Luận văn Ðánh giá sự tương thích giữa phương pháp kiểm tra vi sinh vật truyền thống và phương pháp ðo atp quang sinh học trong quá trình kiểm tra vệ sinh của dây chuyền sản xuất bia ở viện công nghiệp thực phẩm

dễ bị nhiễm vào thịt gia súc, gia cầm. Khi gặp ñiều kiện không thuận lợi các vi khuẩn này chuyển thành dạng nha bào, chịu nhiệt khi ñun ở nhiệt ñộ thấp, phát triển mạnh ở 20-30oC, mạnh nhất ở 43-47oC và chỉ trong ñiều kiện yếm khí. Vi khuẩn này sinh ñộc tố trong ruột người và ñộng vật, gây ra bệnh ñau dạ dày và ỉa chảy khi ăn phải một số lượng lớn vi khuẩn. 14
Vi khuẩn chỉ ñiểm phẩm chất Vi khuẩn chỉ ñiểm phẩm chất là những vi khuẩn mà sự có mặt của nó chứng tỏ thực phẩm ñã bị kém phẩm chất, ảnh hưởng tới giá trị dinh dưỡng, sức khỏe người sử dụng. Bao gồm các vi khuẩn thối rữa, Proteus, Clotridium pefringer ðánh giá vệ sinh thực phẩm thường dựa vào các chỉ tiêu cảm quan, lý hóa, vi sinh vật như: số lượng vi sinh vật hiếu khí trong một gam (hoặc 1 mL) thực phẩm ở phạm vi cho phép. Phạm vi này do cơ quan kiểm soát vệ sinh qui ñịnh, khác nhau tùy theo từng loại thực phẩm và tùy theo mức ñộ yêu cầu vệ sinh của từng ñịa phương, từng nước, từng khu vực. Và ñiều quan trọng là tuyệt ñối không có vi sinh vật gây bệnh vì phần lớn các vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm là vi sinh vật gây bệnh ñường ruột (tả, lỵ, thương hàn,) Do vậy vi sinh vật chỉ ñiểm có vai trò rất quan trọng trong ñánh giá vệ sinh 1.2. Công nghệ sản xuất bia, những công ñoạn cần thiết phải kiểm tra vệ sinh trong sản xuất Quá trình sản xuất bia trải qua các công ñoạn: nấu, ñường hóa, lên men (lên men chính, lên men phụ), lọc sản phẩm, bão hòa CO2, ñóng gói sản phẩm. Quá trình sản xuất có thể tóm tắt như sau: 1.2.1. Quá trình nấu, ñường hóa Quá trình nấu gồm một số bước sau: nghiền nguyên liệu, thủy phân (ñường hóa), lọc nước nha, nấu hoa houblon, làm lạnh nhanh nước nha. + Nghiền nguyên liệu: Nghiền nguyên liệu là quá trình nghiền nhỏ nguyên liệu nhằm phá vỡ cấu trúc của hạt ñể tăng bề mặt tiếp xúc với nước, làm cho nước xâm nhập vào các thành phần chất nội nhủ nhanh hơn, thúc ñẩy quá trình ñường hóa và các quá trình thủy phân khác nhanh và triệt ñể hơn. Tạo ñiều kiện ñể tăng tốc ñộ các quá trình lý học và hóa sinh học trong giai ñoạn nấu ñể nâng cao hiệu suất và chất lượng dịch ñường Nghiền có nhiều phương pháp: nghiền khô, nghiền ướt và nghiền ẩm. Nghiền ướt, nghiền ẩm nhằm giữ nguyên vỏ malt ñể rút ngắn thời gian lọc. 15 Nhưng phương pháp này tốn năng lượng, thao tác phức tạp, còn nghiền khô thì ñơn giản, dễ thực hiện và tiết kiệm năng lượng. Do vậy phương pháp nghiền khô thường ñược chọn hơn. + Quá trình nấu: thực chất là quá trình thủy phân nhằm chuyển hóa các thành phần chính trong malt và nguyên liệu thay thế ở nhiệt ñộ thích hợp thành các chất hòa tan trong nước, trong ñó chủ yếu là các hydrat cacbon và axit amin thủy phân nhờ enzym và sự thủy phân này phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt ñộ, pH, tỷ lệ nguyên liệu trong nước, tỷ lệ enzym. + Lọc dịch ñường (nước nha): Dịch ñường gồm các chất hòa tan và không hòa