Luận án Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn liên kết với thực vật (Plant Associated Bacteria) ở lúa, khoai trồng trên đất phèn vùng đồng bằng sông Cửu Long - Lý Ngọc Thanh Xuân

LỜI CẢM ƠN. i

TÓM TẮT. ii

ABSTRACT. iv

LỜI CAM ĐOAN . vi

MỤC LỤC . vii

DANH SÁCH BẢNG. x

DANH SÁCH HÌNH .xiii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT . xiv

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU. 1

1.1 Đặt vấn đề . 1

1.2 Mục tiêu . 3

1.3 Nội dung nghiên cứu. 3

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. 4

1.5 Những đóng góp mới của luận án . 4

1.6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án . 5

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 6

2.1 Nguyên lý và ứng dụng của vi khuẩn liên kết với thực vật trong nông

nghiệp . 6

2.1.1 Khái niệm. 6

2.1.2 Nguyên lý và ứng dụng của vi khuẩn liên kết thực vật . 6

2.1.3 Những tiến bộ trong nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật liên kết với thực

vật . 12

2.2 Đặc điểm thổ nhưỡng các vùng sinh thái đất. 16

2.2.1 Phân loại đất phèn. 16

2.2.2 Đặc điểm thổ nhưỡng và các trở ngại trên đất phèn ĐBSCL . 20

2.2.3 Đặc tính hóa học của đất phèn ĐBSCL. 27

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 36

3.1 Vật liệu. 36

3.1.1 Thời gian và địa điểm . 36

3.1.2 Vật liệu. 36

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu . 37viii

3.1.4 Môi trường sử dụng . 37

3.1.5 Đặc tính đất thí nghiệm. 38

3.2 Phương pháp . 38

3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát và thu thập mẫu đất, thực vật trên đất phèn ở các

vùng sinh thái tại đồng bằng sông Cửu Long. 40

3.2.2 Nội dung 2: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn liên kết với thực vật có khả

năng cố định đạm, hòa tan lân. 41

3.2.3 Nội dung 3: Tuyển chọn vi khuẩn trước khi tiến hành nhận diện. 46

3.2.4 Nội dung 4: Nhận diện, định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn. 47

3.2.5 Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn

trên cây lúa trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. 49

3.2.6 Nội dung 6: Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn

trên khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài

đồng. . 54

3.3 Xử lý số liệu. 58

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 59

4.1 Phân lập vi khuẩn trên lúa và khoai lang. 59

4.1.1 Phân lập vi khuẩn vùng rễ cây lúa và nội sinh cây lúa. 59

4.1.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn vùng rễ và nội sinh cây lúa . 59

4.1.3 Phân lập vi khuẩn vùng rễ và nội sinh trên khoai lang. 60

4.1.4 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn vùng rễ và nội sinh trên khoai lang. 60

4.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn tiềm năng có khả năng cố định đạm và hòa

tan lân . 61

4.2.1 Khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ và hòa tan lân của chủng vi khuẩn đã

phân lập trên vùng rễ lúa và nội sinh trong cây lúa. 61

4.2.2 Khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ và hòa tan lân của chủng vi khuẩn đã

phân lập trên vùng rễ lúa và nội sinh trong khoai lang . 67

4.3 Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của một số chủng vi

khuẩn trên lúa, khoai lang có khả năng tổng hợp NH4+, hòa tan lân cao 71

4.3.1 Đối với vi khuẩn đất vùng rễ lúa. 71

4.3.2 Đối với vi khuẩn nội sinh cây lúa. 74

4.3.3 Đối với vi khuẩn vùng rễ và nội sinh trên khoai lang. 76

4.3.4 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn cho áp dụng trong điều kiện đồng ruộng

. 80ix

4.4 Hiệu quả của các chủng vi khuẩn triển vọng B. vietnamiensis X1, X2, X3

cố định đạm và hòa tan lân khó tan đến sinh trưởng và năng suất lúa trồng

trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới . 85

4.4.1 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn kết hợp với mức bón

đạm lên thành phần năng suất và năng suất lúa . 85

4.4.2 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn kết hợp với mức bón

lân lên thành phần năng suất và năng suất lúa . 87

4.5 Hiệu quả của các chủng vi khuẩn triển vọng E. cloacae X4, B.

acidipaludis X5, Bacillus sp. X6 cố định đạm và hòa tan lân khó tan đến

sinh trưởng và năng suất khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện

nhà lưới. 89

4.6 Hiệu quả của các chủng vi khuẩn triển vọng B. vietnamiensis X1, X2, X3

cố định đạm và hòa tan lân khó tan đến sinh trưởng và năng suất lúa trồng

trên đất phèn trong điều kiện ngoài đồng. 91

4.6.1 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn B. vietnamiensis X1, X2, X3 kết hợp

