Luận văn Đánh giá tính khả dụng của vắc xin bạch hầu đông khô rd6 dự tuyển mẫu chuẩn quốc gia

hó khăn về kinh tế, xã hội là điều kiện tốt cho các bệnh nhiễm trùng trong đó có bệnh bạch hầu. Vậy nên trong chiến tranh bạch hầu là bệnh nhiễm trùng phổ biến nhất[15]. Theo thông báo của nhiều nƣớc, tỷ lệ mắc bạch hầu liên quan chặt chẽ với việc tiêm vắc xin bạch hầu. Ở Anh và Wales, từ năm 1915-1942, số lƣợng bệnh nhân bạch hầu hàng năm là 50.000 và số chết khoảng 4000 ngƣời vào những năm đầu và 2500 ở những năm cuối. Sau đó ngƣời ta thực hiện tiêm chủng toàn dân. Năm 1950, số lƣợng mắc bạch hầu giảm xuống 962 và tử vong khoảng 49 trƣờng hợp; đến năm 1965, số mắc là 25 và không có tử vong. Đại chiến thế giới thứ 2 đã cản trở việc tiêm phòng, dẫn đến khoảng 3 triệu ngƣời bị bệnh bạch hầu ở châu Âu trong thời gian này[5, 25]. Một sự kiện đáng lƣu ý là do những biến động xã hội ở một số nƣớc nhƣ Nga, Ucrainađã làm gián đoạn việc tiêm chủng vắc xin bạch hầu cho trẻ em trong những năm 80 của thế kỷ trƣớc. Do đó bệnh bạch hầu đã phát triển và bùng nổ thành dịch lớn ở những nƣớc này trong những năm đó. Ví dụ năm 1994, ỏ Nga đã có hơn 39.000 ngƣời mắc bệnh bạch hầu với 1.100 ngƣời chết và ở Ucraina có hơn 3000 ngƣời mắc. Tuổi mắc bệnh là trên 15 tuổi[12, 26]. Ở khu vực Tây Thái Bình Dƣơng, hiện nay số mắc bệnh bạch hầu hàng năm đã giảm rõ rệt do hiệu quả của việc tiêm phòng vắc xin bạch hầu cho trẻ em đƣợc thực hiện có kết quả ở các nƣớc trong khu vực. Những năm đầu thập kỷ 80 của thế kỷ trƣớc, hàng năm ở đây có trên 13.000 trƣờng hợp bạch hầu, đến năm 1990 giảm xuống còn 1130 trƣờng hợp và năm 1994 chỉ còn 614 trƣờng hợp[28]. Ở Việt Nam, thời kỳ chƣa thực hiện tiêm vắc xin bạch hầu trong chƣơng trình tiêm chủng mở rộng thì bệnh bạch hầu thƣờng xảy ra và gây dịch ở hầu hết các tỉnh, đặc biệt là ở các thành phố có mật độ dân cƣ cao. Bệnh xuất hiện nhiều 7 vào các tháng 8, 9, 10 trong năm. Do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ mắc bạch hầu ở Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống 0,14/100.000 dân năm 2000 và 0,009/100.000 dân năm 2009. So với tỷ lệ mắc bệnh 0,14/100.000 dân của ho gà, 6,2/100.000 dân của bệnh sởi (năm 2009), có thể thấy hiệu quả phòng bệnh bạch hầu do tiêm vắc xin này khá cao[4]. Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, tất cả các nƣớc nên ƣu tiên tiêm phòng cho trẻ dƣới một tuổi đủ 3 liều vắc xin DTP, đạt ít nhất 90% và tiêm nhắc lại để có miễn dịch lâu dài. Lịch tiêm phòng đƣợc xem xét cụ thể ở từng nƣớc, tùy theo tình hình dịch tễ bệnh. 1.2 VẮC XIN BẠCH HẦU Vắc xin bạch hầu là vắc xin giải độc tố. Loại vắc xin này đƣợc sản xuất từ ngoại độc tố của vi khuẩn đã đƣợc làm mất tính độc nhƣng vẫn giữ đƣợc tính kháng nguyên. Vắc xin giải độc tố kích thích cơ thể sản xuất ra kháng độc tố, loại kháng thể có khả năng trung hòa ngoại độc tố. Vắc xin này nhằm phòng chống các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây bệnh chủ yếu bằng ngoại độc tố. Năm 1923, Ramon nhận thấy độc tố bạch hầu khi xử lý bằng formalin thì sẽ mất độc tính nhƣng vẫn giữ đƣợc tính kháng nguyên, có khả năng tạo kháng thể chống lại bệnh, từ đó vắc xin bạch hầu ra đời. Với những tiến bộ của miễn dịch học và các ngành khoa học khác, việc sản xuất vắc xin bạch hầu đã đƣợc cải tiến qua nhiều giai đoạn và tập trung vào các vấn đề sau: 1. Thay đổi phương pháp sản xuất: Từ thủ công (nuôi cấy tĩnh) sang nuôi cấy theo quy trình công nghệ sinh học (nuôi cấy chìm trong nồi lên men). 