Luận văn Ảnh hưởng của PH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain trong quả dứa

Trong phân tử enzyme bromelain, trung tâm hoạt động là cysteine, chứa nhóm hóa học hoạt động mạnh là – SH . Khả năng xúc tác của nhóm cysteine là nhờ liên kết đồng hóa trị được tạo thành thioester giữa nhóm acyl của cơ chất và nhóm sulfuhydryl của gốc cysteine. Trong môi trường pH sinh lý (pH = 6 – 8), phần lớn các nhóm – SH ở trạng thái không ion hóa và sự tạo thành liên kết hydro với cơ chất là do sự tham gia proton của nhóm – SH . Chính nhóm proton – SH sẽ làm tăng mật độ điện tích xung quanh nguyên tử lưu huỳnh (Lê Ngọc Tú, 2004). Bên cạnh đó pH còn ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác, mức độ ảnh hưởng của pH môi trường lên enzyme tùy thuộc vào nhiệt độ, loại cơ chất, thời gian phản ứng, độ tinh khiết của enzyme, bản chất của dung dịch đệm và sự hiện diện của chất tăng hoạt. 2.3 GIỚI THIỆU VỀ PHẢN ỨNG ENZYME Enzyme là một chất xúc tác sinh học đặc hiệu, có vai trò xúc tác các phản ứng sinh hóa diễn ra trong cơ thể sống. Về cấu tạo, enzyme có bản chất là protein, trong phân tử enzyme có một hoặc vài bộ phận mang tính chất đặc hiệu, chỉ có bộ phận này mới tham gia xúc tác phản ứng. Bộ phận này được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. Trong trung tâm hoạt động, có những nhóm chức hóa học có chức năng trực tiếp trong quá trình xúc tác phản ứng. Tất cả các phần còn lại của enzyme đóng vai trò như một cái khung, giữ cho cấu trúc không gian thích hợp với khả năng xúc tác của enzyme. (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.3.1 Động hóa học của phản ứng cơ bản Tất cả các phản ứng sinh hóa đều có thể diễn ra với sự có mặt hay không có mặt enzyme. Thông thường, các phản ứng hóa học chỉ có thể xảy ra khi phân tử các chất tham gia phản ứng phải tiếp xúc với nhau ở vị trí tham gia phản ứng và chúng phải ở trạng thái hoạt động. Muốn hoạt hóa các phân tử này cần cung cấp cho chúng một mức năng lượng nào đó đủ để đạt đến trạng thái hoạt hóa. Năng lượng đó gọi là năng lượng hoạt hóa. Khi có sự tham gia của enzyme, năng lượng cản trở được hạ thấp, nhờ vậy sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất diễn ra dễ dàng hơn. Tức là đối với phản ứng có enzyme, chỉ cần một mức năng lượng nhỏ cung cấp cho hệ thống thì phản ứng đã xảy ra nhanh chóng. Vai trò xúc tác của enzyme trong phản ứng hóa học là khi có sự tham gia của các Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 10 enzyme, cơ chất được hoạt hóa mạnh, làm thay đổi tính chất và cấu trúc của cơ chất, từ đó sinh ra các sản phẩm mới của phản ứng (Lê Ngọc Tú, 2003). 2.3.2 Động học phản ứng enzyme Năm 1913, hai nhà khoa học Lenom Michealis và Maud Menten đã đưa ra mô hình động học để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản ánh mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme. Theo mô hình này, enzyme (E) kết hợp với cơ chất (S) tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (E – S). Phức hợp này sẽ được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme. Enzyme được giải phóng sẽ thực hiện phản ứng mới. Theo Michealis – Menten, cơ chế xúc tác tổng quát của phản ứng có enzyme được trình bày theo sơ đồ: Trong đó: K1, K-1, K2, K-2 là những hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng. K -1 có giá trị nhỏ nhất. Phản ứng chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm là quan trọng nhất K2 tỉ lệ với nồng độ ES: v = K2.