các mức đạm lên năng suất lúa trồng trên đất phèn ở đồng bằng sông Cửu

Long vụ hè thu 2015. 91

4.6.2 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn B. vietnamiensis X1, X2, X3 kết hợp

các mức lân lên năng suất lúa trồng trên đất phèn ở đồng bằng sông Cửu

Long vụ hè thu 2015. 93

4.6.3 Đánh giá hiệu quả của chủng vi khuẩn B. vietnamiensis X1, X3 lên năng

suất lúa trồng trên đất phèn ở đồng bằng sông Cửu Long vụ thu đông

2015 . 95

4.7 Hiệu quả của các chủng vi khuẩn triển vọng E. cloacae X4, B.

acidipaludis X5, Bacillus sp. X6 cố định đạm và hòa tan lân khó tan đến

sinh trưởng và năng suất khoai trồng trên đất phèn ở điều kiện ngoài đồng

. 97

4.7.1 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn E. cloacae X4, B. acidipaludis X5,

Bacillus sp. X6 kết hợp với các liều lượng đạm đến năng suất khoai lang

tím nhật vào vụ xuân hè 2016 trên đất phèn ở ĐBSCL . 97

4.7.2 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn E. cloacae X4, B. acidipaludis X5,

Bacillus sp. X6 kết hợp với các liều lượng lân đến năng suất khoai lang

tím nhật vào vụ hè thu 2016 trên đất phèn ở ĐBSCL . 99

4.7.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn triển vọng đến năng suất khoai lang tím nhật vụ