2. Thay đổi các phương pháp giải độc: Dùng hóa chất nhƣ ICl3, formalin hoặc các biện pháp chọn chủng giống đột biến để thu thẳng giải độc tố. 3. Cải tiến khâu tinh chế: Cô đặc bằng phƣơng pháp thủ công đến phƣơng pháp hiện đại với hệ thống siêu lọc. Ngày nay hệ thống lọc tách nhƣ Metafilter, TFF đƣợc dùng rộng rãi trong sản xuất các vắc xin vi khuẩn. 8 4. Phối hợp tá dược: Giải độc tố ban đầu dùng gel hấp phụ để tăng và kéo dài hoạt tính miễn dịch. Thƣờng dùng gel của nhôm hydroxyd Al(OH)3 hoặc Al(PO) 4 để hấp phụ. Hoặc dùng các oligonucleotid chứa CpG demetyl hóa đƣa vào vắc xin khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo hƣớng dịch thể (tạo kháng thể) thay vì tế bào. 5. Phối hợp kháng nguyên: Phối hợp thành vắc xin đa giá để có hiệu quả kinh tế, tăng hiệu quả từng thành phần trong kháng nguyên và giảm bớt số mũi tiêm chủng hoặc làm giảm bớt số lần tổ chức tiêm chủng. Các vắc xin bạch hầu phối hợp 3 thành phần (Bạch hầu- Ho gà- Uốn ván), 4 thành phần (Bạch hầu- ho gà vô bào- Uốn ván- Bại liệt), 5 thành phần (Bạch hầu- ho gà vô bào- Uốn ván- Bại liệt-Viêm gan B), 6 thành phần (Bạch hầu- ho gà vô bào- Uốn ván- Bại liệt-Viêm gan B- Hib) đã ra đời[2, 36]. Ở Việt Nam, vắc xin bạch hầu đƣợc nghiên cứu sản xuất từ những năm 60 tại Viện Vệ sinh dịch tễ Hà Nội bằng phƣơng pháp nuôi cấy tĩnh, phối hợp với thành phần uốn ván để tạo vắc xin nhị liên DT (Bạch hầu- Uốn ván). Năm 1986, Viện Vắc xin (IVAC) chính thức sản xuất phối hợp DTP tinh chế cô đặc và hấp phụ bằng AlPO4 theo tiêu chuẩn WHO. Vắc xin này đã đƣợc dùng trong chƣơng trình tiêm chủng mở rộng Quốc gia nên tỷ lệ mắc bệnh bạch hầu ở Việt Nam đã giảm từ 1187 trƣờng hợp (năm 1984) xuống còn 188 trƣờng hợp (năm 1991). Hiện nay IVAC vẫn đang tiếp tục sản xuất vắc xin này và đang có dự án với Cuba để sản xuất vắc xin phối hợp 5 thành phần (Bạch hầu- Ho gà - Uốn ván- Bại liệt-Hib)[2, 24]. Ở Việt Nam, vắc xin DTP nằm trong chƣơng trình tiêm chủng mở rộng và tiêm ba mũi cho trẻ em với phác đồ 3, 4, 5 tháng tuổi. Mũi thứ tƣ tiêm nhắc lại sau mũi thứ ba là một năm. Theo khuyến cáo của tổ chƣ́c y tế thế giới WHO TRS No .980 và Dƣợc điển Viêṭ Nam IV, vắc xin bac̣h hầu trƣớc khi sƣ̉ duṇg phải đƣơc̣ kiểm tra các tiêu chuẩn nhƣ: Cảm quan, nhâṇ daṇg thành ph ần bạch hầu, công hiêụ bạch hầu, tính chất vật lý, an toàn chung , an toàn đăc̣ hiêụ bac̣h hầu , vô khuẩn và m ột số chỉ tiêu lý hóa khác[4, 28]. 