Luận văn Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme papain trong đu đủ

• Không nên trộn nhựa tươi với nhựa khô vì như vậy sẽ làm giảm chất lượng papain thu được. • Quả có thể rút nhựa trong suốt khoảng thời gian 4 - 7 ngày. Lần đầu tiên có thể chỉ rạch một lần là đủ, ở những lần thu nhựa sau, rạch 2 - 3 đường giữa những đường rạch trước. • Khi tiến hành thao tác với nhựa tươi, tránh không cho nhựa tiếp xúc với da vì nó sẽ gây bỏng. Đồng thời cũng không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng, ... vì nó làm biến màu và làm giảm hoạt tính của enzyme, lọ, dao, muỗng,... phải được làm bằng nhựa hoặc thép không gỉ. • Nhựa tươi thu được sẽ không bền, vì thế phải sấy khô tới khoảng 5% độ ẩm. (Nguyễn Đức Lượng, 2004) 3.2.2 Phương pháp tinh chế papain bằng cồn Nhựa đu đủ sau khi thu được mang về phòng thí nghiệm để tiến hành quá trình tinh chế. Quá trình tinh chế papain bán tinh khiết sử dụng dung môi hữu cơ (cồn 90o làm lạnh) được thực hiện theo sơ đồ sau: Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 14 Hình 5: Quy trình trích ly và tinh chế papain bán tinh khiết 3.2.3 Phương pháp chuẩn bị casein 1% Cơ chất casein sử dụng trong tiến trình thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme được chuẩn bị theo các bước trong hình 6 dưới đây: Hình 6: Quy trình chuẩn bị dung dịch casein 1% Nhựa đu đủ Rửa cồn 900 2-3 lần Lọc hay ly tâm lạnh (3 – 50C) Hòa tan với nước cất Papain bán tinh khiết Sấy chân không (30 – 400C) Tủa lại bằng cồn 900 Dung dich đệm phosphate pH = 7,5 Bảo quản lạnh (40C) Đun cách thủy (85 – 900C, 1h) Casein Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 15 3.3 Bố trí thí nghiệm 3.3.1 Thí nghiệm trích ly papain và tinh chế papain Mục đích thí nghiệm: Thu được chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết có độ ẩm thấp. Tiến hành thí nghiệm Quá trình trích ly và tinh chế papain bán tinh khiết được tiến hành như miêu tả trên phần phương pháp trích ly. Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện lạnh 3-50C cho các bước ly tâm (4000 vòng/phút), chiết rửa bằng cồn. Hoạt tính của papain bị ảnh hưởng rất lớn ở giai đoạn này và ảnh hưởng đến thí nghiệm xác định hoạt tính xúc tác sau. Kết quả thí nghiệm Chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết thu được có dạng bột mịn khô, màu trắng và được bảo quản trong điều kiện lạnh đông ở -20oC. 3.3.2 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt tính của papain Mục đích thí nghiệm: Xác định được quy luật biến đổi hoạt tính của papain trong các điều kiện nhiệt độ xử lý và pH môi trường khác nhau trên cùng cơ chất là casein. Từ đó có thể xác định được điều kiện tối thích về pH và nhiệt độ cho hoạt động xúc tác của papain, ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. Tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện song song cho một mẫu phân tích và một mẫu đối chứng (papain được vô hoạt), ứng với một mức pH hay nhiệt độ, sẽ có sự kết hợp với tất cả các mức độ nhiệt độ hay pH còn lại. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với hai nhân tố là nhiệt độ và pH môi trường. Nhân tố A: nhiệt độ môi trường, được khảo sát ở 7 mức độ, từ 300C - 600C. A1: 300C A4: 450C A7: 600C A2: 350C A5: 500C A3: 400C A6: 550C Nhân tố B: pH môi trường, khảo sát ở 6 mức độ, khoảng 5,5 – 8,0. B1: pH = 5,5 B4: pH = 7,0 B2: pH = 6,0 B5: pH = 7,5 B3: pH = 6,5 B6: pH = 8,0 Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 16 Ứng với mỗi nghiệm thức, thí nghiệm được lặp lại ba lần. Vậy tổng số mẫu ta phải chuẩn bị: 7 x 6 x 3 = 126 mẫu. Ứng với mỗi mẫu thí nghiệm có một mẫu đối chứng (enzyme bị vô hoạt). Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau: B1 B2 B3 B4 B5 B6 A1 A1 B1 A1 B2 A1 B3 A1 B4 A1 B5 A1 B6 A2 A2 B1 A2 B2 A2 B3 A2 B4 A2 B5 A2 B6 A3 A3 B1 A3 B2 A3 B3 A3 B4 A3 B5 A3 B6 A4 A4 B1 A4 B2 A4 B3 A4 B4 A4 B5 A4 B6 A5 A5 B1 A5 B2 A5 B3 A5 B4 A5 B5 A5 B6 A6 A6 B1 A6 B2 A6 B3 A6 B4 A6 B5 A6 B6 A7 A7 B1 A7 B2 A7 B3 A7 B4 A7 B5 A7 B6 Kết quả thí nghiệm Xác định được sự tương tác của nhiệt độ xủ lý và pH môi trường đến hoạt tính xúc tác của enzyme papain trong nhựa đu đủ tươi, từ đó xác định được nhiệt độ và pH thích hợp để papain thể hiện hoạt tính cao nhất. Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 17 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Trích ly và tinh chế papain Quá trình thu nhận nhựa đu đủ tươi được tiến hành vào lúc sáng sớm và phải kết thúc vào giữa buổi sáng vì khi đó độ ẩm không khí khá cao, khi độ ẩm không khí thấp dòng nhựa dễ bị sánh lại, chảy chậm rất khó thu nhận. Nhựa thu được bằng cách rạch những đường dài dọc theo thân trái, khoảng cách giữa các đường 1-2 cm, sau đó hứng phần nhựa vào trong các lọ thủy tinh màu nhằm ngăn sáng rồi đậy nắp kín và bảo quản lạnh trong suốt quá trình mang về phòng thí nghiệm bằng nước đá. Thời gian thu nhựa và mang về phòng thí nghiệm nên hạn chế không dài quá để tránh ảnh hưởng đến chất lượng enzyme. Nguồn nhựa mang về phòng thí nghiệm được tủa bằng cồn 900 đã làm lạnh (nhằm hạn chế sự biến tính enzyme), giữ yên dung dịch để quá trình tủa xảy ra tốt hơn trong điều kiện lạnh khoảng 3-50C trong 1giờ. Sau đó tiến hành ly tâm nhiều lần bằng cồn lạnh ở 40C, tốc độ ly tâm khoảng 4000 vòng/phút. Ở lần ly tâm cuối, trước khi cho enzyme tủa với cồn thì tiến hành hòa tan với nước cất nhằm làm tan các thành phần không phải enzyme, sau đó mới tạo kết tủa lại bằng cồn. Phần kết tủa thu được sau khi ly tâm được sấy chân không ở nhiệt độ thấp khoảng 30-400C đến khi khô có thể nghiền thành dạng bột mịn (độ ẩm khoảng 5% là an toàn). Dạng bột mịn chính là chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết. Chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết này được bảo quản trong điều kiện lạnh đông khoảng -200C để sử dụng kiểm tra hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân casein. Hình 7: Chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 18 4.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết Chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết được xác định hoạt tính ở các pH và nhiệt độ khác nhau theo phương pháp Kunitz trên cơ chất casein. Ở đây, giá trị đo được trên máy quang phổ (độ hấp thụ OD) chính là nồng độ Tyrosine sinh ra (µmol) do quá trình thủy phân cơ chất casein bởi 1mg chế phẩm enzyme. Từ giá trị độ hấp thụ này, ta xác định hoạt tính của chế phẩm enzyme papain trong nhựa đu đủ theo đơn vị Tu/mg chế phẩm enzyme bán tinh khiết khô. Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme trên cơ chất casein được khảo sát theo hai nhân tố nhiệt độ (A) và pH (B) với 7 mức nhiệt độ từ 300C đến 600C, 6 mức pH từ 5,5 đến 8,0. A1: 300C A4: 450C A7: 600C A2: 350C A5: 500C A3: 400C A6: 550C B1: pH = 5,5 B4: pH = 7,0 B2: pH = 6,0 B5: pH = 7,5 B3: pH = 6,5 B6: pH = 8,0 Ứng với mỗi mẫu thí nghiệm có một mẫu đối chứng (enzyme bị vô hoạt). 4.2.1 Sự thay đổi hoạt tính xúc tác của enzyme papain bán tinh khiết theo nhiệt độ Có thể thấy rằng, nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính enzyme do có tác động trực tiếp đến cấu trúc không gian và hình thể tâm hoạt động của enzyme. Theo động học phản ứng enzyme, khi nhiệt độ tăng sẽ thúc đẩy vận tốc phản ứng. Vận tốc phản ứng đạt cực đại tương ứng với nhiệt độ tối thích cho enzyme hoạt động, nếu vượt quá ngưỡng nhiệt độ này tốc độ phản ứng bắt đầu giảm lại. Điều này được thể hiện tổng quát ở bảng 4, hoạt tính enzyme thay đổi theo các nhiệt độ khác nhau khi tương tác với các pH khảo sát. Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 19 Bảng 4: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme theo nhiệt độ (Kết quả thể hiện là hoạt tính xúc tác của enzyme theo đơn vị Tu/mg chế phẩm trên cơ chất casein. Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95%). Nhìn chung hoạt tính xúc tác của enzyme ở 550C là cao nhất và có khác biệt ý nghĩa 5% so với các nhiệt độ còn lại. Nhiệt độ cao ngoài khả năng tăng tốc độ phản ứng còn có thể làm biến tính một phần cơ chất, từ đó enzyme dễ dàng xúc tác hơn. (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004) Khi xem xét cụ thể, tương ứng với một pH nhất định, sự thay đổi hoạt tính enzyme theo nhiệt độ được thể hiện ở bảng 5 và đồ thị hình 8 dưới đây. Bảng 5: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme theo nhiệt độ ứng với từng pH (Kết quả thể hiện là hoạt tính xúc tác của enzyme theo đơn vị Tu/mg chế phẩm trên cơ chất casein. Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95% ). Nhiệt độ (oC) Hoạt tính (Tu/mg) 30 35 40 45 50 55 60 998,4a 1576b 1692b 1934c 2263d 2564e 2333d pH 0C 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 30 657,0a 723,4a 1745a 1195a 1099a 568,4a 35 1136b 1328b 2052b 1819b 1760b 1361b 40 1332c 1402b 2111b 1886c 1801bc 1624c 45 1601d 1937c 2528d 1937d 1875c 1723c 50 2041e 2107d 2487d 2554f 2605d 1782d 55 2151f 2336f 2369c 2635g 3015f 2875f 60 2037e 2222e 2343c 2354e 2808g 2236e Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 20 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 20 30 40 50 60 70 Nhiệt độ (oC) H o ạt tín h (Tu /m g) pH 5.5 pH 6.0 pH 6.5 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 20 30 40 50 60 70 Nhiệt độ (oC) H o at tin h (Tu /m g) pH 7.0 pH 7.5 pH 8.0 Hình 8: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết các nhiệt độ khác nhau Đồ thị trên thể hiện, ở các pH 5,5; 6,0; 7,0; 7,5; 8,0 hoạt tính enzyme tăng dần từ 300C đến cực đại ở 550C rồi giảm dần ở 600C, điều này có thể giải thích được dựa vào động học chung của enzyme, khi nhiệt độ tăng dần thì vận tốc phản ứng thủy phân cũng tăng theo, đến nhiệt độ tối thích là 550C. Cụ thể như ở mức pH 7,5 hoạt tính xúc tác của enzyme tăng dần theo nhiệt độ như sau: 1099 Tu/mg (ứng với 300C) đến 1760 Tu/mg (ứng với 350C) và khoảng từ 350C, 400C, 450C chênh lệch hoạt tính không cao lần lượt 1801 Tu/mg (400C); 1875 Tu/mg (450C) nhưng khi xử