tan, do ñó cần phải lọc ñể tách hết các chất hòa tan ra khỏi các chất không hòa tan. Quá trình diễn ra theo hai bước: lọc hỗn dịch thủy phân và thu ñược nước nha ban ñầu, dùng nước nóng rửa bã rồi lọc thu nước nha cuối. + Nấu hoa houblon: Mục ñích ñun sôi hoa houblon là ổn ñịnh thành phần dịch ñường hóa và làm cho dịch ñường hóa có mùi thơm của hương chiết từ hoa houblon. ðun sôi hoa nhằm trích ly và các chất thơm và chất ñắng, ñông tụ protein, thanh trùng nước ñường hóa. Lượng hoa houblon sử dụng nhiều hay ít tùy thuộc vào từng loại bia và vào thị hiếu người tiêu dùng. + Lạnh nhanh và lắng trong: Mục ñích quan trọng này là giảm nhiệt ñộ nước nha xuống, ñưa oxy từ không khí vào dịch thể và kết lắng các cặn bẩn, làm trong dịch ñường. Lạnh nhanh và lắng trong thường tiến hành theo hai bước: giảm nhiệt ñộ xuống 60- 70oC, kết tủa nóng lắng xuống và bị loại hết khỏi nước nha. Khi nhiệt ñộ giảm ñến 60oC, dịch nước nha ñược bơm qua thiết bị lạnh nhanh, dịch ñược ñưa qua một thiết bị lọc ñể loại bỏ các cặn bẩn và kết tủa nóng. Tốc ñộ hạ nhiệt ñộ của dịch ñường nhanh nên hạn chế ñược sự hoạt ñộng của vi sinh vật. 1.2.2. Lên men Có hai kiểu lên men là lên men nổi và lên men chìm tùy thuộc vào việc sử dụng hai loại nấm men khác nhau. Nấm men nổi lên men ở nhiệt ñộ cao, 16 nấm men chìm lên men ở nhiệt ñộ thấp. Lên men nổi hay chìm ñều trải qua hai qua trình lên men, lên men phụ và lên men chính. a. Lên men chính: Mục ñích: nhờ tác dụng của enzym, vi sinh vật chuyển hóa ñường thành rượu, CO2 và các sản phẩm khác góp phần tạo nên hương vị cho bia. Sự tiêu hao cơ chất diễn ra mạnh mẽ, một lượng ñường khá lớn sẽ ñược chuyển hóa thành cồn và CO2. Thời gian lên men chính tùy thuộc vào nồng ñộ chất hòa tan ban ñầu của nước nha và tùy thuộc vào yêu cầu chất lượng của các loại bia, thời gian có thể là 4-8 ngày. Sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men là etanol và khí CO2. Các sản phẩm thứ cấp ñược tích tụ trong dịch nước nha ñã lên men là: glyxerin, axetaldehit, axit pyruvic, axit acetic, axit lactic các loại rượu bậc cao ñược hình thành từ axit amin. b. Lên men phụ và ủ chín: Là quá trình lên men diễn ra chậm. tiêu hao một lượng ñường không ñáng kể, lắng trong và bảo hòa CO2. Quá trình lên men phụ và ủ chín bia ñược tiến hành ở nhiệt ñộ từ 1-3oC. Mục ñích của quá trình lên men phụ và ủ chín là lên men phần ñường còn lại ñể bổ sung CO2 cho bia và hoàn thiện chất lượng bia, thu ñược một loại nước uống bão hòa CO2 và có hương thơm dễ chịu. 1.2.3. Vấn ñề vệ sinh thực phẩm nói chung và vệ sinh trong quá trình sản xuất bia nói riêng 1.2.3.1. Vệ sinh thực phẩm Nói tới vệ sinh trong sản xuất thực phẩm người ta hay ñề cập tới hai yêu cầu cần ñược thực hiện ñấy là GMP và HACCP.
