01 A20-siRNA 0,1 0,1 Nhóm xử lý với LPS Chứng siRNA 90,8 0,6 A20-siRNA 12,8 0,2 0,015 IL-6 Nhóm chứng Chứng siRNA 0,1 0,1 A20-siRNA 1,2 0,2 Nhóm xử lý với LPS Chứng siRNA 17,7 0,2 A20-siRNA 18,4 0,1 0,076 IL-10 Nhóm chứng Chứng siRNA 0,03 0,02 A20-siRNA 0,05 0,02 Nhóm xử lý với LPS Chứng siRNA 0,2 0,1 A20-siRNA 1,3 0,2 0,027 Hình 3.8. Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào CD11b+DC khi phơi nhiễm với LPS Giá trị trung bình ± sai số chuẩn (n = 5 căp chuột thí nghiệm, lặp lại thí nghiệm 3 lần) của sự tiết của TNF-α, IL-6 và IL-10 từ các TBT nhóm chứng và nhóm bất hoạt A20 khi xử lý với LPS và không xử lý LPS. *(p<0,05) thể hiện khác biệt có ý nghĩa thống kê với nhóm các tế bào xử lý với siRNA (phân tích kết quả bằng hàm ANOVA).con: nhóm chứng không xử lý với TgPRF. Kết quả trên cho thấy, sau khi được kích thích bởi LPS, sự tiết cytokine TNF-α và IL-6 của các TBT tăng cường đáng kể (cột trắng). Nồng độ TNF-α tăng 67 từ 13,9 (±8,1) lên 9080,9 (±634,5) (pg/ml); nồng độ IL-6 tăng từ 142,8 (±141,8) lên 17685 (±148,5) (pg/ml); nồng độ IL-10 tăng từ 33,4 (±22,6) lên 214,8 (±139,9) (pg/ml). Ở nhóm bất hoạt A20, sự tiết cytokine TNF-α, IL-6 và IL-10 của các TBT cũng đều được tăng cường. Nhưng đáng chú ý là, sau khi bất hoạt A20 trong TBT dẫn đến việc sản xuất IL-10 và TNF-α được tăng cường so với nhóm chứng không bất hoạt, cụ thể là nồng độ IL-10 tăng từ 214,8 (±139,9) ở nhóm không bất hoạt lên 1330,9 (±228,5) (pg/ml) ở nhóm bất hoạt A20 (p<0,05); tương tự như vậy, nồng độ TNF-α của nhóm không bất hoạt và có bất hoạt A20 lần lượt là 9080 (±634,5) và 12780 (±169,4) (pg/ml) (p<0,05), tuy nhiên bất hoạt A20 không ảnh hưởng tới sự tiết IL-6. Như vậy, protein A20 ức chế sự tiết cytokine IL-10 và TNF-α của tế bào CD11b+DC khi phơi nhiễm với LPS, nhưng không ảnh hưởng tới sự tiết IL-6. Kết quả này cũng nhất quán với những nghiên cứu trước đây, IL-6 được báo cáo là không liên quan đến vai trò điều hoà của gen A20 ở TBT và mức độ của nó trong huyết thanh chuột thậm chí còn thấp hơn ở những con chuột thiếu A20 ở TBT so với chuột nhóm chứng [40]. 3.1.4. Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế bào tua 3.1.4.1. Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế bào tua khi biệt hóa tế bào tua bằng FLT3 Để phân tích vai trò của gen A20 đối với sự di chuyển của các nhóm TBT khi xử lý với profilin, nhóm tế bào được xử lý với chứng siRNA (nhóm chứng) hoặc bất hoạt gen A20 bằng A20-siRNA, sau đó các dòng TBT của 2 nhóm này đều được xử lý với TgPRF và so sánh sự khác biệt. Kết quả về vai trò của protein A20 đối với sự di cư của 3 nhóm TBT được thể hiện ở Bảng 3.8 và Hình 3.9. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của các nhóm tế bào tua sau khi phơi nhiễm profilin Tế bào tua Nhóm Nhóm % tế bào di cư Độ lệch chuẩn p CD8+DC Nhóm Chứng siRNA 5,3 2,2 68 chứng A20-siRNA 7,8 1,8 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 16,7 5,6 0,851 A20-siRNA 17,2 2,1 CD11b+DC Nhóm chứng Chứng siRNA 7,1 2,6 A20-siRNA 7,6 3,6 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 14,9 7,8 0,849 A20-siRNA 13,5 10,7 pDC Nhóm chứng Chứng siRNA 2,9 1,1 A20-siRNA 3,3 1,1 Nhóm xử lý với profilin Chứng siRNA 9,8 0,6 0,003 A20-siRNA 16,7 6,9 Hình 3.9. Ảnh hưởng của protein A20 lên sự di chuyển của các nhóm tế bào tua sau khi biệt hoá bởi FLT3 và phơi nhiễm profilin Giá trị trung bình ± sai số chuẩn SEM (n = 5 căp chuột thí nghiệm, lặp lại thí nghiệm 3 lần) của tỉ lệ phần trăm các tế bào di cư ở các nhóm chứng và các nhóm CD8+DC (A), CD11b+DC (B) và pDC (C) được xử lý với TgPRF (5µg/ml), tế bào được xử lý với chứng siRNA hoặc bằng A20-siRNA. *(p<0,05) thể hiện khác biệt có ý nghĩa thống kê với nhóm chứng (phân tích kết quả bằng hàm ANOVA). con: nhóm chứng không xử lý với TgPRF. 69 Trong thí nghiệm này, khi các nhóm TBT xử lý với T