hè thu 2016 . 101

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT . 103

5.1 Kết luận. 103

5.2 Đề xuất. 104

pdf120 trang | Chia sẻ: trungkhoi17 | Lượt xem: 348 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn liên kết với thực vật (Plant Associated Bacteria) ở lúa, khoai trồng trên đất phèn vùng đồng bằng sông Cửu Long - Lý Ngọc Thanh Xuân, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
iệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên cây khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số nghiệm thức chủng vi khuẩn lên năng suất khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới. Chọn các nghiệm thức để thử nghiệm ngoài đồng. Phương pháp phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn liên kết với thực vật (plant associated bacteria) ở lúa, khoai lang trồng trên đất phèn được thể hiện trong Hình 3.2. 40 Hình 3.2: Sơ đồ tiếp cận phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát và thu thập mẫu đất, thực vật trên đất phèn ở các vùng sinh thái tại đồng bằng sông Cửu Long 3.2.1.1 Thu thập mẫu cây và mẫu đất Sáu mươi mẫu đất vùng rễ lúa và mẫu cây lúa được thu tại 4 vùng đất phèn trồng lúa của đồng bằng sông Cửu Long (Đồng Tháp Mười, Tứ giác Long Xuyên, Trủng sông Hậu và Bán đảo Cà Mau). Bốn mươi lăm mẫu đất vùng rễ khoai lang và mẫu cây khoai lang được thu tại 3 vùng đất phèn trồng khoai lang của đồng bằng sông Cửu Long (Đồng Tháp Mười, Tứ giác Long Xuyên, và Trủng sông Hậu). Chọn các loại cây đang ở giai đoạn sau khi trồng khoảng 20 ngày trở đi để đảm bảo đủ thời gian và có sự tương tác giữa vi khuẩn và vùng xung quanh rễ. Loại bỏ lớp đất bề mặt (1 - 3 cm) quanh gốc. Thu toàn bộ đất vùng rễ và Khảo sát và lấy mẫu đất, thực vật trên đất phèn Nhận diện Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên lúa- khoai lang Vùng trồng khoai lang Vùng trồng lúa Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn liên kết với thực vật có khả năng định đạm, hòa tan lân Định danh Thí nghiệm nhà lưới Thí nghiệm đồng ruộng Đề xuất 2-3 chủng vi khuẩn triển vọng 41 cây cho vào túi nylon, ghi và dán nhãn bao gồm ký hiệu mẫu, thời gian, địa điểm, người lấy mẫu. Mẫu sau khi thu được đem đến phòng thí nghiệm để xử lý, phân lập. 3.2.1.2 Xử lý mẫu đất và mẫu cây a) Đối với đất vùng rễ dùng phân lập vi khuẩn Dùng dụng cụ vô trùng gạt lấy đất vùng cạnh rễ và vùng xung quanh rễ (cách rễ 0 - 1cm) cho vào lọ chứa đã tiệt trùng, bảo quản lạnh (4-5oC). b) Đối với mẫu cây dùng phân lập vi khuẩn Chọn các bộ phận (rễ, thân) không có dấu hiệu bệnh. Cắt mẫu thành từng đoạn ngắn (3 - 4 cm); rửa thật sạch dưới vòi nước mạnh để loại bỏ đất, bụi bẩn; để ráo tự nhiên. Để riêng từng loại mẫu trong bọc nylon sạch có ghi nhãn, bảo quản trong tủ lạnh (4-5oC) đến khi tiến hành phân lập (Cao Ngọc Điệp, 2011). 3.2.2 Nội dung 2: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn liên kết với thực vật có khả năng cố định đạm, hòa tan lân 3.2.2.1 Phân lập vi khuẩn đất vùng rễ Phương pháp phân lập vi khuẩn đất vùng rễ được thực hiện theo Cao Ngọc Điệp (2011) như sau. Đất vùng rễ sau khi để khô ở nhiệt độ phòng, dùng cối sứ nghiền mịn. Cân 1 g mẫu đất cho vào bình tam giác với 99 mL nước cất đã được khử trùng, lắc 12 giờ với tốc độ 200 vòng/phút cho các hạt đất rời ra và vi khuẩn phân tán đều trong nước. Để lắng khoảng 3 giờ, lấy 0,1 mL dung dịch nước (phần trong) trải đều trên đĩa petri có môi trường Burk không N (để phát hiện vi khuẩn cố định đạm) (Park et al., 2005), môi trường NBRIP chứa lân khó tan (phát hiện vi khuẩn hòa tan lân) (Nautiyal, 1999), để khô, ủ ở 30°C. Sau 24 – 48 giờ, các khuẩn lạc khác nhau mọc trên bề mặt môi trường được tiếp tục cấy chuyền sang các đĩa môi trường mới vài lần đến khi các khuẩn lạc xuất hiện trên đường cấy rời nhau và hình thái khuẩn lạc thuần. Kiểm tra độ thuần bằng cách quan sát dưới kính hiển vi bằng phương pháp giọt ép. Khi quan sát vi khuẩn đã thật độ thuần thì cấy chuyển sang ống nghiệm chứa môi trường đặc tương ứng để trữ ở 4°C và được xem như một chủng (isolate) thuần. 