9 1.3 MẪU CHUẨN Đối với mẫu chuẩn WHO có những khuyến cáo sau: 1.3.1 Về thuật ngữ Chuẩn quốc ( IS): Mẫu chuẩn quốc tế (International biological measurement standards, WHO International Standards, IS) là chế phẩm sinh học đƣợc cung cấp để đảm bảo kết quả của các thử nghiệm sinh học hoặc miễn dịch học đƣợc biểu thị theo cùng một cách trên toàn thế giới. Giá trị đƣa ra bởi WHO theo đơn vị quốc tế (IU) hoặc đơn vị phù hợp khác. ISS đƣợc coi là mẫu chuẩn gốc cao nhất (primary) để chuẩn định mẫu chuẩn quốc gia/mẫu chuẩn thứ cấp khác [35]. Chuẩn chính (Reference standards): Là những chất đƣợc sử dụng nhƣ thƣớc đo trong các thử nghiệm. Nó cung cấp một đơn vị cơ sở hằng định cho việc xác định công hiệu hoặc định lƣợng [35]. Chuẩn chính thứ cấp (Secondary reference standards): Là những chất chuẩn chính đƣợc xây dựng bởi một khu vực hoặc một quốc gia hoặc bởi các tổ chức khác. Chuẩn này đƣợc xác định dựa vào việc nối tới chuẩn ban đầu của WHO. Những chất chuẩn này đƣợc sử dụng trong những thử nghiệm kiểm tra công hiệu hoặc định lƣợng thƣờng quy [35]. 1.3.2 Về phƣơng pháp điều chế Trong sản xuất mẫu chuẩn yếu tố quan trọng hàng đầu là tính đồng nhất ổn định và sự tƣơng đồng về thành phần với mẫu để thử nghiệm. Mẫu chuẩn có thành phần càng tƣơng đồng với mẫu thử thì độ chính xác càng cao. Merthiolate là chất thƣờng đƣợc sử dụng làm chất bảo quản vì nó không ảnh hƣởng đến chế phẩm hoặc không bị thăng hoa khi làm khô chế phẩm. Những tá dƣợc khác lựa chọn theo tiêu chí không làm giảm và không ảnh hƣởng đến hoạt tính cũng nhƣ độ ổn định của sản phẩm. Quá trình đông khô: Mẫu chuẩn có thể đƣợc sản xuất dƣới dạng lỏng hoặc đông khô. Mẫu dạng đông khô cho thấy độ ổn định và tuổi thọ cao hơn rất nhiều so với dạng nƣớc, thông thƣờng khoảng hơn 10 năm trong khi dạng nƣớc chỉ tính theo tháng hoặc 10 vài năm. Dạng đông khô dễ vận chuyển hơn dạng nƣớc do yêu cầu về dây truyền lạnh đơn giản hơn. Chính vậy hiện nay các nhà sản xuất đều ƣu tiên sản xuất mẫu chuẩn ở dạng đông khô. Nguyên lý: Sự thăng hoa phần nƣớc ở trạng thái rắn sang hơi hầu nhƣ không gây hại cho sự sống cũng nhƣ các hệ thống enzym và tế bào khi quá trình xảy ra nhanh ở nhiệt độ thấp và chân không. Tá dƣợc có tác dụng nhũ hóa và đông lạnh không làm vỡ tế bào đồng thời ở điều kiện chân không đã loại gần hết oxy nên chủng giống hoặc tế bào vi sinh vật không bị biến tính trong thời gian dài bảo quản sau đó. Cơ chế: Lạnh đông. Giai đoạn làm đông là cho phản ứng hóa học bị ức chế không xảy ra, đồng thời làm ngƣng hẳn các hoạt động xúc tác của enzyme. Kỹ thuật làm đông không chỉ tạo thể rắn cho sinh phẩm mà quan trọng hơn là hình thành một trạng thái kết tinh tối ƣu có thể tránh đƣợc sự hủy hoại sinh phẩm trong giai đoạn chuyển từ trạng thái lỏng sang trạng thái rắn. Khi các tinh thể nƣớc đƣợc tạo nên sẽ loại các phân tử khác (NaCl, đƣờng, protein) và lớn dần lên cho tới khi đông cứng toàn bộ. Thời điểm đó là điểm đông băng. Bằng máy hút chân không tinh thể sẽ chuyển sang dạng hơi thoát ra ngoài đọng lại trong khoang condenser. Đốt nóng ở 300C ở áp lực chân không trong ít nhất 1 giờ. Sản phẩm sau đông khô dễ hút ẩm và hấp thụ oxy trở lại do đó cần hút chân không hoặc dùng khí trơ lấp đầy khoang ống và hàn kín. Hàn và đóng ống Sản phẩm sau khi đông khô xong đƣợc nạp bằng khí trơ (nitơ) vô khuẩn vào ống. Hàn sản phẩm dƣới ngọn đèn gas có nhiệt độ cao. Quá trình đóng ống phải đảm bảo tính đồng nhất của mẫu do vậy các ống nên đƣợc