GMP (Good Manuafacturing Practice) - Tiêu chuẩn thực hành sản xuất tốt. GMP là hệ thống ñảm bảo ñiều kiện chất lượng áp dụng cho tất cả các cơ sở sản xuất và chế biến thực phẩm, ñiều kiện vệ sinh tiên quyết của cơ sở sản xuất và chế biến thực phẩm. ðối tượng của GMP là tất cả các yếu tố có ảnh hưởng tới chất lượng trong quá trình sản xuất và chế biến thực phẩm. 17 Nội dung cơ bản của GMP: qui ñịnh các chuẩn mực về yêu cầu vệ sinh với cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm như vị trí, xí nghiệp, thiết kế nhà xưởng và các khu vực lân cận, yêu cầu lắp ñặt thiết bị cũng như phương tiện sản xuất, yêu cầu về nguyên liệu, công nghệ chế biến, chế ñộ làm sạch, khử trùng; yêu cầu về vệ sinh con người trực tiếp tham gia sản xuất, hệ thống an toàn sản xuất và hệ thống quản lý chất lượng ở doanh nghiệp; thực hiện nghiêm ngặt, luôn luôn duy trì, cải tiến và ñổi mới.
HACCP (Hazards Analysia critical Control Point) - Hệ thống phân tích và kiểm soát các mối nguy trọng yếu trong quá trình sản xuất chế biến thực phẩm HACCP là hệ thống ñảm bảo chất lượng ñược áp dụng ñối với các doanh nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm, ñặc biệt là các cơ sở sản xuất chế biến sản phẩm thủy sản. ðối tượng của HACCP tập trung vào các công ñoạn trong công nghệ chế biến, nơi có thể có các mối nguy về vật lý, vi sinh vật và hóa học Nội dung cơ bản của hệ thống HACCP: Phân tích các mối nguy hại, xác ñịnh tầm quan trọng của các mối nguy ñó trong nguyên liệu cũng như trong các công ñoạn, công nghệ chế biến. ðây là yếu tố hết sức quan trọng trong quá trình HACCP; xác ñịnh các ngưỡng giới hạn và các ngưỡng vận hành; xác ñịnh các biện pháp, phương thức quản lý, kiểm soát các ngưỡng tới hạn ñó và ñề ra các hoạt ñộng nhằm khắc phục trong trường hợp các ngưỡng trên vi phạm hoặc sai lệch; thiết lập hệ thống biểu mẫu trong việc thẩm ñịnh và tính toán kết quả. GMP và HACCP là hai hệ thống ñảm bảo chất lượng của sản phẩm ñược áp dụng cho tất cả các cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm cho dù qui mô sản lượng nào. GMP và HACCP ñều có mục tiêu là ngăn chặn phòng ngừa sự nhiễm bẩn trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm. Cả hai hệ thống ñều yêu cầu ñòi hỏi các ñiều kiện với doanh nghiệp trong việc ñầu tư vật chất kỹ thuật, thời gian, con người trong quá trình áp dụng. Tuy nhiên GMP là ñiều kiện bắt buộc còn HACCP mang tính chất tự nguyện. 18 Trong quá trình sản xuất, tùy thuộc vào mỗi loại sản phẩm mà có những nguy cơ nhiễm bẩn mà gây mất an toàn cho người sử dụng rất ña dạng và khác nhau. Người ta chia các nguy cơ gây mất an toàn cho người sử dụng ra làm ba nhóm: + Mối nguy hai có nguồn gốc sinh học như: vi sinh vật gây bệnh, kí sinh trùng, nấm men, nấm mốc, hay các sản phẩm biến ñổi gen. + Mối nguy hại có nguồn gốc hóa học như: dư lượng thuốc trừ sâu, thuốc thú y; các loại phụ gia phẩm màu thực phẩm; hàm lượng kim loại quá giới hạn. + Mối nguy hại vật lý: tạp chất lạ, các mảnh kim loại, ñá thủy tinh. Nguồn gây hại có thể sinh ra từ các cơ sở sản xuất hay các sản phẩm phụ sinh ra trong quá trình sản xuất, hoặc ñưa ñến ngẫu nhiên từ quá trình vận chuyển, tiêu thụ. 1.2.3.2.Vệ sinh trong quá trình sản xuất bia Trong quá trình sản xuất bia có các yêu cầu vệ sinh riêng như: vệ sinh nhà xưởng, vệ sinh cá nhân của nhân viên, vệ sinh trong quá trình bảo quản, vệ sinh về phương tiên vận chuyển, cơ sở phân phối và trong quá trình chế biến. + Yêu cầu nhà xưởng: quá trình sản xuất ñi theo