42 Các vi khuẩn xuất hiện được trên môi trường Burk được cấy sang môi trường NBRIP và ngược lại. Chọn những khuẩn lạc phát triển trên cả hai môi trường Burk và NBRIP, xem như là các chủng vi khuẩn có cả hai khả năng: cố định đạm và hòa tan lân. 3.2.2.2 Phân lập và làm thuần vi khuẩn nội sinh trong cây a) Khử trùng bề mặt mẫu (theo Cao Ngọc Điệp, 2011) Cắt mẫu rễ và thân cây đã qua xử lý thành từng đoạn nhỏ 1cm, cho vào bình tam giác 250 mL. Cho cồn 96° vào bình tam giác vừa ngập mẫu, lắc nhẹ trong thời gian 10 phút. Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần (5 phút/lần). Cho calcium hypochloride 2%, lắc nhẹ trong 10 phút. Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 4 lần (5 phút/lần). Lấy 100 - 200 µl của nước rửa lần thứ 4 chủng trên các đĩa chứa môi trường TYGA, ủ ở 30°C. Sau 24 - 48 giờ, nếu trên các đĩa môi trường này không xuất hiện khuẩn lạc thì mẫu đã đạt yêu cầu khử trùng. b) Ly trích dịch từ mẫu cây và chủng vào môi trường không đạm bán đặc Mẫu khử trùng đạt yêu cầu được cho vào cối chày vô trùng, giã nhuyễn. Cho thêm 0,5 - 1 mL nước cất vô trùng vào cối, khuấy đều và hút 500µL dịch trích mẫu chủng vào các ống nghiệm chứa môi trường LGI, NFb bán đặc không N Đậy kín các ống nghiệm, đem ủ ở 30°C khoảng 2 - 4 ngày. c) Chọn lọc và làm thuần các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân Sau 2 - 4 ngày, quan sát ống nghiệm chứa môi trường không đạm bán đặc, nếu thấy có một lớp màng mỏng (pellicle) gần bề mặt môi trường thì chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm trong dịch trích mẫu. Trải lớp môi trường bán đặc có chứa vi khuẩn nội sinh sang môi trường không đạm đặc tương ứng, ủ ở 30°C. 43 Sau 24 – 48 giờ, các khuẩn lạc khác nhau mọc trên bề mặt môi trường được tiếp tục cấy chuyền sang các đĩa môi trường tương ứng vài lần đến khi các khuẩn lạc xuất hiện trên đường cấy rời nhau và hình thái khuẩn lạc thuần nhất. Kiểm tra độ thuần bằng cách quan sát dưới kính hiển vi bằng phương pháp giọt ép. Khi thấy vi khuẩn đã thuần thì cấy chuyển sang ống nghiệm chứa môi trường đặc tương ứng để trữ ở 4°C và được xem như một chủng thuần (Barraquio et al., 1997). Các vi khuẩn mọc được trên môi trường không đạm được cấy sang môi trường NBRIP chứa lân khó tan. Chọn những khuẩn lạc phát triển trên cả hai môi trường LGI/ NFb và NBRIP, xem như là các chủng vi khuẩn có cả hai khả năng: cố định đạm và hòa tan lân. 3.2.2.3 Mô tả đặc điểm khuẩn lạc và một số đặc điểm tế bào của các chủng vi khuẩn thu được (theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2009) a) Mô tả đặc điểm khuẩn lạc Đo kích thước khuẩn lạc; Mô tả hình thái khuẩn lạc, bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi, dạng bìa khuẩn. b) Mô tả một số đặc điểm tế bào Quan sát hình thái tế bào và khả năng chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần: Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên lame sạch. Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội; Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên lame sạch; Đậy lamelle lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của lammelle tiếp xúc với lame một góc 45o rồi hạ xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí. Quan sát tế bào dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần. 44 c) Nhuộm Gram vi khuẩn Chuẩn bị vết bôi Lấy 1 giọt nước cất nhỏ lên lame. Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít khuẩn lạc trải mỏng lên lame. Để khô vết bôi trong không khí; Nhuộm tiêu bản Nhỏ 1-2 giọt crystal violet lên lame, trải đều khoảng 2 phút. Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng, để khô. Rửa mẫu bằng cồn 70% trong 30 giây bằng cách để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu. Rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô vài giây; Nhỏ 1-2 giọt fushin, trải đều, để yên 1 phút. Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng. Rửa mẫu bằng cồn 70% trong 30 giây bằng cách để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu. Rửa nước mẫu bằng nước cất vô trùng đến khi mất màu fushin, để khô; Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần. Mẫu bắt màu tím: Gram dương. Mẫu bắt màu hồng: Gram âm. 3.2.2.4 Bảo quản các chủng vi khuẩn phân lập được Các chủng vi khuẩn đã thuần được nuôi trên môi trường lỏng (môi trường dùng phân lập cho mỗi chủng vi khuẩn) trong 48 giờ, sau đó trữ với Glycerol (tỉ lệ 1:1) trong tủ âm ở - 20 0C. 3.2.2.5 Xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan của các chủng vi khuẩn phân lập được Thông qua việc định lượng đạm sinh ra khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường Burk không đạm, định lượng lân hòa tan khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường NBRIP chứa lân khó tan, có thể chọn ra các chủng tốt nhất dùng cho các thử nghiệm tuyển chọn vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân trong môi trường pH thấp. Thao tác chuẩn bị dịch vi khuẩn cho cả 2 thí nghiệm định lượng lượng đạm được vi khuẩn cố định, lượng lân được vi khuẩn hòa tan là tương tự nhau. Thời điểm trích lấy dịch nuôi cấy để đo nồng độ các chất sinh ra là khác nhau đối với mỗi thí nghiệm. Thời điểm lấy mẫu của thí nghiệm kiểm tra khả năng cố định đạm của vi khuẩn là 2, 4, 6, 8 ngày sau khi ủ (NSU). Thời điểm lấy mẫu của thí nghiệm kiểm tra khả năng hòa tan lân của vi khuẩn là 5, 10, 15, 20 ngày sau khi ủ (NSU). Mỗi thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu 45 nhiên với 3 lần lặp lại với đối chứng âm là nước cất vô trùng thay thế cho dịch huyền phù. a) Chuẩn bị dịch vi khuẩn cho các thí nghiệm định lượng Để đảm bảo lượng vi khuẩn được chủng vào các ống chứa môi trường nuôi cấy lỏng là như nhau, dùng que cấy lấy đầy 1 vòng sinh khối của mỗi chủng hòa vào ống nghiệm chứa sẵn 5 ml môi trường nuôi cấy lỏng tương ứng với môi trường đặc đang dùng để lưu trữ mẫu vi khuẩn (chẳng hạn môi trường Burk, môi trường NBRIP với vi khuẩn vùng rễ; môi trường LGI, môi trường NFb đối với vi khuẩn nội sinh). Ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút, trong 2 ngày. Sau 2 ngày để vi khuẩn làm quen với chế độ nuôi cấy lỏng lắc, mật số đạt khoảng 108 tế bào/mL (được điều chỉnh cho từng chủng), tương đương với OD660 = 0,5. Lấy 500µL dịch vi khuẩn chủng vào các ống nghiệm chứa 20 mL môi trường nuôi cấy lỏng dùng cho thí nghiệm định lượng. Cụ thể là: + Môi trường Burk không đạm, đối với thí nghiệm định lượng NH4+ sinh ra. + Môi trường NBRIP chứa lân khó tan, đối với thí nghiệm định lượng PO4- sinh ra. Ủ trên máy lắc tốc độ 120 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Tại mỗi thời điểm thích hợp, thu lấy 2mL dịch nuôi cấy đem đi xử lý và phân tích định lượng. b) Xác định khả năng cố định đạm và đo lượng ammonium hình thành Chuẩn bị hóa chất: Xem phụ lục 1. Xây dựng đường chuẩn NH4+: Lấy 6 ống nghiệm 20 ml được đánh số theo thứ tự 0 đến 5. Xây dựng đường chuẩn có hàm lượng NH4+ biến thiên từ 0,0 - 1,0 - 2,0 - 3,0 - 4,0 - 5,0 mg/L NH4+. Xử lý mẫu dịch nuôi cấy và tiến hành định lượng: Thời điểm tiến hành thu dịch nuôi cấy để định lượng đạm sinh ra là ngày 2, 4, 6 và 8 sau khi chủng. Rút 5mL dịch nuôi cấy cho vào ống ly tâm, ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút, trong 5 phút. 46 Hút 1 mL dịch trong cho vào ống nghiệm chứa 3 mL nước khử khoáng, thêm 1 mL dung dịch phenol-sodium nitroprusside và 1 mL dung dịch sodium hypochloride vào mỗi ống, trộn đều bằng máy khuấy. Để ổn định 15 - 20 phút tại nhiệt độ phòng rồi tiến hành đo lượng đạm tổng hợp được bằng phương pháp so màu ở bước sóng 640 nm. c) Xác định khả năng hòa tan lân và đo lượng phosphate hòa tan Chuẩn bị hóa chất: Xem phụ lục 1. Xây dựng đường chuẩn P2O5 Lấy 6 ống nghiệm 20ml được đánh số theo thứ tự 0 đến 5. Xây dựng đường chuẩn có hàm lượng P2O5 biến thiên từ 0,0 - 1,0 - 2,0 - 3,0 - 4,0 - 5,0 mg/L P2O5. Xử lý mẫu dịch nuôi cấy và tiến hành định lượng Thời điểm tiến hành thu dịch nuôi cấy để định lượng lân hòa tan là ngày 5, 10, 15 và 20 sau khi chủng. Rút 5 mL dịch nuôi cấy cho vào ống ly tâm, ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút, trong 5 phút. Hút 1 mL dịch trong cho vào ống nghiệm chứa 23 mL nước khử khoáng, thêm 4 mL dung dịch B vào mỗi ống, trộn đều bằng máy khuấy. Để ổn định 15 - 20 phút tại nhiệt độ phòng rồi tiến hành đo lượng lân hòa tan được bằng phương pháp so màu ở bước sóng 880 nm. 3.2.3 Nội dung 3: Tuyển chọn vi khuẩn trước khi tiến hành nhận diện Mỗi vùng sinh thái đất phèn, mỗi loại cây trồng chọn một số chủng vi khuẩn nội sinh và một số chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng cố định đạm tốt, có khả năng hòa tan lân tốt để tiến hành kiểm tra khả năng cố định đạm với môi trường Burk cải tiến pH = 4, kiểm tra khả năng hòa tan lân với môi