đóng từ một lọ đồng nhất và trong điều kiện thao tác nhƣ nhau. Nhiệt độ và tốc độ khuấy trong khi đóng ống phải ổn định.Tránh nhiễm vi sinh vật, hóa chất hoặc các tiểu phân trong không khí. Do đó, quá trình này phải đƣợc thực hiện trong phòng vô trùng. Có thể sử dụng dạng ống hoặc lọ thủy tinh có nút cao su và hàn kín 11 bên ngoài bằng nắp nhôm để sản xuất mẫu chuẩn . Hiện nay các đơn vị thƣờng dùng dạng ống để sản xuất do độ hàn kín của ống tốt hơn giúp cho viêc bảo quản sản phẩm đƣợc lâu hơn. Tuy nhiên, khi chọn dạng ống cần lƣu ý hình dạng, kích thƣớc ống sao cho dễ bảo quản, dễ mở, dễ lấy hết sản phẩm [2, 21, 27]. Dán nhãn: Nhãn ghi đầy đủ các thông tin sau:  Tên đơn vị sản xuất: Nếu là mẫu chuẩn Quốc tế thì sẽ là WHO.  Tên mẫu chuẩn.  Năm thiết lập.  Mã số.  Số đơn vị Quốc tế  Điều kiện bảo quản.  Tên và địa chỉ nơi cấp phát. Phải ghi “Không được dùng cho người”. Ví dụ, nhãn của vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế nhƣ sau: Hình 1.4: Nhãn của vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ tƣ. 1.3.3 Tiêu chuẩn chất lƣợng Mẫu chuẩn cần đạt đƣợc các yêu cầu về tính đồng nhất, tính đặc trƣng và tính ổn định. Đồng nhất là sự giống nhau giữa các ống mẫu chuẩn. Tính đồng nhất cao cho thấy quy trình sản xuất ổn định, chất lƣợng giữa các ống mẫu nhƣ nhau làm Tên đơn vị sản xuất Mã số Số đơn vị Quốc tế Điều kiện bảo quản Năm thiết lập xuNămất Tên mẫu chuẩn 12 giảm thiểu sai số khi làm thử nghiệm đồng thời các mẫu lấy để kiểm tra cũng có tính đại diện tốt, phản ánh đƣợc chất lƣợng của cả lô vắc xin. Với vắc xin đông khô, tính đồng nhất thể hiện ở hai chỉ tiêu: độ đồng đều về trọng lƣợng khô và công hiệu.Trọng lƣợng khô thể hiện sự phân liều có đồng đều hay không. Công hiệu thể hiện quá trình pha vắc xin lỏng có đồng đều hay không. Tính đặc trƣng cho thấyloại thử nghiệm mà mẫu chuẩn đƣợc sử dụng, từ đó cho thấy các đặc tính cần quan tâm của mẫu chuẩn. Ví dụ: Mẫu chuẩn cho thử nghiệm công hiệu thì đặc tính cần quan tâm hàng đầu là giá trị công hiệu. Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia Bạch hầu đƣợc sử dụng trong kiểm định công hiệu của thành phần bạch hầu nên kiểm tra tính đặc trƣng của mẫu chuẩn chính là kiểm tra chỉ tiêu công hiệu [32, 35]. Tính ổn định: Vắc xin mẫu chuẩn là thƣớc đo cho vắc xin mẫu thử nên phải ổn định trong một khoảng thời gian nhất định (tối thiểu là 5 năm). Để vắc xin đƣợc ổn định, sản phẩm phải đạt yêu cầu về độ ẩm tồn dƣ, cảm quan, vô khuẩn và độ chân không.Sự ổn định công hiệu của vắc xin cũng cần đƣợc kiểm tra trong quá trình sử dụng. Đáp ứng các tiêu chí trên cần kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan, độ đồng đều khối lƣợng, nhận dạng, vô khuẩn, độ ẩm tồn dƣ, độ chân không và công hiệu. Trong đó: Công hiệu (potency):Công hiệu là thử nghiệm đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc xin. Công hiệu đƣợc thể hiện bằng đơn vị miễn dịch hay hàm lƣợng các chất tạo miễn dịch trong một đơn vị đo lƣờng. Công hiệu cần đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp phù hợp. Nên sử dụng các phƣơng pháp đã đƣợc khuyến cáo bởi WHO hoặc các Dƣợc điển. Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia cần đƣợc nối với chuẩn quốc tế của WHO (chuẩn gốc cao nhất) [8],[10]. Phƣơng pháp xác định giống nhƣ phƣơng pháp sử dụng cho mẫu chuẩn Quốc tế. Trong trƣờng hợp sử dụng phƣơng pháp khác cần có sự chuyển đổi đơn vị phù hợp. Độ chân không, cảm quan:Đây là chỉ tiêu quan trọng cần đƣợc kiểm tra vì bất kỳ sự nứt, vỡ dù rất nhỏ của ống đông khô sẽ khiến độ ẩm tồn dƣ trong ống tăng lên. 13 Độ ẩm tồn dư: Với mẫu chuẩn đông khô, độ ẩm tồn dƣ đƣợc coi là thông số then chốt bậc nhất giúp cho sản phẩm ổn định lâu dài, đặc biệt là với vắc xin bạch hầu. Vắc xin bạch hầu sản xuất từ giải độc tố bạch hầu (một loại protein). Phản ứng giáng hóa protein xảy ra với xúc tác là nƣớc. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự kết tụ và những phản ứng có hại khác đối với protein có liên quan đến hàm lƣợng nƣớc tồn dƣ cao trong ống. Tiêu chuẩn cho chỉ tiêu này đối với vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia là dƣới 3% [17, 22]. Tính vô khuẩn: sản phẩm không bị nhiễm vi sinh vật sẽ có tính ổn định lâu dài. Tính ổn định:Công hiệu cần đƣợc kiểm tra nhiều lần, ở nhiều thời điểm và nhiệt độ bảo quản khác nhau. Qua đó ƣớc tính đƣợc thời gian sử dụng của sản phẩm, lƣu trữ và phân phối đến các phòng thí nghiệm. Sản xuất mẫu chuẩn là công việc tốn nhiều thời gian, công sức nên mẫu chuẩn sản xuất phải có hạn dùng lâu dài (ít nhất 10 năm). Phải sản xuất với số lƣợng đủ lớn để phục vụ cho sử dụng cũng nhƣ nghiên cứu trong nhiều năm.[8]. Sự khác biệt lớn nhất giữa mẫu chuẩn Quốc tế với mẫu chuẩn Quốc gia là: Với mẫu chuẩn Quốc tế cần có sự hợp tác giữa nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới trong việc sản xuất cũng nhƣ trong kiểm định chất lƣợng. Còn với mẫu chuẩn Quốc gia thì có thể chấp nhận việc hợp tác ở phạm vi trong một Quốc gia.[8]. 1.3.4 Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn quốc tế Vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ nhất sản xuất năm 1955 ở dạng hấp phụ với gel nhôm hydroxit, đạt 132 IU/ống. Năm 1978, Vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ hai đƣợc sản xuất bởi Viện SSI dƣới dạng ống đông khô. Mỗi ống chứa 100 Lf giải độc tố, 1 mg Al+++, 26mg Haemacel khô, đạt 132 IU/ống. Cả hai mẫu chuẩn này đều đƣợc xác định công hiệu bằng phƣơng pháp thử thách trên chuột lang. Sau đó, Yenny và cộng sự đã sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn ở dạng nƣớc và xác định công hiệu trên tế bào Vero thay thế cho phƣơng pháp thử thách trên chuột lang. Mẫu chuẩn này đạt 173IU/ml. Tuy nhiên mẫu này sau đó giảm công hiệu khá nhanh nên không đƣợc sử dụng làm mẫu chuẩn Quốc tế [10]. Mẫu chuẩn lần thứ ba do Sanofi (Pháp) sản xuất năm 1999 với công thức : 14 70 Lf giải độc tố bạch hầu, 1 mg Al+++, 10 mg trehalose trên một ống, đạt công hiệu 160 IU/ống. Mẫu chuẩn này đƣợc mã hóa 98/560.