[ES] (v: vận tốc phản ứng) Khi nồng độ ES càng lớn, vận tốc phản ứng càng lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Theo thuyết Mischaelis và Menten, cơ chế phản ứng có xúc tác của enzyme xảy ra qua ba giai đoạn:  Giai đoạn một: enzyme (E) sẽ kết hợp với cơ chất (S) tại vị trí trung tâm hoạt động của enzyme bằng các liên kết hóa học, tạo thành phức hệ enzyme cơ chất (E-S). Ở giai đoạn này, các liên kết được hình thành thường là những liên kết yếu nên phức hệ E – S thường không bền. Phản ứng tạo phức hệ này thường xảy ra rất nhanh và cần có một ít năng lượng. Giữa E và S có năm loại liên kết tham gia, mỗi loại có đặc tính riêng và năng lượng liên kết khác nhau, gồm liên kết phối trí, liên kết hydro, liên kết ion, liên kết kỵ nước lực Vander-Waals và liên kết do dịch chuyển điện tử.  Giai đoạn hai: khi tạo thành phức hệ E – S, dưới tác dụng của enzyme, cơ chất sẽ bị thay đổi về cấu trúc không gian và mức độ bền vững của các liên kết bên trong phân tử, dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia ES E + P K2 E + S ES E + P K1 K -1 K2 K -2 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 11 phản ứng. Sau đó xảy ra sự thay đổi mật độ điện tích của phức hợp E – S làm biến dạng các liên kết giữa chúng, kết quả là cơ chất được hoạt hóa, dẽ dàng tham gia phản ứng.  Giai đoạn ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm của quá trình phản ứng được tạo thành, enzyme tách ra và trở về trạng tháng ban đầu, chuẩn bị kết hợp với phân tử cơ chất khác. Quá trình phản ứng hoàn thành. (citied by P. R. Mathewson, 1998) 2.4 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CASEIN Để xác định hoạt tính xúc tác của một loại enzyme, điều quan trọng nhất là lựa chọn cơ chất và phương pháp đo hoạt tính phù hợp. Khả năng xúc tác của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào loại cơ chất. Đối tượng nghiên cứu ở đây là bromelain quả, cơ chất được chọn là casein sữa (hoặc có thể là dạng muối caseinate). Casein là protein chủ yếu có trong sữa, chiếm khoảng 80% protein của sữa. Casein là một trong những protein có tính acid vì trong phân tử của chúng có chứa nhiều gốc acid glutamic và acid aspartic. Các casein đều có điểm đẳng điện pI= 4,6. Casein không có cấu trúc bậc ba và bốn nên không bị biến tính theo định nghĩa mà bị biến đổi phần lớn do bị thủy phân bằng enzyme hoặc do xử lý nhiệt, khi đó các liên kết peptide bị cắt đứt và hình thành những nitro phi protein (các mạch peptide ngắn, acid amine tự do, muối amonium..). Các muối caseinate thì bền với nhiệt và tan trong nước tốt hơn. Casein trong sữa gồm bốn dạng chính: α (s1) và α (s2)-casein, β-casein, κ-casein. (Lê Văn Việt Mẫn, 2004)  α (s1)-casein: phân tử lượng khoảng 23000 Da, có 199 gốc acid amine. Do sự phân bố các phần tích điện và các phần ưa béo không đồng đều nên các phân tử loại này có tính chất lưỡng cực, 1 đầu ưa nước, 1 đầu kỵ nước.  α (s2)-casein: phân tử lượng khoảng 25000 Da, có 207 gốc acid amine, có tính ưa nước cao nhất trong các loại casein do phân tử của nó chứa nhiều nhóm phosphoryl và gốc cation nhất.  