dây chuyền một chiều, do ñó các kho, phân xưởng cũng phải thiết kế theo nguyên tắc ñó. Phân xưởng sản xuất phải ñảm bảo thông thoáng, cao ráo, sạch sẽ, nguồn nước cung cấp cho sản xuất phải ñầy ñủ ñảm bảo vệ sinh. + Yêu cầu vệ sinh trong quá trình sản xuất: qui trình sản xuất liên tục, thời gian sản xuất càng ngắn càng tốt, tránh tiếp xúc trực tiếp của tay công nhân với thực phẩm ñề phòng sự nhiễm bẩn, cần tự ñộng hóa qui trình sản xuất. Nguyên liệu sản xuất không có mùi vị bất thường, không nhiễm bẩn, có giá trị dinh dưỡng phù hợp. Dụng cụ thiết bị, vật liệu không thôi nhiễm ra thực phẩm, dễ vệ sinh và tiệt khuẩn dễ dàng. Quá trình sản xuất nên theo qui trình tự ñộng hóa và khép kín ñể tránh làm bẩn. Sản phẩm trước khi xuất xưởng phải ñược kiểm tra theo lô, mẻ, ca, thành phẩm không ñạt yêu cầu vệ 19 sinh phải có biện pháp xử lý, không ñược xuất xưởng như sản phẩm bình thường. + Vệ sinh cá nhân của nhân viên: Phải có khả năng tối thiểu về vệ sinh thực phẩm, nâng cao ý thức vệ sinh, giữ vệ sinh cho bản thân trong quá trình chế biến không mang bệnh truyền nhiễm. + Yêu cầu vệ sinh trong bảo quản: Kho chứa thực phẩm phải thông thoáng, có cửa sổ và quạt gió, các bao túi chứa bia phải ñể trên các sàn cao, sắp xếp trật tự, nhiệt ñộ bảo quản ổn ñịnh, phải có máy ghi nhiệt ñộ và ñộ ẩm hàng ngày. + Phương tiện vận chuyển và cơ sở phân phối: Có phương tiện vận chuyển riêng, có chế ñộ cọ rửa và sát khuẩn ñịnh kỳ các phương tiện. Cơ sở phân phối phải ñạt yêu cầu vệ sinh, thông thoáng, sạch sẽ. 1.3. Các phương pháp kiểm tra vệ sinh trong sản xuất hiện nay Hiện nay các phương pháp kiểm tra vệ sinh thường ñược áp dụng trong các cơ sở sản xuất bao gồm: 1.3.1. Phương pháp ñánh giá bằng mắt thường Phương pháp ñánh giá bằng mắt thường là phương pháp chủ yếu dựa vào quan sát bằng mắt ñể phát hiện các vết bẩn, tồn dư của quá trình chế biến còn tồn ñọng trên dụng cụ thiết bị Ưu ñiểm: - Cho kết quả nhanh, tức thời - Kinh phí ñầu tư, chi phí ñánh giá thấp - Tính cơ ñộng cao, có thể áp dụng cho nhiều loại hình sản xuất Nhược ñiểm: - ðộ nhạy rất thấp, chỉ cho phép nhận biết những sự mất vệ sinh lớn quá rõ - Mang tính chủ quan, dễ gây tranh cãi - Chỉ thực hiện ở những nơi mà con người có thể tiếp xúc ñược Phương pháp này chỉ mang tính hỗ trợ ban ñầu. 20 1.3.2. Phương pháp ñánh giá thông qua việc giám sát các thông số của hệ thống tự ñộng hoặc thông qua việc kiểm tra nồng ñộ các chất tham gia vào quá trình Ưu ñiểm: - Cho kết quả nhanh, tức thời từ ñó có giải pháp xử lý kịp thời - ðộ nhạy cao - ðộ tin cậy lớn, mang tính khách quan. Nhược ñiểm: - Kinh phí ñầu tư cao, phải có trang thiết bị hiện ñại, ñồng bộ, cán bộ có chuyên môn cao - Tính cơ ñộng thấp. 1.3.3. Phương pháp ñánh giá bằng nuôi cấy vi sinh vật truyền thống ðây là phương pháp ñánh giá dựa trên việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí, các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trên dụng cụ, thiết bị sản xuất, sản phẩm, trên tay người vận hành Ưu ñiểm: - Kết quả phân tích khách quan - Xác ñịnh ñược số lượng và chủng loại vi sinh vật trong mẫu thử Nhược ñiểm: - Phải có trang bị phòng thí nghiệm, yêu cầu cán bộ có chuyên môn cao - Tốn nhiều thời gian, cho kết quả chậm (từ 2 ñến 5 ngày) vì vậy không thể có giải pháp xử lý kịp thời - Không ñánh giá ñược tồn dư các chất dinh dưỡng. 