lý ở 500C hoạt tính của enzyme tăng hơn gấp đôi so với 300C (2605 Tu/mg) và gần gấp 3 lần khi xử lý ở 550C 3015 Tu/mg. Giống như tính chất của đa số các enzyme khác, mang bản chất là protein nên papain cũng bị giảm hoạt tính từ 600C do cấu trúc protein bắt đầu bị ảnh hưởng, cụ thể từ 3015 Tu/mg ở 550C còn 2808 Tu/mg ở 600C. Tuy nhiên, theo lý thuyết, papain có thể chịu nhiệt khá cao, ở dạng dung dịch khi nhiệt độ lên đến 82,50C bắt đầu bất hoạt do cấu trúc tâm hoạt động bị phá vỡ. Tuy nhiên ở pH 6,5 thì nhiệt độ tối thích để enzyme hoạt động lại là 450C, điều này là hợp lý vì theo đồ thị hình 9 dưới đây, biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme, thì pH tối thích cho enzyme hoạt động ở 300C, 350C, 400C, 450C lại là 6,5. Ở pH 6,5 hoạt tính của papain tăng khá nhanh từ 300C đến 450C, đặc biệt là khoảng 40-450C, cụ thể hoạt tính enzyme đạt 1745 Tu/mg (ở 300C) tăng đến 2052 Tu/mg (ở 350C); 2111 Tu/mg (ở 400C) rồi tăng nhanh đến 450C là 2528 Tu/mg. Từ 450C hoạt tính enzyme bắt đầu giảm nhưng chênh lệch giữa các nhiệt độ không cao 2487 Tu/mg (ở 500C); 2369 Tu/mg (ở 550C); 2343 Tu/mg (ở 600C). 4.2.2 Sự thay đổi hoạt tính xúc tác của enzyme papain bán tinh khiết theo pH Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme được giải thích dựa vào trạng thái ion hóa của enzyme và cơ chất, khi pH thay đổi thì đồng thời trạng thái ion hóa của enzyme và cơ chất cũng thay đổi, làm quá trình hình thành phức hợp enzyme-cơ chất [ES] bị ảnh hưởng dẫn đến việc thay đổi vận tốc phản ứng. Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 21 Bảng 6: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme theo pH (Kết quả thể hiện là hoạt tính xúc tác của enzyme theo đơn vị Tu/mg chế phẩm trên cơ chất casein. Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95% ). Nhìn chung hoạt tính xúc tác của enzyme thể hiện cao nhất ở pH 6,5 và không khác biệt ý nghĩa 5% so với pH 7,5, có khác biệt ý nghĩa 5% so với các pH còn lại. Khi xem xét tương ứng với một nhiệt độ nhất định, sự thay đổi hoạt tính enzyme theo các mức pH khác nhau được thể hiện ở bảng 7 và đồ thị hình 9 dưới đây. Bảng 7: Sự thay đổi hoạt tính của enzyme theo pH ứng với từng nhiệt độ (Kết quả thể hiện là hoạt tính xúc tác của enzyme theo đơn vị Tu/mg chế phẩm trên cơ chất casein. Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95% ). pH Hoạt tính (Tu/mg) 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 1565a 1722b 2234d 2054c 2138cd 1739b 0C pH 30 35 40 45 50 55 60 5,5 657,0b 1136a 1332a 1601a 2041b 2151a 2037a 6,0 723,4b 1328b 1402b 1937d 2107b 2336b 2222b 6,5 1745e 2052d 2111f 2528e 2487c 2369b 2343c 7,0 1195d 1819c 1886e 1937d 2554d 2635c 2354c 7,5 1099c 1760c 1801d 1875c 2605d 3015e 2808d 8,0 568,4a 1361b 1624c 1782b 1780a 2875d 2236b Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 22 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4 5 6 7 8 9 10pH H o ạt tín h (Tu /m g) 30oC35oC 40oC 45oC 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4 5 6 7 8 9 10pH H o ạt tín h (Tu /m g) 50oC 55oC 60oC Hình 9: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết ở các pH khác nhau Từ đồ thị trên, tương ứng với các nhiệt độ xử lý 300C, 350C, 400C, 450C enzyme thể hiện hoạt tính xúc tác cao nhất ở pH 6,5. Có thể thấy hoạt tính xúc tác