β-casein: phân tử lượng khoảng 24000 Da, có 209 gốc acid amine, có tính ưa béo cao nhất. Dưới 40C, β-casein hoàn toàn bị khử trùng hợp do có nhiều tương tác ưa béo bị phá hủy.  κ-casein: phân tử lượng khoảng 19000 Da, có 169 gốc acid amine. Loại này chỉ chứa một gốc phosphoryl và cũng có tính lưỡng cực. Đầu amino của phân tử protein thì ưa béo còn đầu carboxyl thì ưa nước. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 12 Casein trong sữa có nguồn gốc từ những chủng bò khác nhau thì có thể có cấu trúc bậc một khác nhau. Tuy nhiên cấu trúc bậc một của cùng một loại casein chỉ khác nhau bởi vài gốc acid amine trong phân tử protein của chúng (Lê Ngọc Tú, 2003). Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein Acid amine Tỉ lệ (%) Glutamic Acid Proline Leucine Lysine Valine Aspartic Acid Serine Tyrosine Isoleucine Phenylalanine Threonine Arginine Histidine Alanine Methionine Glycine Tryptophan Cystine 20,2 % 10,2 % 8,3 % 7,4 % 6,5 % 6,4 % 5,7 % 5,7 % 5,5 % 4,5 % 4,4 % 3,7 % 2,8 % 2,7 % 2,5 % 2,4 % 1,1 % 0,3 % Nguồn: truy cập ngày: 16/12/2006 2.5 SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME BROMELAIN Shoshi et al. (1975) đã nghiên cứu về sự biến đổi về thành phần hóa học của bromelain thân I-1 và bromelain quả A dưới sự tác động của 2-hydroxy-5-5-nitrobenzyl Bromide, tetra nitromethane và H2O2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, dưới tác động của các hợp chất trên, enzyme bromelain bị biến đổi mạnh về cấu trúc, thành phần các acid amine trong phân tử, trong khoảng pH và nhiệt độ nhất định. (Nguồn: truy cập ngày: 15/03/2007) Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 13 Yamada, Takahashi và Murachi (1976), đã tinh chế và định tính được một loại protease từ quả dứa, tên là bromelain quả FA2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự biến đổi của enzyme này sẽ sinh ra chuỗi amino acid cuối cùng là Ala – Val – Pro – Gln – Ser – Ile – Asp – Trp – Arg – Asp – Tyr – Gly – Ala Thành phần amino acid của FA2 không khác biệt nhiều so với bromelain thân, tuy nhiên về cấu tạo FA2 có ít hơn về tổng lượng lysine và alanine so với glycine như bromelain thân nên có thể kết luận FA2 không phải là một glucoprotein. (Nguồn: opt=Abstract, truy cập ngày: 12/03/2007) Waliszewski và Corzo (2004) cũng đã nghiên cứu về ái lực xúc tác của enzyme bromelain quả dạng thô trên những cơ chất protein khác nhau. Nghiên cứu đã thực hiện với dịch quả dứa ở bốn mức độ chín khác nhau trên năm loai cơ chất gồm azocasein, azoalbumine, hemoglobin, natricaseinate và casein. Sản phẩm tạo thành được xác định bằng phương pháp quang phổ. Nghiên cứu đã đưa ra kết luận về khoảng pH và nhiệt độ tối thích đối với hoạt tính xúc tác của bromelain quả trên từng loại cơ chất trên. (Nguồn: truy cập ngày: 15/03/2007) Bên cạnh đó, Andrew et al. (1990) cũng đã tiến hành nghiên cứu về nhóm các enzyme cysteine proteinase của cây dứa và các nghiên cứu về ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của bromelain quả, comosain và pinguinain trên các loại cơ chất tổng hợp, sử dụng phương pháp quang phổ để xác định sản phẩm tạo thành. Một phần kết quả nghiên cứu cho thấy trong thân dứa có tối thiểu bốn loại cysteine protease trong khi trong quả dứa chỉ chứa 2 loại là bromelain thân và bromelain quả với bromelain quả là chủ yếu. Với cơ chất tổng hợp, hoạt tính của các cysteine proteinase này là thể hiện mạnh nhất. Ở trong nước, Phạm Thị Trân Châu và cộng sự cũng nghiên cứu một số tính chất của bromelain tách từ chồi dứa tây cho thấy trong chồi dứa, bromelain có hoạt tính cực đại ở pH = 6,5 nhiệt độ tối thích là 600C. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 14 2.6 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu: khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả (thô) trên cơ chất là casein. Phần thí nghiệm bao gồm các nội dung:  Trích ly dung dịch enzyme bromelain quả (thô) từ nguồn nguyên liệu dứa tươi, giống dứa Queen (Ananas comosus), đạt độ chín 2 (chín 2-3 hàng mắt, thường sử dụng trong chế biến các sản phẩm dứa_thực phẩm)  Khảo sát sự thay đổi các đặc tính của enzyme bromelain trong dịch chiết (tính chất vật lý, hoạt tính thủy phân) theo thời gian bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau.  Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả (thô) trên cơ chất là casein và sau đó xác định hoạt tính của enzyme bằng cách xác định nồng độ sản phẩm sinh ra từ phản ứng thủy phân bằng phương pháp quang phổ. (áp dụng phương pháp Kunitz) Từ cơ sở là quá trình nghiên cứu trên, xây dựng biểu đồ biểu diễn mối tương quan giữa pH và nhiệt độ ảnh hưởng lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 15 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ. Thời gian thực hiện: Từ 12/3/2007 đến 28/5/2007. 3.1.2 Nguyên liệu  Dứa giống Queen, đạt độ chín 2 (chín 2-3 hàng mắt) 3.1.3 Hóa chất thí nghiệm  Casein – sodium caseinate, từ sữa bò (Sigma)  L - Cysteine hydrochlorid – monohydrate (Merck)  Trichloroacetic acid (TCA) (Trung Quốc)  Ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt (EDTA) (Trung Quốc)  L - Tyrosine (C9H11NO3) (Merck)  Disodium hydro phosphate (Na2HPO4.12H2O), sodium dihydro phosphate (NaH2PO4.2H2O) (Trung Quốc)  Acid hydrochlorid 0,1N 3.1.4 Thiết bị thí nghiệm  Máy ly tâm lạnh (Hattich centrifugen D-78532 Tuttlingen, 1999, Germany)  Thiết bị ủ nhiệt (Water Bath)  Máy đo quang phổ (Hitachi U-1500 Spectrophotometer)  Cuvette thạch anh  Máy đo pH (Thermo electron corporation)  Cân phân tích độ chính xác 0,0001; 0,01  Micropipette, pipette, nhiệt kế  Máy ép trái cây (Philip)  Tủ lạnh, tủ đông và một số dụng cụ khác Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 16 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu và hóa chất nghiên cứu i. Phương pháp trích ly enzyme bromelain quả (thô) Dứa ở độ chín đã được lựa chọn, sau khi thu hái, tiến hành trích ly enzyme bromelain theo phương pháp trích ly tổng quát cho các enzyme theo sơ đồ ở hình 6. Hình 6: Sơ đồ quy trình trích ly enzyme bromelain quả (thô) Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004 ii. Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme bromelain Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong quả khóm theo các điều kiện xử lý khác nhau được tiến hành theo phản ứng thủy phân của enzyme bromelain trong dịch quả trên cơ chất là casein (phương pháp Kunitz, xem phụ lục). iii. Phương pháp chuẩn bị dung dịch casein 1% Cơ chất casein sử dụng trong quá trình xác định hoạt tính của enzyme bromelain được chuẩn bị theo sơ đồ ở hình 7. Hình 7: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch casein 1% Casein (1 g) 100 ml dd đệm phosphate 0,05 M, pH = 7,5 Đun cách thủy (85-900C, 1h) Bảo quản (40C) Dứa chín Gọt vỏ, bỏ mắt, cắt nhỏ Ép lấy dịch quả Lọc (giấy lọc) Ly tâm lạnh (7000 vòng/phút, 40C) Dịch chiết chứa enzyme bromelain quả Bảo quản Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 17 3.2.