[8]. Vắc xin mẫu chuẩn bạch hầu Quốc tế lần thứ tƣ (4th WHO International Standard for Diphtheria Toxoid, Adsorbed) đƣợc tuyển chọn từ hai vắc xin dự tuyển do công ty Sanofi Pasteur (Pháp) và công ty Biken (Nhật Bản) sản xuất.Mẫu chuẩn này đƣợc kiểm tra các chỉ tiêu nhƣ: Cảm quan, độ ẩm tồn dƣ, độ vô trùng, chân không, trọng lƣợng khô, công hiệu. Riêng với thử nghiệm công hiệu, NIBSC đã tiến hành hợp tác với 30 phòng thí nghiệm của 20 quốc gia trên thế giới kiểm tra. Kết quả vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển của Biken với mã số 07/216, công hiệu đạt 213 IU/ống (theo phƣơng pháp thử thách trên chuột lang) đã đƣợc lựa chọn. Năm 2014, WHO đã công bố đây là giá trị công hiệu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp thử thách trên chuột lang và mẫu chuẩn Quốc gia khi nối chuẩn phải sử dụng phƣơng pháp này. Mẫu chuẩn này hiện chƣa có đơn vị Quốc tế trên phƣơng pháp miễn dịch ở chuột nhắt[8]. Đây là khó khăn rất lớn cho các Quốc gia khi cần chuẩn định mẫu chuẩn Quốc gia vì phƣơng pháp thử thách trên chuột lang đòi hỏi lƣợng chuột lang khá lớn (ít nhất 72 chuột/ lần). Không phải phòng thí nghiệm nào cũng có thể có đƣợc lƣợng chuột lang nhiều nhƣ vậy trong một thời điểm. Hơn nữa chuột lang giá cũng rất đắt khiến giá thành của phƣơng pháp này rất cao. 1.3.5 Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia (Việt Nam) là loại chuẩn chính thứ cấp (Secondary reference standards), đƣợc sử dụng làm chất chuẩn chính trong thử nghiệm công hiệu bạch hầu tại NICVB và tại các nhà sản xuất trong nƣớc. Năm 1991, viện Vắc xin (IVAC) đã phối hợp cùng Cencobi tiến hành sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia. Vắc xin mẫu chuẩn khi đó đƣợc sản xuất dƣới dạng lỏng, cho công hiệu trên 300 IU/ml nhƣng đã bị giảm công hiệu rất nhanh. Chỉ sau ba năm công hiệu đã giảm gần nhƣ về không. Năm 1999, GS.Nguyễn Thị Kê cùng cộng sự đã sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia theo công thức: Trong 1 ml vắc xin mẫu chuẩn bạch hầu: 15 - 60 Lf giải độc tố bạch hầu. - AlPO4 6mg - NaCl: 0.09 g - Merthiolate: 100 µg. - Dung dịch Dextran 3% (cho dạng đông khô). Kết quả: Mẫu chuẩn đông khô mã số RD4 đạt công hiệu 172 IU/ống (đơn vị trên chuột nhắt) và 340 IU/ống (đơn vị trên chuột lang). Mẫu chuẩn dạng nƣớc mã số RD5 đạt công hiệu 173 IU/ml [3]. Tuy nhiên, mẫu chuẩn dạng nƣớc cũng giảm công hiệu rất nhanh sau đó, còn dƣới 30 IU/ml và không đƣợc sử dụng. Mẫu chuẩn đông khô có công hiệu chƣa cao nên cần dùng tới bốn ống mẫu chuẩn cho một lần kiểm định dẫn đến kết quả chƣa đầy hai năm đã hết. Năm 2006, NICVB phối hợp với IVAC tiếp tục sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia theo công thức: Trong 1 ml vắc xin mẫu chuẩn bạch hầu: - 50 Lf giải độc tố bạch hầu. - AlPO4: 3 mg - NaCl: 9 mg - Merthiolate: 100 µg. Mẫu chuẩn này đạt công hiệu rất thấp, chỉ 35,3 IU/ống nên không đạt yêu cầu sử dụng làm mẫu chuẩn. Đứng trƣớc nhu cầu cần có mẫu chuẩn để phục vụ kiểm định thƣờng quy mẫu vắc xin bạch hầu trong nƣớc và ngoài nƣớc của NICVB, của nhà sản xuất, chúng tôi phối hợp với IVAC tiếp tục sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia. Mục tiêu sản xuất mẫu chuẩn bạch hầu có công hiệu cao (trên 500 IU/ml) để chỉ dùng một ống mẫu chuẩn cho một lần kiểm định. Mẫu chuẩn này phải có sự ổn định công hiệu đáp ứng nhu cầu sử dụng trong