1.3.4. Phương pháp kiểm tra bằng phát quang sinh học Phương pháp này dựa trên phép ño ATP- nguồn năng lượng dùng cho mọi tế bào ñộng, thực vật, vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Từ kết quả ño ATP ta sẽ 21 phát hiện ñược không chỉ số lượng vi sinh vật mà còn kiểm tra ñược cả tồn dư các chất dinh dưỡng làm môi trường cho vi sinh vật phát triển. ðây là phương pháp mới, tiên tiến ñang ñược nhiều nước trên thế giới áp dụng cho các cơ sở sản xuất chế biến thực phẩm. 1.4. Giới thiệu về phương pháp ATP quang sinh ATP- Adenozin triphotphat là một dạng liên kết cao năng trong các tế bào sinh vật. Năng lượng ở dạng liên kết này có tính chất linh ñộng, cho phép chuyển hóa dễ dàng sang các dạng năng lượng khác: hóa năng, nhiệt năng, cơ năng cần cho hoạt ñộng sống của tế bào. ATP chiếm vị trí ñặc biệt trong số các hợp chất cao năng. Sự tạo thành hợp chất cao năng ATP luôn là giai ñoạn thu năng lượng cuối cùng của các quá trình oxy hóa khử. ATP cũng là chất cho năng lượng trực tiếp ñối với các phản ứng thu nhiệt của sự trao ñổi chất. Các hợp chất trung gian khác chỉ là sản phẩm trung gian ñể tạo ra ATP hoặc ñược tạo thành từ ATP. Như vậy ATP có vai trò quan trọng bậc nhất trong các chuyển hóa năng lượng và là mắt xích liên hợp giữa các phản ứng thu nhiệt và tỏa nhiệt. Do ñó ATP là chất cho năng lượng vạn năng, tạo nguồn năng lượng dự trữ chung cho mọi tế bào, lượng ATP có trong các tế bào khoảng từ 0.22-1.03 fg (1). Hợp chất cao năng ATP có mặt trong tất cả các tế bào sống, ñặc biệt là trong tất cả các tế bào vi khuẩn. Sự khác nhau về lượng ATP như một chức năng thuộc trạng thái sinh học, như một chức năng quan trọng của loài. 1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp ATP quang sinh học ATP trong tế bào ñược giải phóng nhờ các tác nhân cation, dưới tác dụng của enzym luciferin và sự có mặt của Mg2+ sẽ tạo ra phản ứng phát quang. Dùng máy ño chuyên dụng có ñộ nhạy cao ñể ño cường ñộ sáng. Cường ñộ này cao hay thấp tùy thuộc vào lượng ATP có trong mẫu.Từ ñó ta xác ñịnh ñược lượng vi sinh vật và sự nhiễm bẩn trong mẫu hay dư lượng thực phẩm có trong mẫu. Sơ ñồ phương trình phản ứng: ATP + Luciferin/luciferase → AMP + PP + light 22 1.4.2. Ưu ñiểm của phương pháp ño ATP quang sinh trong ngành công nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm Phương pháp kiểm tra vệ sinh truyền thống ñòi hỏi mất nhiều thời gian từ 2 ñến 5 ngày, có khi còn lâu hơn nữa. Việc xử lý kết quả ngay khi có sự cố là không ñáp ứng ñược. ðể khắc phục những hạn chế này, ngày nay người ta sử dụng ATP quang sinh. + ATP quang sinh là phương pháp ño lường cho kết quả tức thì. + Kiểm tra có kết quả nhanh ñể có biện pháp khắc phục kịp thời trước và trong sản xuất. + Giám sát vệ sinh toàn diện: Nhận dạng ñầy ñủ cả vệ sinh lẫn dư lượng thực phẩm, nguồn môi trường cho vi sinh vật phát triển. + Có thể kiểm tra trực tiếp lượng vi sinh vật