của enzyme tăng rất nhanh trong khoảng pH từ 6,0 đến 6,5 rồi giảm mạnh trong khoảng 6,5 đến 7,0; cụ thể là hoạt tính enzyme ở nhiệt độ xử lý 300C chỉ có giá trị 657 Tu/mg (ứng với pH 5,5), 723 Tu/mg (ứng với pH 6,0) nhưng lại tăng gần gấp đôi 1745 Tu/mg (ứng với pH 6,5) sau đó lại giảm xuống 1195 Tu/mg (ứng với pH 7,0). Kết quả tương tự khi xử lý ở các mức nhiệt độ còn lại (350C, 400C, 450C). Hoạt tính xúc tác của enzyme ở 450C đều cao hơn so với các nhiệt độ còn lại ở cùng giá trị pH. Tuy nhiên ở các nhiệt độ xử lý 500C, 550C, 600C thì enzyme lại thể hiện hoạt tính xúc tác cao nhất ở pH 7,5. Điều này có thể giải thích do pH môi trường thay đổi làm liên kết hydro trong cấu trúc không gian và cấu hình tâm hoạt động của enzyme, lực ion môi trường thay đổi nên, kết quả là giá trị pH tối thích cho enzyme hoạt động cũng bị thay đổi. Nhưng sự chênh lệch hoạt tính xúc tác của enzyme giữa các pH khác nhau ở cùng nhiệt độ không cao như ở các khoảng nhiệt độ xử lý đầu. Cụ thể là hoạt tính enzyme ở nhiệt độ xử lý 550C có giá trị 2336 Tu/mg (ứng với pH 6,0); 2369 Tu/mg (ứng với pH 6,5) và tăng đến 3015 Tu/mg (ứng với pH 7,5) sau đó lại giảm xuống 2875 Tu/mg (ứng với pH 8,0). Kết quả tương tự khi xử lý ở các nhiệt độ còn lại (500C, 600C) và hoạt tính xúc tác của enzyme ở 550C cũng đều cao hơn so với các nhiệt độ còn lại ở cùng giá trị pH. Nhưng khi so sánh hoạt tính enzyme ở hai khoảng nhiệt độ tương ứng với hai pH tối thích khác nhau (300C, 350C, 400C, 450C - pH tối thích 6,5) và (500C, 550C, 600C - pH tối thích 7,5) thì hoạt tính enzyme ở 550C; pH 7,5 cao hơn khi xử lý ở 450C; pH 6,5. Ngoài ra, từ kết quả thí nghiệm có thể nhận định rằng enzyme papain thể hiện hoạt tính xúc tác tốt hơn ở môi trường kiềm yếu hơn là acid yếu, điều này có lẽ là do cấu trúc không gian và cấu hình tâm hoạt đông của enzyme, sự sắp xếp các liên kết Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 23 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 20 30 40 50 60 70 Nhiệt độ (oC) Ho ạ t t ín h (T u /m g) pH 5.5 pH 8.0 trong phân tử và các nhóm chức bền hơn với môi trường kiềm yếu, điều này được thể hiện ở đồ thị 10, sự biến thiên hoạt tính enzyme tương ứng với hai pH thấp nhất 5,5 và pH cao nhất 8,0. Về mặt lý thuyết, papain sẽ bị biến tính khi môi trường acid mạnh (pH 12). Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết ở điều kiện pH 5,5 và 8,0 Từ đồ thị trên, ta nhận thấy ở điều kiện nhiệt độ mà enzyme chưa bị biến tính, khi được xử lý ở nhiệt độ càng cao hoạt tính của enzyme thể hiện càng tốt. Mức nhiệt độ 550C là nhiệt độ tốt nhất để xử lý cho cả hai môi trường kiềm yếu và acid yếu. 4.2.2 Ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết Cả hai yếu tố nhiệt độ và pH đều ảnh hưởng tương tác có ý nghĩa lên hoạt tính xúc tác của enzyme papain. Vì thế khi giá trị hoạt tính của enzyme khi xét đồng thời cho cả hai nhân tố này có thể sai khác khi xem xét ảnh hưởng của từng nhân tố riêng biệt. Tùy theo pH môi trường mà enzyme sẽ có nhiệt độ hoạt động tối thích tương ứng khác nhau và ngược lại. Khả năng xúc tác của enzyme được thể hiện ở bảng 8 và đồ thị hình 11, giá trị hoạt tính của enzyme (Tu/mg) thay đổi theo từng cặp nhân tố (nhiệt độ và pH) khác nhau. Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 24 Bảng 8: Hoạt tính enzyme ở các mẫu xử lý nhiệt độ và pH khác nhau (Kết quả thể hiện là hoạt tính xúc tác của enzyme theo đơn vị Tu/mg chế phẩm trên cơ chất casein. Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95% ). Mẫu Hoạt tính (Tu/mg) A1B6 A1B4 A1B2 A1B5 A2B1 A1B4 A2B2 A3B1 A2B6 A3B2 A4B1 A3B6 A4B6 A1B3 A2B5 A5B6 A3B5 A2B4 A4B5 A3B4 A4B2 A4B4 A7B1 A5B1 A2B3 A5B2 A3B3 A6B1 A7B2 A7B6 A6B2 A7B3 A7B4 A6B3 A5B3 A4B3 A5B4 A5B5 A6B4 A7B5 A6B6 A6B5 568,4a 657,0b 723,4b 1099c 1136cd 1195d 1328e 1332e 1361ef 1402f 1601g 1624g 1723h 1745hi 1760hij 1782hij 1801ij 1819jk 1875kl 1886kl 1937l 1937l 2037m 2041mn 2052mno 2107nop 2111op 2151p 2222q 2236q 2336r 2343r 2354r 2369r 2487s 2528s 2554st 2605tu 2635u 2808v 2875v 3015x Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 25 Nhiet do pH H o a t t in h (T u /m g) 30 35 40 45 50 55 60 5.5 6 6.5 7 7.58 700 1100 1500 1900 2300 2700 Hình 11: Đồ thị không gian biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của nhiệt độ xử lý và pH lên hoạt tính của chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết trong nhựa đu đủ xanh Đồ thị hình 11 cho thấy có sự tương tác qua lại giữa nhiệt độ và pH ở các mức độ xử lý khác nhau (với mức độ tin cậy 95% về mặt thống kê) lên hoạt tính xúc tác của chế phẩm papain bán tinh khiết. Khi tương ứng với mỗi khoảng nhiệt độ, enzyme này sẽ có khoảng pH hoạt động và giá trị pH tối thích khác nhau. Tổng quát về hoạt tính xúc tác của enzyme papain, theo kết quả thí nghiệm, papain thể hiện hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân casein cao nhất ở khoảng nhiệt độ 50 - 60oC ứng với khoảng pH môi trường tối thích 6,5 - 7,5. Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 26 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Khi tiến hành nghiên cứu đề tài này, để có kết quả khảo sát phù hợp với thực tế phải tiến hành thu nhận nguồn nhựa từ cùng một cây đu đủ và quả có độ tuổi thích hợp (10 tuần tuổi). Từ các kết quả thu được trong quá trình khảo sát, có những nhận định sau: • Chế phẩm enzyme bán tinh khiết papain sau khi trích ly phải được sấy khô đến độ ẩm an toàn (5%), nghiền mịn và bảo quản lạnh đông ở -200C để duy trì hoạt tính xúc tác. Không sử dụng lâu nguồn chế phẩm enzyme này (không quá hai tuần) vì sẽ bị giảm hoạt tính do sự tự phân hay oxy hóa. • Có sự tương tác qua lại của nhiệt độ và pH môi trường xử lý lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất casein của enzyme papain trong nhựa đu đủ tươi. Papain hoạt động tốt nhất ở pH môi trường 6,5 nếu phản ứng thủy phân xảy ra ở 300C, 350C, 400C, 450C; hoạt động tốt nhất ở pH môi trường 7,5 nếu nếu phản ứng thủy phân ở 500C, 550C, 600C. • Papain hoạt động tốt nhất ở 550C nếu pH môi trường là 5,5; 6,0; 7,0; 7,5; 8,0 và ở 450C nếu pH môi trường 6,5. • Hoạt tính cả enzyme thể hiện cao nhất ở mức độ tương tác khoảng nhiệt độ xử lý 50 - 600C và pH môi trường 6,5 - 7,5. 