thời gian dài (ít nhất năm năm) và có đáp ứng trên chuột nhắt để có thể chuyển đổi sang đơn vị chuột nhắt. 16 Vắc xin bạch hầu là vắc xin giải độc tố nên giá trị công hiệu thu đƣợc phụ thuộcvào hàm lƣợng kháng nguyên và tá chất đƣa vào. Thành phần ho gà trong vắc xin DTP phối hợp giúp tăng công hiệu của bạch hầu và uốn ván.Do đó, vi khuẩn ho gà đƣợc thêm vào mẫu chuẩn RD6 nhƣ là một tá chất và tăng hoạt tính so với các nghiên cứu trƣớc đó. Ngoài ra, hàm lƣợng kháng nguyên bạch hầu trong mẫu RD6 cũng tăng lên là 90 Lf/ml. Số lƣợng mẫu sản xuất là 2370 ống vắc xin bạch hầu đông khô.Nhiệt độ bảo quản: -200C. 1.4 YÊU CẦU ĐỐI VỚI VIỆC CHUẨN ĐỊNH MẪU CHUẨN QUỐC GIA Việc kiểm định thực hiện bắt đầu từ nguyên liệu đầu nhƣ: chủng gốc, chủng sản xuất, nƣớc, hóa chất pha môi trƣờng, lọ, nắp nhãn Trong quá trình sản xuất việc giám sát và kiểm định chất lƣợng phải thực hiện thƣờng xuyên, theo đúng SOP. Trong phòng thí nghiệm, việc kiểm định chất lƣợng vắc xin này dựa trên các tiêu chí chính sau đây:  Cảm quan:  Kiểm tra chân không  Tính đồng nhất trọng lƣợng khô  Vô khuẩn  Nhận dạng  Độ ẩm tồn dƣ  Công hiệu bạch hầu. Nghiên cứu trƣớc đây của GS. Kê và cộng sự trong việc chuẩn định Mẫu chuẩn bạch hầu Quốc gia RD4 có kiểm tra các thử nghiệm trên, nhƣng chƣa có kết quả của các phòng thí nghiệm khác nhau nên trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hai phòng thí nghiệm là khoa KĐVX Vi khuẩn (NICVB) và phòng QC(IVAC) làm các thử nghiệm song song. Điều này cũng phù hợp với khuyến cáo mới nhất của WHO là có sử dụng kết quả của các phòng thí nghiệm khác nhau trong việc chuẩn định Mẫu chuẩn Quốc gia [3]. 17 1.5 ĐỘNG VẬT DÙNG TRONG KIỂM ĐỊNH VẮC XIN BẠCH HẦU Chuột nhắt và chuột lang là loài động vật đƣợc dùng phổ biến nhất trong nghiên cứu y sinh học trong đó có sản xuất và kiểm định vắc xin. Đặc biệt, trong kiểm định chất lƣợng vắc xin DTP hai loài này đƣợc sử dụng trong các thử nghiệm quan trọng là an toàn, công hiệu.Trong phép thử xác định công hiệu của vắc xin, phƣơng pháp thử thách trên động vật thí nghiệm thƣờng cho kết quả chính xác nhất. Phƣơng pháp thử thách trên động vật chính là gây miễn dịch cho động vật bằng kháng nguyên, sử dụng độc tố gây bệnh của vi sinh vật gây bệnh cho động vật đã miễn dịch. Xem đáp ứng của động vật theo tỷ lệ sống/ chết hoặc mức độ liệt để đánh giá. Chuột lang có nguồn gốc từ núi Andes ở Nam Mỹ, từ Colombia và Venezuela xuống Brazil và Argentina. Lần đầu tiên chuột lang đƣợc sử dụng nhƣ động vật thí nghiệm là vào đầu thế kỷ 19. Chuột lang thuộc bộ Rodentia, tiểu bộ Hystricomorpha, họ Caviidae. Chuột lang có ba loại lông ngắn: English, lông xù xì với các đốm hình hồng: Abyssian và lông dài: Peruvian. Chuột lang lông ngắn hầu hết đƣợc dùng trong nghiên cứu y sinh học và chiếm 2-3% tất cả các động vật thí nghiệm đã sử dụng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chuột English, do IVAC cung cấp. Chuột lang là loài động vật phổ biến thứ tƣ (sau chuột nhắt, chuột Na Uy và thỏ). Mặc dù theo xu hƣớng chung là giảm số lƣợng động vật trong nghiên cứu trong những năm gần đây nhƣng chuột lang vẫn là một động