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Khảo sát sự thay đổi các đặc tính của enzyme bromelain trong dịch chiết (tính chất vật lý, hoạt tính thủy phân) theo thời gian bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Mục đích Xác định điều kiện bảo quản thích hợp mà enzyme vẫn duy trì và ổn định hoạt tính. Tiến hành thí nghiệm Dung dịch enzyme sau khi trích ly sẽ được đưa vào bảo quản với 2 nhân tố Nhân tố A: Nhiệt độ bảo quản A1: Nhiệt độ lạnh 40C A2: Nhiệt độ lạnh đông -30 0C Nhân tố B: Thời gian bảo quản, thay đổi ở 10 mức độ: B1: 1 ngày B2: 2 ngày B3: 3 ngày B4: 4 ngày B5: 5 ngày B6: 6 ngày B7: 8 ngày B8:10 ngày B9:12 ngày B10:14 ngày Mẫu chuẩn đối chứng là mẫu không bảo quản (mẫu vừa mới trích ly): B0 Ứng với mỗi nghiệm thức thời gian là một mẫu thử, lặp lại 2 lần. Số mẫu thí nghiệm: (10 nghiệm thức + 1 mẫu đối chứng)* 2 lần lặp lại * 2 (điều kiện bảo quản) = 44 mẫu Thu nhận kết quả Sau thời gian bảo quản, mẫu thí nghiệm được kiểm tra để xác định đặc tính vật lý (màu sắc, độ kết lắng) và hoạt tính enzyme theo phương pháp Kunitz với cơ chất là casein, điều kiện thí nghiệm: pH = 7,5; nhiệt độ = 370C. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả(trong dịch quả dứa) trên cơ chất là casein Mục đích Tìm hiểu quy luật biến đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả dứa ở những điều kiện tiền xử lý khác nhau. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 18 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố: Nhân tố C: pH môi trường Với khoảng pH khảo sát từ 4,6 ÷ 9,5; chia làm 11 mức độ C1: pH = 4,6 C2: pH = 5,6 C3: pH = 6,2 C4: pH = 6,5 C5: pH =6,8 C6: pH = 7,1 C7: pH = 7,5 C8: pH = 7,8 C9: pH = 8,4 C10: pH = 9,0 C11: pH = 9,5 Nhân tố D: Nhiệt độ môi trường Với khoảng nhiệt độ khảo sát thay đổi từ 100C ÷ 700C; chia làm 13 mức độ D1: 100C D2: 150C D3: 200C D4: 250C D5: 300C D6: 350C D7: 400C D8: 450C D9: 500C D10: 550C D11: 600C D12: 650C D13: 700C Ứng với mỗi nghiệm thức, thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Tổng số mẫu thí nghiệm: n x m = 11 x 13 x 2 (lần lặp lại) = 286 mẫu Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau: D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 C1 C1 D1 C1 D2 C2 C2 D3 C3 C3 D4 C4 C4 D5 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 19 Tiến hành thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein. Các bước thực hiện dựa vào phương pháp Kunitz (phụ lục). Ứng với mỗi giá trị khảo sát có thực hiện thêm 1 mẫu đối chứng kèm theo (hình 8). Kết quả thí nghiệm - Hoạt tính của enzyme bromelain còn lại trong mẫu ở các chế độ xử lý khác nhau, được xác định theo mức độ thủy phân casein. - Xác định sự tương tác của điều kiện pH môi trường và nhiệt độ xử lý đến sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain quả dứa. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 20 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN BẢO QUẢN DỊCH CHIẾT DỨA CHỨA ENZYME BROMELAIN QUẢ ĐẾN ĐẶC TÍNH ENZYME Trong quá trình nghiên cứu về enzyme bromelain ở dạng còn tồn tại trong dung dịch dứa tươi, bước đầu tiên là trích ly dung dịch dứa, loại bỏ các hợp chất màu và tạp chất. Để đồng nhất mẫu, cần tiến hành trích ly một lượng lớn enzyme, sau đó đưa vào bảo quản ở điều kiện tối ưu nhất mà không làm thay đổi lớn đến đặc tính enzyme trong dung dịch. Vì vậy, vấn đề đặt ra là cần tiến hành khảo sát khả năng bảo quản enzyme trong điều kiện nào là tốt nhất để hạn chế tối thiểu sự biến đổi của dung dịch enzyme. Thí nghiệm tiến hành khảo sát ở hai điều kiện bảo quản là tồn trữ lạnh ở nhiệt độ 4oC và bảo quản lạnh đông ở nhiệt độ -30oC. Dung dịch dứa tươi chứa enzyme bromelain quả được tiến hành trích ly, ly tâm và cho vào bao PA (5ml dd / mẫu), tiến hành bảo quản ở 2 chế độ nhiệt độ: bảo quản lạnh 4oC và lạnh đông ở -30oC, sau các khoảng thời gian dự kiến, mẫu được đem phân tích hoạt tính enzyme theo phương pháp Kunitz, đồng thời được đánh giá cảm quan về các đặc tính vật lý, có sự so sánh giữa các mẫu. Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain theo thời gian bảo quản được thể hiện ở bảng 2. Bảng 2: Kết quả theo dõi hoạt tính enzyme bromelain trong dd dứa tươi theo thời gian bảo quản Thời gian (ngày) Bảo quản lạnh (4 0C) Bảo quản lạnh đông (-30 0C) 0 10,355 b 10,270 c 1 10,375 b 9,320 a 2 10,775 c 9,580 b 3 11,385 d 11,795 c 4 11,415 d 11,925 d 5 12,050 e 11,925 d 6 12,040 e 11,910 d 8 12,045 e 11,895 d 10 12,015 e 11,890 d 12 10,775 c 11,985 d 14 7,825a 11,990 d Kết quả thể hiện là hoạt tính của enzyme theo đơn vị TU/ml dd, trên cơ chất là casein Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 21 Từ kết quả ở bảng 2 và đồ thị ở hình 8 cho thấy các mẫu dung dịch chứa enzyme được bảo quản trong điều kiện lạnh và lạnh đông có hoạt tính enzyme không ổn định trong khoảng 3 ngày bảo quản đầu. Tuy nhiên, ở ngày bảo quản thứ 4 có sự thay đổi rõ rệt, hoạt tính enzyme bắt đầu ổn định hơn so với những ngày bảo quản tiếp sau, thể hiện qua giá trị hoạt tính TU/ml dung dịch tăng khác biệt đáng kể. Điều này có thể lý giải là do dung dịch ban đầu là một hệ tương đối phức tạp, trong thời gian đầu có thể có các phần tử trong hệ tương tác với nhau làm hoạt tính enzyme proteases trong hệ không được ổn định. Bên cạnh đó, do trong dung dịch ban đầu còn tồn tại một số phần tử “tiền enzyme” protease, sau một thời gian, gặp điều kiện thích hợp, các phần tử này sẽ biến đổi thành các protease, làm tăng nồng độ enzyme trong hệ nên hoạt tính thủy phân của enzyme tổng tăng lên. Ngoài ra, trong quá trình trích ly, các tác động của những thiết bị ép tách, ly tâm và sự chênh lệch nhiệt độ giữa các công đoạn có thể làm enzyme trong dung dịch bị ảnh hưởng. 6 7 8 9 10 11 12 13 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Thời gian (ngày) H o ạt tín h( TU /m l) BQ lạnh BQ lạnh đông Hình 8: Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt tính của enzyme bromelain trong dd dứa tươi So sánh giữa hai điều kiện bảo quản cho thấy, mẫu được bảo quản ở các điều kiện lạnh và lạnh đông nhìn chung hoạt tính enzyme thể hiện tốt vào ngày bảo quản thứ 4 trở đi. Tuy nhiên đến ngày bảo quản thứ 10, một số mẫu bảo quản ở điều kiện nhiệt độ lạnh có hiện tượng hư hỏng, enzyme bromelain trong dung dịch lúc này bắt đầu giảm hoạt tính. Hoạt tính enzyme ở ngày thứ 12 và 14 giảm thấp hẳn, khác biệt có ý nghĩa