5.2 Đề nghị Do thời gian tiến hành nghiên cứu hạn chế nên không thể khảo sát đầy đủ những tác nhân ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của chế phẩm papain bán tinh khiết này. Những nghiên cứu có thể tiếp tục để hoàn thiện đề tài được đề nghị như sau: • Nghiên cứu ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của papain với nhiều loại cơ chất khác nhau (casein, BSA, prrotein trứng,…); • Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính xúc tác của papain; Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Đặng Thị Thu, (2004), Công nghệ Enzyme, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Lâm Xuân Thanh, (2003), Công nghệ chế biến sữa và các sản phẩm sữa, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Nguyễn Đức Lượng & Cao Cường, (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học. NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lượng & Phan Thị Huyền, (2003), Thí nghiệm vi sinh vật học. NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lượng, (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. Phạm Thị Trân Châu, (2006), Enzyme và ứng dụng, NXB Giáo Dục. Gerald Reed, (1966), Enzyme in food processing: Academic Press, Inc Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang v PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Hoạt tính xúc tác của chế phẩm enzyme papain được xác định theo phương pháp Kunitz. (Nguồn: Kunitz, (1947), citied by Fernandez et al., 2003) Nguyên tắc đo hoạt tính Phương pháp đo hoạt tính enzyme dựa vào độ hấp thụ của acid amin (chủ yếu là Tyrosine) ở bước sóng cực tím 280 nm, sản phẩm của phản ứng thủy phân cơ chất casein bởi papain. Đối tượng thực hiện thí nghiệm: Chế phẩm enzyme papain bán tinh khiết thu từ nhựa đu đủ xanh và cơ chất casein. Phản ứng thủy phân được thực hiện trong 20 phút, sau đó được dừng lại bằng Acid tricloacetic (TCA). Nồng độ sản phẩm sinh ra được xác định dựa vào độ hấp thụ của Tyrosine ở 280 nm theo một đồ thị đường chuẩn. Đơn vị đo hoạt tính của papain: Hoạt tính của papain được thể hiện bằng đơn vị Tyrosine (Tu: Tyrosine unit) với 1Tu là lượng sản phẩm sinh ra tương ứng với số µmol Tyrosine do sự thủy phân casein bởi enzyme có trong 1mg chế phẩm khô trong thời gian 1 phút ở điều kiện nhiệt độ và pH môi trường nhất định. Tiến hành thí nghiệm  Chuẩn bị hóa chất • Dung dich đệm Disodium hydro phosphate (Na2HPO4.12H2O), sodium dihydro phosphate (NaH2PO4.2H2O) có bổ sung EDTA 5mM ở các mức pH khác nhau. • Chất hoạt hóa cho enzyme Cystein 0,02M • Casein 1%: Hòa tan 1 g casein dạng bột với 100 ml dung dịch đệm phosphat 0,05M ở pH 7,5 có bổ sung EDTA 5mM. Tiến hành đun cách thủy dung dịch ở nhiệt độ 90 – 95oC trong 1,5 giờ đến khi hòa tan hoàn toàn casein. Bảo quản dung dịch thu được ở 4oC. Trước khi sử dụng thí nghiệm thuuyr phân dung dịch casein này phải được ủ ở 37oC khoảng 30 phút. • Dung dịch Acid triacetic (TCA) 5%: cân 5g TCA dạng tinh thể hòa tan với nước cất trong một cốc, sau đó thêm nước cất vào cho đủ 100 ml bằng bình định mức.  Các bước thực hiện thí nghiệm Luận văn Tốt nghiệp K29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang vi Tiến hành thí nghiệm song song hai mẫu trong đó có một mẫu đối chứng. Các bước thực hiện theo sơ đồ hình 12, mẫu đối chứng tiến hành tương tự nhưng cho dung dịch TCA vào trước (nhằm vô hoạt enzyme), casein vào sau. Mẫu phân tích Mẫu đối chứng Hình 12. Quy trình thí nghiệm xác định hoạt tính của papain Tính toán kết quả Ta xác định được đơn vị hoạt tính của enzyme trong 1 mg chế phẩm theo công thức: k VT VxTu E hh *) * 1000**(= Trong đó: Tu: hoạt tính của enzyme (Tu/ml) x: nồng độ Tyrosine (µmol/ml) Vhh: thể tích tổng dung dịch phản ứng (ml)