vật thí nghiệm quan trọng vì những đặc điểm độc đáo không tìm thấy ở các loài gặm nhấm khác. Chuột lang là loài động vật thí nghiệm gặm nhấm ít hung hãn nhất, có thể vì lịch sử thuần hóa lâu đời của nó. Nên các nghiên cứu sinh hóa, miễn dịch học, sinh lý học và dƣợc học thƣờng đƣợc tiến hành trên đối tƣợng này. Chúng đƣợc sử dụng chủ yếu cho sản xuất và kiểm soát huyết thanh, kiểm định chất lƣợng vắc xin và các chế phẩm sinh học. Chuột lang dễ gây mẫn cảm, bằng cách tiêm nhắc lại trong một phản ứng quá mẫn. Điều này đƣợc thực hiện để nghiên cứu phản ứng quá mẫn chậm nhƣ đáp ứng miễn dịch tƣơng tự nhƣ đáp ứng miễn dịch ở ngƣời. Ngoài ra, chuột lang là một vật chủ phù hợp cho một số bệnh do các vi khuẩn gây ra, chúng rất nhạy cảm với một số các bệnh lây nhiễm nhƣ lao, bạch hầuĐặc biệt chuột 18 lang rất nhạy cảm với độc tố bạch hầu. Đây là đặc tính quan trọng giúp cho chuột lang là loài động vật đƣợc nhiều phòng thí nghiệm có uy tín ƣu tiên sử dụng cho thử nghiệm xác định công hiệu bạch hầu vì phƣơng pháp thử thách trên chuột lang cho kết quả chính xác nhất. Tuy nhiên, chuột lang chỉ đẻ 2-5 con trong một lần sinh và một năm đẻ khoảng 3,7 lần, lại có trọng lƣợng lớn (chuột trƣởng thành khoảng 800g – 1200g)nên so với chuột nhắt thì chuột lang có giá thành đắt hơn rất nhiều và cũng cần diện tích lớn hơn trong việc nuôi dƣỡng cũng nhƣ khi làm thí nghiệm. Đây cũng là khó khăn rất lớn cho các nƣớc đang phát triển khi làm thử nghiệm công hiêu bạch hầu trên chuột lang, vì số lƣợng chuột này cho một lần làm thử nghiệm ít nhất là 72 chuột. Không phải phòng thí nghiệm nào cũng có khả năng có và nuôi đƣợc số lƣợng lớn chuột này cho một thử nghiệm. Ở Việt Nam hiện chỉ có Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) là có thể cung cấp đƣợc số lƣợng chuột lang đáp ứng đƣợc nhu cầu trên [13]. Chuột nhắt là loài động vật đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu y sinh. Nó thuộc bộ Rodentia, họ Muridae, loài Mus[8]. Ít nhất khoảng 1000 chủng chuột nhắt khác nhau đƣợc sử dụng trong phòng thí nghiệm. Chuột nhắt có hai loại chuột thuần chủng (in-bred) : chuột BALBc và không thuần chủng (out-bred). Dù sử dụng chuột thuần chủng cho kết quả đồng nhất hơn, tuy nhiên đa dạng di truyền của chúng có giới hạn, và đôi khi chúng lại nhạy cảm với ảnh hƣởng của môi trƣờng hơn. Bên cạnh đó, phép ngoại suy với con ngƣời cũng dễ hơn nếu thử nghiệm sử dụng chuột không thuần chủng. Thêm vào đó, chuột thuần chủng có giá thành đắt hơn chuột không thuần chủng khá nhiều. Nên hầu hết chủng chuột sử dụng cho kiểm định vắc xin là chuột không thuần chủng [33]. Trong đó chuột Swiss là loài đƣợc sử dụng tƣơng đối rộng rãi. Chuột Swiss trắng (Lynch 1969) có nguồn gốc từ một nhóm chuột nhỏ (02 đực và 07 cái)đƣợc đƣa từ Trung tâm Anticancéreux Romand de Lausance (Switzerland) đến Viện Rockerfeller, New York vào năm 1962. Sau đó Viện này đã nhân đàn và cung cấp rộng rãi ra toàn thế giới [8, 11]. NICVB và IVAC cũng đang duy trì chuột này phục vụ cho làm thí nghiệm tại Viện. Tuy nhiên, chuột nhắt lại không nhạy cảm với độc tố bạch hầu nên thử nghiệm công hiệu bạch h