hoặc chỉ dư lượng thực phẩm tồn dư. Ngành công nghiệp thực phẩm ở Châu Âu, người ta dùng hệ thống kiểm tra nhanh ñể nhanh chóng xuất hàng trước khi bắt ñầu sản xuất ñợt hàng mới, cũng như nhận dạng khu vực có vấn ñề về ñộ sạch vệ sinh, xây dựng chế ñộ vệ sinh nghiêm ngặt, giảm thiểu tỷ lệ hàng hỏng/loại, hoàn thiện thiết kế các dòng sản phẩm, huấn luyện và ñánh giá kỹ năng của các nhân viên vệ sinh và giải quyết các trở ngại về vệ sinh. Qua việc sử dụng hệ thống này, các công ty cũng giới thiệu ñược chất lượng và giá trị sản phẩm của mình ñúng với yêu cầu người tiêu dùng và các cơ quan quản lý. Phương pháp ATP quang sinh ñã phát huy mạnh mẽ tác dụng, hiệu quả trong ngành chế biến thực phẩm và nước giải khát. Các công ty như Pepsi Cola, Nestle, Cadburge, Campbell, Bass và nhiều công ty khác ñã ñưa ATP vào chương trình QA (ñảm bảo chất lượng) của họ (16). Ưu ñiểm chính của phương pháp ATP là cho kết quả tức thì, cho biết dây chuyền sản xuất của họ là sạch hay không sạch, ñiều ñó có nghĩa là có thể sản xuất tiếp trên dây chuyền ñấy ñược hay không. ðiều này sẽ giúp công ty giảm thiểu những tổn thất về tài chính do sản phẩm bị nhiễm bẩn hoặc sản phẩm trên dây chuyền không ñáp ứng chỉ tiêu vệ sinh. ATP là phương tiện diễn giải nhanh chóng, 23 giảm ñi nhu cầu kiểm tra vệ sinh, ñáp ứng ñược yêu cầu của qui trình GMP và HACCP. 24 Chương II ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ðối tượng nghiên cứu Kiểm tra quá trình vệ sinh trong dây chuyền công nghệ sản xuất bia ở cơ sở sản xuất của Viện Công nghiệp thực phẩm. Các vị trí kiểm tra là các vị trí trọng yếu của quá trình như các tec lên men và các tec sản phẩm, máy lọc sản phẩm. Chỉ tiêu lựa chọn kiểm tra là: tổng nấm men, nấm mốc, tổng Coliforms và E.coli, tổng vi sinh vật hiếu khí 2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và thiết bị, hóa chất a. Dụng cụ thiết bị + Máy ño ATP HY_LITE 2 + Máy quang phổ UV-VIS U-1900 + Nồi khử trùng + Tủ ấm + Tủ cấy + Máy ño pH + Pipet tự ñộng, ñầu hút + ðĩa petri, giấy nhôm, ñèn cồn, bình xịt cồn, ñũa thủy tinh, b. Hóa chất + Plate count agar ( Peptone từ Carein 5,0g; cao nấm men 2,5g; D+ gluco 1,0g; agar 14,0g) Cách pha: Hòa tan 22,5 g PCA trong 1000 mL nước cất. Hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 7,0 ± 0,2 ở 25 oC. 25 + Lactose broth ( Peptone 10g; lactose 10g; beef extract 6g; nước cất 1000 mL). Cách pha: Môi trường ñơn: hòa tan 13g lactose broth trong 1000mL nước cất. Môi trường kép: hòa tan 26g lactose broth trong 1000 mL nước cất. Hòa tan môi trường, sau ñó ñem hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 6,9 ± 0,2 ở 25 oC. + Brilliant-green lactose (bile) broth ( Peptone 10g; lactose 10g; OX bile 20g; Brilliant – green 13 mL; nước cất 1000 mL). Cách pha: Môi trường ñơn: hòa tan 40g trong 1000 mL nước cất. Môi trường kép: hòa tan 80g trong 1000 mL nước cất. Hòa tan môi trường, sau ñó ñem hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 7,2 ± 0,2 ở 25 oC. + Tryptone Tryptone ( Peptone từ casein ): 20g. NaCl: 5g. Nước cất 1000 mL. Cách pha: Hòa tan môi trường, sau ñó hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 7,5 ± 0.2 ở 25 oC. + R2A agar (Yeast extract 0,5; proteose peptone 0,5; casein hydrolysat 0,5; glucose 0,5; starch soluble 0,5; natri pyruvat 0,3; K2HPO4 0,3; MgSO4 0,05; agar 12,0). Cách pha: Hòa tan 15.2 g trong 1000 mL nước cất. ðem hấp khử trùng ở 121oC trong vòng 15 phút. Sau khử trùng pH 7,2 ± 0,2 ở 25 oC. 26 + Kovacs + Oxidase + Fluoro cult (Tryptone 5,0; NaCl 5,0; Sorbit 1,0; Tryptophan 1,0; 4- brom-4chlor-3 indoly –B-D- glactogyranoside (X-gal) 0,08; 4- metylumbelliferyl –β-D-glucuronide (MGG) 0.05; 1-isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside 0.1 ). Cách pha: Môi trường ñơn: cân 17g/1000mL nước cất Môi trường kép: cân 34g/1000mL nước cất Hòa tan môi trường, sau ñó hấp khử trùng ở 121oC, 15phút. Sau khi khử trùng pH: 6,8 ± 0,2 ở 25 oC. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.2.1.Phương pháp kiểm tra vi sinh vật bằng nuôi cấy truyền thống Phương pháp truyền thống là phương pháp phổ biến nhất trong các nghiên cứu vi sinh vật học. Trên môi trường ñặc mỗi vi sinh vật sẽ phát triển thành khuẩn lạc hoặc sự sinh khí và biểu hiện ñục ở ống nghiệm. Dựa trên ñấy có thể kiểm tra số lượng vi sinh vật trong mỗi ñơn vị thể tích của dịch nghiên cứu. Phương pháp ñếm khuẩn lạc thường ñược sử dụng ñể kiểm tra số lượng nấm men, nấm mốc. + Ưu ñiểm của phương pháp là không phát hiện nhầm các vi sinh vật chết hoặc các mảnh xác hữu cơ, vì chỉ có bào tử hoặc các tế bào sống mới phát triển thành khuẩn lạc hoặc cho phản ứng sinh khí. + Nhược ñiểm: Khi làm dịch pha loãng không phải mọi vi sinh vật ñều có thể tách khỏi bề mặt chất rắn ñể hòa tan vào nước. Không có loại môi trường dinh dưỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển. Các vi sinh vật phát triển trên mỗi loại môi trường chỉ tồn tại một nhóm sinh lý nhất ñịnh. ðối với vi sinh vật mà những bào tử thường dính chặt vào nhau thành từng chuỗi, từng ñôi, từng khối thì khi phát triển trên môi trường, thì mỗi 27 chuỗi, mỗi khối chỉ hình thành một khuẩn lạc. Vì vậy số khuẩn lạc chưa phản ánh ñược chính xác số tế bào, bào tử trong dịch nghiên cứu. Khi cấy dịch pha loãng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy ñược số khuẩn lạc chênh nhau 10 lần. Vì vậy muốn kết quả phân tích có giá trị so sánh tốt, chúng ta nên sử dụng một ñộ pha loãng thống nhất với từng nhóm vi sinh vật. 2.2.2.1.1. Phương pháp xác ñịnh tổng số Coliforms và E.coli Cấy vào 5 ống ñựng môi trường canh thang lỏng nồng ñộ kép với một lượng 10 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống ñều thả ống duham lộn ngược. Tiếp theo, cấy vào 5 ống ñựng môi trường canh thang lỏng nồng ñộ ñơn với một lượng 1 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống ñều thả ống duham lộn ngược. Cấy vào 5 ống ñựng môi trường canh thang lỏng nồng ñộ ñơn với một lượng 0.1 mL mẫu (hoặc dung dịch mẫu pha loãng), trong mỗi ống ñều thả ống duham lộn ngược. Ủ các ống sau khi cho mẫu vào ở nhiệt ñộ 35oC trong 24 hoặc 48 h và quan sát. Với những ống có biểu hiện ñục và sinh khí, chuyển tiếp lần lượt 10 mL , 1mL, 0.1mL vào 5 ống môi trường brilliant kép và 