khi so sánh với giá trị thu được từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 10. Do enzyme tồn tại trong dung dịch dứa là một hệ phức tạp, các biến đổi khác của các phần tử bên trong hệ đều gây ảnh hưởng đến đặc tính của enzyme. Xét về mặt khoa học thực phẩm, mẫu lúc này sẽ không còn khả năng sử dụng được nên ngừng quá trình khảo sát. Đối với mẫu bảo quản ở điều kiện lạnh đông, tính chất của enzyme trong dung dịch ổn định hơn, thể hiện qua giá trị hoạt tính thu được không thay đổi trong suốt thời gian tồn Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 22 trữ từ ngày thứ 4 đến sau 2 tuần bảo quản. Enzyme ở điều kiện bảo quản này có thể sử dụng tốt cho nghiên cứu trong thời gian dài. Điều này có thể giải thích dựa trên khả năng kìm hãm các hoạt động sinh hóa, vi sinh của hợp chất nhờ lạnh đông. Ở điều kiện lạnh đông -30oC, 86% nước trong dung dịch chứa enzyme bị đóng băng. Không có nước tự do, phần lớn các phản ứng sinh hóa có thể xảy ra trong dung dịch mẫu sẽ bị kìm hãm, một số có thể bị vô hoạt. Vì thế, sau rã đông, mẫu dung dịch có thể duy trì được trạng thái gần như ban đầu và không ảnh hưởng lớn đến đặc tính của các phần tử trong dung dịch. Các nghiên cứu về sự ổn định của enzyme cũng cho thấy, lạnh đông nhanh ở nhiệt độ nhỏ hơn -20oC (tốt nhất là -70oC hay lạnh đông bằng Nitơ lỏng) là chế độ tối ưu nhằm duy trì hoạt tính của enzyme (Copeland, 2000). Về đặc tính cảm quan, mẫu dung dịch dứa tươi chứa enzyme bromelain quả sau ly tâm ban đầu có trạng thái trong, màu vàng sáng đặc trưng của dung dịch dứa, không vẩn đục, không có mùi lạ. Sau những khoảng thời gian bảo quản mẫu ở hai điều kiện trên, nhận thấy các mẫu dung dịch có sự khác biệt ở nhiều mặt: - Mẫu được bảo quản ở điều kiện lạnh đông, sau các khoảng thời gian bảo quản từ 1 ngày, 2 ngày..đến 20 ngày, dung dịch sau rã đông vẫn giữ được trạng thái và màu sắc như ban đầu, không mùi lạ, không vẩn đục. - Mẫu được bảo quản ở điều kiện lạnh 4oC, sau 6 ngày bảo quản vẫn còn màu vàng sáng, không mùi lạ, không vẩn đục. Sau 10 ngày bảo quản, mẫu có màu vàng sậm, hơi vẩn đục, có mùi lạ. Sau 12 đến 14 ngày bảo quản, mẫu có mùi lạ mạnh, một số mẫu có hiện tượng sinh bọt khí, dung dịch bị đục, có hiện tượng lên men, bao bì bị căng phồng. Ở các mẫu này, sự khảo sát được dừng lại. Bảo quản lạnh Bảo quản lạnh đông Hình 9: Mẫu dung dịch dứa chứa enzyme bromelain sau 12 ngày bảo quản Từ các kết quả đã thu thập và phân tích, có thể cho phép kết luận: nên sử dụng dung dịch dứa chứa enzyme bromelain quả sau 3 ngày bảo quản, lúc đó enzyme trong dịch quả có tính chất ổn định và hoạt tính tốt. Sử dụng phương pháp lạnh đông để bảo quản Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 23 mẫu chứa enzyme có thể giúp duy trì chất lượng mẫu và hoạt tính enzyme trong thời gian dài tốt hơn so với phương pháp bảo quản lạnh. 4.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH XÚC TÁC PHẢN ỨNG THỦY PHÂN CỦA ENZYME BROMELAIN QUẢ (TRONG DỊCH QUẢ DỨA) TRÊN CƠ CHẤT LÀ CASEIN Dung dịch dứa chứa enzyme bromelain quả được tiến hành xử lý ở các pH và nhiệt độ khác nhau, bố trí ngẫu nhiên 2 nhân tố. Sau đó, các mẫu được tiến hành phân tích hoạt tính enzyme trong dịch quả theo phương pháp Kunitz trên cơ chất là casein. Giá trị xác định được là nồng độ tyrosine sinh ra µmol/ml