trường NBRIP cải tiến pH = 4 và Ca3(PO4)2 được thay thế bằng FePO4. Cách tiến hành thí nghiệm này tương tự cách tiến hành thí nghiệm ở mục 3.2.2.5. Sau đó, lựa chọn một số chủng có khả năng tốt để tiến hành nhận diện. 47 3.2.4 Nội dung 4: Nhận diện, định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.2.4.1 Nhận diện một số chủng vi khuẩn đã phân lập được tuyển chọn bằng phương pháp sinh học phân tử Từ việc định lượng đạm, lân tạo ra của các chủng vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây lúa, khoai, chọn ra một số chủng vi khuẩn phân tích bằng kỹ thuật PCR và định danh. Trên cơ sở đó, lập cây phả hệ để tìm hiểu mức độ tương đồng của các chủng tốt nhất giữa các vùng. a) Tách chiết DNA (Neumann et al., 1992) Nuôi vi khuẩn trong ống nghiệm chứa 6 mL môi trường LB lỏng, ủ qua đêm ở 30 ºC. Chuyển 2 mL dịch nuôi cấy sang eppendorf, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Bỏ dịch trong, thêm 250 µL dung dịch TE pH 8,0 và đánh tan sinh khối. Sau đó, thêm sodium dodecyl sulfate (SDS) 10%. Bổ sung thêm 5µl proteinase K (20 mg/mL) và ủ ở 65ºC trong 20 phút (cứ 5 phút đảo tube 1 lần). Để loại bỏ protein. Thêm 400 µL hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 10%/NaCl 0,75 M, trộn đều và tiếp tục ủ ở 65ºC trong 20 phút. Bổ sung 600 µL chloroform-isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1) vào ống, lắc đều. Sau đó, ly âm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Chuyển phần dịch bên trên sang tube mới, thêm 1 mL isopropanol vào tube và lắc đều, ủ ở -20ºC trong ít nhất 30 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Đổ nhẹ lớp dịch bên trên, chừa lại DNA tủa ở đáy tube. Rửa DNA với 1 mL cồn 70%, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút (lặp lại 2 lần). Phơi khô DNA ở nhiệt độ phòng trong 1 - 2 giờ. Hòa tan DNA với 30 µL nước cất 2 lần vô trùng, trữ lạnh ở 4ºC nếu chưa sử dụng. b) Khuếch đại gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn Sản phẩm DNA tách chiếc từ các chủng vi khuẩn vùng rễ sau đó, được khuếch đại gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi 8F (mồi xuôi) và 1492R (mồi ngược) (Turner and Blackman, 1999) 48 + Chương trình phản ứng PCR đối với vi khuẩn vùng rễ + Thực hiện đối chứng âm không có DNA. Sản phẩm DNA tách chiếc từ các chủng vi khuẩn nội sinh được khuếch đại với cặp mồi P515FPL (mồi xuôi) và P13B (mồi ngược) (Zinniel et al., 2002). + Chương trình phản ứng PCR đối với vi khuẩn nội sinh: + Thực hiện đối chứng âm không có DNA. c) Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose Chuẩn bị gel agarose 1,2% Cân 0,48 g agarose cho vào bình tam giác đựng 45 mL dung dịch TAE 1X, dùng lò vi sóng đun trong 3 phút cho tan hoàn toàn. Lấy ra để nguội tự nhiên khoảng 10 phút (cầm tay được), bổ sung 1 µL ethidium bromide và lắc nhẹ cho hòa đều. Sau đó đổ nhẹ hỗn hợp vào khuôn để định hình gel. Khi đổ gel cần dứt khoát để tránh bọt khí. 53oC 7’ 30 chu kỳ 1’ ∞ 45’’ 4’ 10oC 72oC 72oC 94oC 94oC 45’’ ∞ 30’’ 5’ 10oC 72oC 72oC 95oC 95oC 30’’ 1’30’’ 55oC 30 chu kỳ 10’ 49 Đặt gel đã dịnh hình vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE 1X, nhỏ 10 µL sản phẩm PCR đã được trộn đều với 2 µL loading buffer vào giếng. Chạy điện di ở hiệu điện thế 95 volt trong 45 phút. Các sản phẩm của PCR và thang chuẩn được điện di trên gel agarose 1,2% có bổ sung 1µL ethidium bromide (EtBr) bằng bộ điện di một chiều Embi-Tec ở hiệu điện thế 95V trong 45 phút. Quan sát và chụp hình các band bằng hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000. So kích thước của sản phẩm PCR với thang DNA chuẩn để xác nhận vị trí các band kích thước 1500 bp và 900 bp tương ứng đối với vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh. 3.2.4.2 Giải trình tự và định danh các chủng vi khuẩn a) Giải trình tự: Sản phẩm PCR được tinh sạch theo kit Invitrogen và giải trình tự 2 mạch theo phương pháp của phương pháp Sanger bằng máy giải trình tự tự động ABI 3130 của công ty Phù Sa – Việt Nam. b) Định danh các chủng được giải trình tự: Sử dụng chương trình BLAST N của NCBI để so sánh trình tự DNA của các chủng vi khuẩn đã được giải trình tự với trình tự DNA của bộ gen ở các loài vi khuẩn trong ngân hàng gen (NCBI). Trên cơ sở sự tương đồng "Max ident" trên 97%, tên loài được đề xuất. Mối quan hệ giữa các chủng vi khuẩn đã được giải trình cũng được mô tả dựa trên cây phả hệ (phylogenetic tree) được thiết lập bằng phần mềm MEGA 6.06. 