5; 5 ống môi trường Brilliant ñơn, nuôi tiếp ở 35oC sau 48 h. sau ñấy quan sát và ñọc kết quả theo bảng kết quả trong ISO 9308-phần II. Mẫu có Coliforms với biểu hiện ñục và sinh khí ở ống. Chuyển tiếp 10 mL, 1mL, 0.1 mL vào 5 ống môi trường tryptone kép và 5; 5 ống môi trường Tryptone ñơn, nuôi tiếp ở 44oC sau 24 h. Cho vào mỗi ống vài giot Kovacs, nếu biểu hiện màu hồng trong ống, chứng tỏ sự có mặt của E.coli. 2.2.2.1.2. Tính tổng số nấm men, nấm mốc Chuẩn bị dịch pha loãng và môi trường ñĩa thạch. Nấu từng loại môi trường thích hợp cho từng nhóm vi sinh vật. Hòa tan môi trường rồi phân phối vào các lọ, khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở 121oC trong 15 phút. Lấy 1mL mẫu với tỷ lệ pha loãng nhất ñịnh cho vào các hộp ñĩa thạch ñã ñược khử trùng, mỗi mức pha loãng dùng 4 ñĩa thạch. Sau ñấy rót vào mỗi hộp ñĩa khoảng 10 mL môi trường thạch sau khử trùng và ñể nguội ở 40-50oC. ðậy 28 nắp và xoay tròn mỗi hộp trên mặt tủ cấy, ñể nguội ñến khi mặt thạch ñông lại, ghi số mẫu và nồng ñộ pha loãng lên mỗi ñáy hộp petri và bọc giấy báo rồi ñem nuôi ở 35oC và ñọc kết quả sau 48h ± 3. 2.2.2.1.3. Tổng vi sinh vật hiếu khí Sử dụng môi trường R2A agar, hòa tan với lượng 15,2g/1000 mL, tiếp theo ñem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Lấy 1 mL mẫu hoặc mẫu ñã pha loãng cho vào hộp petri ñã ñược khử trùng, rót vào khoảng 10 mL môi trường R2A agar ñã khử trùng, ñậy nắp và xoay tròn ñều mỗi hộp trên mặt tủ cấy, ñể nguội, ñợi khi mặt thạch ñông lại hoàn toàn sau ñấy ghi tên mẫu và nồng ñộ pha loãng lên ñáy hộp petri, bao giấy rồi ñem nuôi ở 35oC trong vòng 48h ± 3. Khi ñủ thời gian, ñem ra ñọc kết quả bằng cách ñếm các khuẩn lạc trên ñĩa thạch. Sau ñấy báo cáo số khuẩn lạc trên một ñơn vị thể tích mẫu tương ứng. 2.2.2.2. Phương pháp xác ñịnh ñộ sạch bằng ATP quang sinh ðể nghiên cứu ứng dụng phương pháp kiểm tra nhanh vệ sinh trong dây chuyền sản xuất bia bằng ño ATP quang sinh, các bước cần phải tiến hành như sau: - Nhận dạng các ñiểm kiểm tra: Các ñiểm kiểm tra ñược coi là các ñiểm kiểm soát tới hạn (CCP), ñại diện cho hiệu quả của quá trình vệ sinh. Kết quả thu ñược sẽ phản ánh thực tế hiệu quả của quá trình vệ sinh. Các ñiểm kiểm tra nói chung ñược chia làm hai nhóm: Bề mặt tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm và nhóm bề mặt tiếp xúc gián tiếp với sản phẩm. - Lập kế hoạch lấy mẫu: Căn cứ sơ ñồ sản xuất, xây dựng kế hoạch lấy mẫu, tần suất lấy mẫu cho phù hợp từng vị trí kiểm tra. - Thu thập dữ liệu và xây dựng giới hạn thường quy: Nội dung này giúp nhận diện tình trạng vệ sinh hiện tại của các vị trí kiểm tra. Những dữ liệu này bao gồm tại các vị trí kiểm tra ở cả trạng thái bẩn và trạng thái ñã vệ sinh sạch sẽ. 29 - Xác ñịnh các giá trị giới hạn: Sau khi có ñủ các số liệu về tình hình vệ sinh ở từng vị trí kiểm soát, kết hợp với theo dõi quá trình sản xuất và những kết quả kiểm tra vệ sinh thông thường sẽ tiến hành xây dựng mức kiểm soát vệ sinh bằng ATP quang sinh. - ðo ATP quang sinh bằng thiết bị ño HY_LITE 2. ðặc tính kỹ thuật của máy: + Khoảng tuyến tính 0-99000 RLU + Có thể lưu hơn