3.2.5 Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên cây lúa trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng Mặc dù đất phèn ở các vùng nghiên cứu có đặc tính khác nhau, khuyến cáo về phân bón giống nhau nên việc áp dụng công thức phân cho cây lúa và khoai lang là giống nhau. Ngoài ra, đất phèn được chọn cho nghiên cứu này là đất phèn canh tác các cây lúa hoặc khoai lang phổ biến ở ĐBSCL. 50 3.2.5.1 Thí nghiệm trồng lúa trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới Địa điểm, vật liệu thí nghiệm Đất phèn được lấy từ xã Vĩnh Viễn - huyện Long Mỹ - Hậu Giang, thí nghiệm được thực hiện tại nhà lưới trường Đại học An Giang. Giống lúa được sử dụng là OM6976 ở cấp xác nhận. Các loại phân bón được sử dụng: Phân urê (46% N), phân super lân Long Thành (16% P2O5) và kali clorua (60% K2O). Mùa vụ và phương pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện ở vụ xuân hè 2015. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng đạm lên năng suất lúa nhà lưới Thí nghiệm hai yếu tố được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 mức đạm (30 N, 60 N, 90 N kg ha-1) x 3 chủng vi khuẩn: vi khuẩn X1 (VK1); vi khuẩn X2 (VK2) và vi khuẩn X3 (VK3) với 9 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức bố trí 4 lần lặp lại, số lượng đất mỗi chậu là 10kg. Mỗi chậu gieo 5 cây và đến 9 NSS tỉa lại còn 4 cây. Các nghiệm thức thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3.3. Bảng 3.3: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng đạm lên năng suất lúa thí nghiệm nhà lưới Lượng N (kg ha-1) Chủng vi khuẩn VK1 VK2 VK3 30 NT1 NT2 NT3 60 NT4 NT5 NT6 90 NT7 NT8 NT9 Lượng lân và kali bón cho thí nghiệm: 60 P2O5 - 30 K2O kg ha-1 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn kết hợp các mức lân lên năng suất lúa Thí nghiệm hai yếu tố được bố trí theo khối đầy đủ ngẫu nhiên gồm 3 mức P2O5 (30 P2O5, 60 P2O5, 90 P2O5 kg ha-1) x 3 chủng vi khuẩn (VK1, VK2 và VK3) với 9 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức bố trí 4 lần lặp lại, đất trong mỗi chậu là 10kg. Các nghiệm thức thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3.4. Bảng 3.4: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng lân lên năng suất lúa thí nghiệm nhà lưới 51 Lượng P2O5 (kg ha-1) Chủng vi khuẩn VK1 VK2 VK3 30 NT1 NT2 NT3 60 NT4 NT5 NT6 90 NT7 NT8 NT9 Phương pháp chủng vi sinh Cách chủng vi khuẩn: hạt giống lúa được khử trùng bằng nước ấm và rửa sạch. Sau đó, ngâm hạt lúa trong cồn 70º khoảng 3 phút, loại bỏ cồn, ngâm hạt lúa vào H2O2 3% khoảng 3 phút, loại bỏ H2O2, rửa hạt lúa với nước cất đã khử trùng. Ủ hạt lúa cho nảy mầm. Từng chủng vi khuẩn được chủng vào hạt giống (đã nảy mầm) 1 giờ trước khi gieo sạ. Dung dịch vi khuẩn đạt mật số 109 tế bào/mL. Thu thập số liệu Xác định thành phần năng suất và năng suất lúa: Số bông m-2: đếm tổng số bông trong chậu. Số hạt bông-1: tổng số hạt thu được/tổng số bông thu được trên chậu. Tỷ lệ hạt chắc: (tổng số hạt chắc/tổng số hạt) x 100%. Trọng lượng 1.000 hạt: cân trọng lượng 1.000 hạt của mỗi nghiệm thức khi đã quy đổi về ẩm độ 14%. Năng suất thực tế: năng suất được xác định trên chậu và quy đổi về ẩm độ 14%. 3.2.5.2 Thí nghiệm trồng lúa ngoài đồng ruộng Địa điểm, vật liệu thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện tại 3 vùng sinh thái đất phèn: Long Mỹ - Hậu Giang (TSH); Hòn Đất - Kiên Giang (TGLX) và Hồng Dân - Bạc Liêu (BĐCM). Giống lúa OM6976 ở cấp xác nhận, sử dụng 20kg/1000m2. Các loại phân bón được sử dụng: Phân urê (46% N), phân super lân Long Thành (16% P2O5) và kali clorua (60% K2O). 52 Mùa vụ và phương pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện qua 2 vụ hè thu năm 2015 và vụ thu đông năm 2015. Vụ hè thu 2015 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng đạm lên năng suất lúa Thí nghiệm hai yếu tố được bố trí theo khối đầy đủ ngẫu nhiên gồm 3 mức đạm (30 N, 60 N, 90 N) x 3 chủng vi khuẩn: vi khuẩn X1 (VK1), vi khuẩn X2 (VK2), vi khuẩn X3 (VK3) với 9 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức bố trí 4 lần lặp lại, diện tích mỗi lô thí nghiệm là 20 m2. Các nghiệm thức thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3.5. Bảng 3.5: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng đạm lên năng suất lúa. Lượng N (kg ha-1) Chủng vi khuẩn VK1 VK2 VK3 30 NT1 NT2 NT3 60 NT4 NT5 NT6 90 NT7 NT8 NT9 Lượng lân và kali bón cho thí nghiệm: 60 P2O5 - 30 K2O kg ha-1. Vụ thu đông 2015 Thí nghiệm 2: Đánh giá sử dụng vi khuẩn triển vọng lên năng suất lúa Thí nghiệm được bố trí theo khối đầy đủ ngẫu nhiên một nhân tố bao gồm 6 nghiệm thức với 4 lần lặp lại trên diện tích mỗi lô thí nghiệm là 20 m2. Các nghiệm thức thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3.6. Bảng 3.6: Đánh giá sự phối hợp vi khuẩn triển vọng với 3 lượng N lên năng suất lúa STT Nghiệm thức Mô tả 1 00-60-30 Không bón đạm 2 90-00-30 Không bón lân 3 90-60-30 Bón đủ NPK 4 30-60-30 + VKX Bón 30 kg N ha -1, kết hợp chủng VKX được xác định từ 53 thí nghiệm 1 (vụ hè thu 2015) 5 60-60-30 + VKX Bón 60 kg N ha-1, kết hợp chủng VKX được xác định từ thí nghiệm 1 (vụ hè thu 2015) 6 90-60-30 + VKX Bón 90 kg N ha-1, kết hợp chủng VKX được xác định từ thí nghiệm 1 (vụ hè thu 2015) Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn kết hợp các mức lân lên năng suất lúa Thí nghiệm hai yếu tố được bố trí theo khối đầy đủ ngẫu nhiên gồm 3 mức P2O5 (30 P2O5, 60 P2O5, 90 P2O5) x 3 chủng vi khuẩn (VK1, VK2 và VK3) với 9 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức bố trí 4 lần lặp lại, diện tích mỗi lô thí nghiệm là 20 m2. Các nghiệm thức thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3.7. Bảng 3.7: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng lân lên năng suất lúa. Lượng P2O5 (kg ha-1) Chủng vi khuẩn VK1 VK2 VK3 30 NT1 NT2 NT3 60 NT4 NT5 NT6 90 NT7 NT8 NT9 Lượng đạm và kali bón cho thí nghiệm: 90 N - 30 K2O kg ha-1. Phương pháp chủng vi sinh Việc chủng vi khuẩn vào hạt được thực hiện như trong thí nghiệm nhà lưới, được mô tả ở mục 3.2.5.1. Thu thập số liệu Xác định thành phần năng suất và năng suất lúa: Số bông m-2: đếm tổng số bông trong mỗi khung (0,25 m2 × 2 khung) ×4. Số hạt bông-1: tổng số hạt thu được/tổng số bông thu được trên đơn vị diện tích. Tỷ lệ hạt chắc: (tổng số hạt chắc/tổng số hạt) x 100%. Trọng lượng 1.000 hạt: cân trọng lượng 1000 hạt của mỗi nghiệm thức khi đã quy đổi về ẩm độ 14%. Năng suất thực tế: năng suất được xác định vào thời điểm thu hoạch trên diện tích 5 m2 và quy đổi về ẩm độ 14%. 54 3.2.6 Nội dung 6: Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên khoai lang trồng trên đất phèn trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng. 3.2.6.1 Thí nghiệm nhà lưới Địa điểm, vật liệu thí nghiệm Đất phèn được lấy từ Bình Tân – Vĩnh Long, thí nghiệm được thực hiện tại nhà lưới trường Đại học An Giang; Vùng đất này không chỉ đại diện về đất phèn mà còn là vùng trồng khoai lang phổ biến ở ĐBSCL nên đất được thu cho thí nghiệm nhà lưới. Giống khoai lang được sử dụng là khoai lang tím nhật. Các loại phân bón được sử dụng: Phân urê (46% N), phân super lân Long Thành (16% P2O5) và kali clorua (60% K2O). Mùa vụ và phương pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí vào vụ đông xuân 2015. Thí nghiệm được trồng trong chậu, mỗi chậu chứa 15kg đất, với lượng đất này đủ để cho cây khoai lang phát triển, theo khối đầy đủ ngẫu nhiên. Gồm 2 nhân tố với 4 lần lặp lại. Mỗi nhân tố 3 nghiệm thức. Thí nghiệm gồm 3 mức đạm (30 N, 60 N, 90 N) x 3 chủng vi khuẩn: vi khuẩn X4 (VK4: Enterobacter cloacae X4), vi khuẩn X5 (VK5: Burkholderia acidipaludis X5), vi khuẩn X6 (VK6: Bacillus sp. X6) với 9 nghiệm thức. Các nghiệm thức thí nghiệm được trình bày Bảng 3.8 như sau: Bảng 3.8: Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn kết hợp lượng đạm lên năng suất khoai lang thí nghiệm nhà lưới Lượng N (kg ha-1) Chủng vi khuẩn VK4 VK5 VK6 30 NT1 NT2 NT3 60 NT4 NT5 NT6 90 NT7 NT8 NT9 Lượng lân và kali bón cho thí nghiệm: 90 P2O5 - 90 K2O kg ha-1. Thời kỳ và lượng phân được thể hiện ở Bảng 3.9. 55 Bảng 3.9: Thời kỳ và lượng phân (%) bón cho thí nghiệm Ngày bón (NSKT) Lượng phân (%) N P2O5 K2O 1 15 50 0 10 15 50 0 20 35 0 30 45 20 0 35 65 15 0 35 NSKT:

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_phan_lap_tuyen_chon_va_dinh_danh_vi_khuan_lien_ket_v.pdf
Tài liệu liên quan